生物素酰化蛋白质分子量标准品

生物素酰化蛋白质分子量标准品ＳｈａｎｎｏｎＭ．Ｂｅａｔｔｙ著／李络红译／申宗侯校蛋白质印迹于硝酸纤维素膜已被广泛用于探测感兴趣的异质混合蛋白质,用聚丙烯酰凝胶电泳分离这些蛋白质所测定的一个参数就是分子量。预先染色的分子量标准品对于蛋白质电泳分离和转移...     

半干式蛋白质电泳印迹的影响因素及条件优化

采用蛋白质分子量标准物和纯化的重组蛋白质进行半干式蛋白质印迹,探讨半干式电泳印迹的多种因素对印迹效果的影响。结果表明:在不同电转移条件下,均存在不同程度的蛋白质透膜转移现象,当电流强度恒定时,电转移时间过长和上样量过大是造成实验中透膜转移而丢失的主要原因,可根据待测蛋白质的分子量和表达丰度确定恰当的电转移时间和上样量。     

抗癌胚抗原单链抗体基因与核心链霉亲和素基因融合在昆虫细胞中的表达

将抗癌胚抗原单链抗体基因与核心链霉亲和素基因融合插入昆虫杆状病毒供体质粒 pFastBacHTa中 ,在粉纹夜蛾Tn 5B1 4细胞中进行表达。SDS PAGE分析结果表明 ,表达产物分子量为 4 1kD左右 ,Western印迹分析结果表明 ,以HRP标记的生物素进行蛋白质印迹在 4 1kD处可见表达条带 ,表明融合蛋白能特异性的与生物素结合 ,放射免疫分析表明重组杆状病毒表达产生的ScFv CS蛋白能特异性结合癌胚抗原     

成熟前后蟾蜍卵母细胞质膜、透明带和卵黄膜蛋白质组份的比较分析

手工分离激素体外诱发成熟的中华大蟾蜍长足卵母细胞质膜和卵黄膜,以及未经激素处理的卵母细胞质膜和透明带,通过SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳,进行膜蛋白质组份比较分析。考马斯蓝染色显示:未经激素处理的卵母细胞,其质膜主要有六条蛋白带子,分子量范围为25K—250K道尔顿;透明带有四条主要蛋白质带,分子量范围为43K—250K道尔顿。激素作用后的成熟卵球质膜蛋白质组份与处理前相同;由透明带衍生形成的卵黄膜,显著增加一种分子量为20K道尔顿的蛋白质组份。卵母细胞膜表面的碘(~(125)I)化反应和电泳分析结果清楚地表明,不论透明带还是质膜,它们的不同分子量蛋白质带都能强烈地标记上~(125)I;去膜卵球部分的蛋白质成份,没有测出任何~(125)I标记峰。证明以上分析的蛋白质组份确是存在于膜的表面。     

犬瘟热病毒细胞膜受体的鉴定

犬瘟热病毒（ＣＤＶ）敏感细胞Ｖｅｒｏ用ＳＤＳ或ＲＩＰＡ溶解缓冲液溶解,利用病毒铺覆蛋白印迹技术（ＶＯＰＢＡ）鉴定犬瘟热病毒疫苗株（ＣＤＶ－ｏｎｄｅｓｔｅｐｏｏｒｔ）的细胞受体。结果发现,在Ｖｅｒｏ细胞上有两组ＣＤＶ结合蛋白质,即高分子量组蛋白质（１２７ｋＤ、１２０ｋＤ、１１０ｋＤ）与低分子量组蛋白质（２７ｋＤ和３０ｋＤ）。这些ＣＤＶ结合蛋白组分的性质及在ＣＤＶ致病中的作用有等进一步研究。     

抗癌胚抗原单链抗体基因与核心链霉亲和素基因融 …

将抗癌胚抗原单链抗体基因与核心链霉亲和素基因融合插入昆虫杆状病毒供体质粒ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ中,在粉纹夜蛾Ｔｎ－５Ｂ１－４细胞中进行表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明,表达产物分子量为４１ｋＤ左右,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析结果表明,以ＨＲＰ标记的生物素进行蛋白质印迹在４１ｋＤ处可见表达条带,表明融合蛋白能特异性的与生物素结合,放射免疫分析表明重组杆状病毒表达产生的ＳｃＦｖ－ＣＳ蛋白能特异性结合癌胚     

电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响

探讨了电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响.采用抗凋亡抑制蛋白-Survivin的抗体,对细胞裂解液进行蛋白质印迹.与常规操作方法不同之处是：在电转移的凝胶“三明治”中,重叠放置两张硝酸纤维素膜.电转移后,对两张膜同时进行免疫印迹.在特定的转移条件下,两张膜的免疫印迹都出现了Survivin蛋白的特异印迹带,证实了电转移中存在着蛋白质的透膜现象.转移时间、电流强度和蛋白质的分子质量,都是影响蛋白质透膜的相关因素.电转移中蛋白质的透膜,可以产生“印迹复制失真”的效应,从而最终影响蛋白质印迹定性和定量的结果.所得实验结果和结论,揭示了蛋白质印迹技术方法学中一个需要加以充分关注的问题,对于科学掌握和应用该技术具有积极作用.     

基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法

目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。     

抗癌胚抗原嵌合重链与核心链霉亲和素基因的融合及表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单克隆抗体的重链可变区与人的恒定区（Ｃγ３） 连接, 制备抗癌胚抗原嵌合重链用于放免治疗及其他导向治疗, 可减少人抗鼠抗体反应（ＨＡＭＡ） 。为纯化及核素标记抗体, 将嵌合重链基因与核心链霉亲和素基因融合。融合基因在大肠杆菌得到高效表达, 表达量占菌体总蛋白的２４ ％ 。ＳＤＳＰＡＧＥ 和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为７０ ｋＤ, 与其基因编码蛋白质的理论推算值相符。以ＨＲＰ标记的生物素作为抗体进行蛋白质印迹, 在７０ ｋＤ 处可见表达条带, 表明融合蛋白能特异性地与生物素结合, 使嵌合重链经生物素柱进行廉价纯化成为可能。表达产物在胞内主要以不溶性的包含体存在, 经变性和复性处理后, ＲＩＡ 表明表达产物具有结合其特异性抗原ＣＥＡ的能力。     

用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选的Western印迹-SELEX筛选技术的建立

目的:建立一种基于Western印迹的指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术,用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。方法:将目的蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上,用生物素标记的ss DNA与PVDF膜上的蛋白共同孵育,获得能与靶蛋白特异结合的适配体,最后通过生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统、基因克隆测序、MEME在线软件和RNAstructure软件分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了能特异识别靶蛋白而不识别无关蛋白的适配体,原库Gp45则与上述蛋白均没有结合。结论:建立了Western印迹-SELEX技术,可用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。     

应用亲和免疫印迹技术检测血清微量单克隆Ig

介绍了一种简便、快速、灵敏的检测血清微量 mIg 的新方法——亲和印迹法.首先将特异性 Ab 结合到 NC 膜上,以薄层琼脂糖凝胶区带电泳把蛋白分离,蛋白经毛细印迹到 NC-Ab 膜上与其抗体亲和,再用酶标抗体探测被印迹之蛋白.2h 内可显示出 mIg 的特征.不需任何昂贵特殊设备.其敏感度大约是自然印迹法的10倍,是 IF银染色法的100倍.     

低浓度多聚甲醛固定对蛋白免疫印迹技术的改良

蛋白质免疫印迹（protein immunoblot,或Western blot）是一种广泛应用于检测细胞或组织蛋白质表达及蛋白质翻译后修饰的方法．前期的研究发现,使用低浓度（0.4%）多聚甲醛在蛋白质免疫印迹封闭环节前做膜固定,有助于提高蛋白质的检测效果．本文通过设置多聚甲醛的不同浓度和固定时间,进一步探索其在蛋白质免疫印迹技术中的应用．结果发现,低浓度（≤0.4%）多聚甲醛处理30 min,能明显提升蛋白质的检测效率．通过检测不同大小蛋白质的固定效果发现,大分子量的蛋白质使用多聚甲醛固定效果不明显,中等分子量和小分子量的蛋白质的固定效果较佳．综上研究表明,在中等或小分子量的蛋白质免疫印迹检测中,封闭环节前加入低浓度多聚甲醛固定,可以提高蛋白质的检测效果．     

大鼠SUMO特异性蛋白酶1催化区蛋白制备及功能鉴定*

目的: 制备大鼠SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific protease,SENP1)催化结构域(SENP1C)蛋白,并鉴定其酶活性。方法: 分别以大鼠SENP1-pcDNA3.1和EGFP-pcDNA3.1重组体为模板,PCR扩增目的基因,克隆入pGEM-T载体;酶切鉴定后,再亚克隆入原核表达载体pET-28a;阳性重组体导入原核表达细胞BL-21,异丙基硫半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达;SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色鉴定蛋白质的表达。Ni-NTA吸附纯化蛋白质并透析处理,SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色鉴定蛋白质的纯度;1 μmol/L及5 μmol/L Tat-EGFP分别孵育HT22细胞不同时间,荧光显微镜下观察细胞转染情况。采用5 μmol/L Tat-SENP1C预孵育HT22细胞10 h,免疫印迹检测整体蛋白质的SUMO化水平;用5 μmol/L Tat-SENP1C预孵育HT22细胞或过表达Myc-Akt1和HA-SUMO1的HT22细胞10 h后,免疫沉淀和免疫印迹检测内源性和外源性Akt1与SUMO1的结合(SUMO化)。结果: Tat-SENP1C-pET-28a和Tat-EGFP-pET-28a重组原核表达载体成功构建,IPTG可以诱导蛋白质高表达;采用Ni-NTA纯化和透析可获得较高纯度的蛋白质;5 μmol/L Tat-EGFP孵育HT22 细胞10 h后,蛋白质穿膜效率较高;Tat-SENP1C重组蛋白可以显著降低HT22细胞中整体蛋白质的SUMO化以及内源性和外源性Akt1 SUMO化。结论: Tat-SENP1C-pET-28a和Tat-EGFP-pET-28a重组原核表达载体构建成功,且被IPTG诱导后可高效表达蛋白质;纯化的Tat-SENP1C蛋白具有较强的穿膜能力及酶活性。     

乳杆菌表面粘附蛋白的提取、鉴定及粘附特异性的初步研究

以从健康牙鲆肠道中分离筛选的乳杆菌L15(Lactobacillussp.L15)和嗜酸乳杆菌ATCC4356为实验材料,应用5mol/L LiCl提取其表面蛋白,利用蛋白印迹法鉴定出在L15表面蛋白中分子量为61.8kDa和54.6kDa的蛋白质分别参与对牙鲆和鲤鱼粘液的粘附过程,为新发现的粘附蛋白种类,将其命名为MAPPpo1和MAPPcc。ATCC4356中分子量分别为43.0kDa和63.3kDa的两个表面蛋白参与对牙鲆粘液的粘附,而分子量为43.0kDa的蛋白参与对鲤鱼粘液的粘附。同时,蛋白质印迹法显示,L15和ATCC4356在牙鲆和鲤鱼肠粘液中均具有相同的粘附受体,在牙鲆肠粘液中是分子量为29.7kDa和30.3kDa的两种蛋白质,而在鲤鱼肠粘液中只有分子量为26.2kDa的蛋白作为受体参与L15和ATCC4356的粘附过程。结果显示,乳杆菌对肠粘液的粘附不但具有菌种的特异性,而且也有宿主的特异性。     

植物蛋白质S-亚硝基化修饰的检测与分析

S-亚硝基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式, 是指一氧化氮(NO)基团共价连接至靶蛋白特定半胱氨酸残基的自由巯基, 从而形成S-亚硝基硫醇(SNO)的过程。S-亚硝基化修饰广泛存在于各有机体中, 通过改变蛋白质生化活性、稳定性、亚细胞定位以及蛋白质-蛋白质相互作用等机制而调控不同的生物学过程或信号通路。在蛋白质S-亚硝基化检测分析方法中, 最为广泛使用的是生物素转化法(biotin switch assay), 其基本原理是首先封闭未被修饰的自由巯基, 进而将被修饰的SNO基团特异地还原为自由巯基并使用生物素将其特异标记。被生物素标记的半胱氨酸残基(即被修饰位点)可进一步通过蛋白质免疫印迹和/或质谱等方法进行检测分析。该文详细描述了植物蛋白质样品的体内和体外生物素转化法的实验流程, 并对实验过程中的注意事项进行了讨论。     

植物蛋白质S-亚硝基化修饰的检测与分析

S-亚硝基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式, 是指一氧化氮(NO)基团共价连接至靶蛋白特定半胱氨酸残基的自由巯基, 从而形成S-亚硝基硫醇(SNO)的过程。S-亚硝基化修饰广泛存在于各有机体中, 通过改变蛋白质生化活性、稳定性、亚细胞定位以及蛋白质-蛋白质相互作用等机制而调控不同的生物学过程或信号通路。在蛋白质S-亚硝基化检测分析方法中, 最为广泛使用的是生物素转化法(biotin switch assay), 其基本原理是首先封闭未被修饰的自由巯基, 进而将被修饰的SNO基团特异地还原为自由巯基并使用生物素将其特异标记。被生物素标记的半胱氨酸残基(即被修饰位点)可进一步通过蛋白质免疫印迹和/或质谱等方法进行检测分析。该文详细描述了植物蛋白质样品的体内和体外生物素转化法的实验流程, 并对实验过程中的注意事项进行了讨论。     

利用原核表达系统一步法制备生物素标记蛋白质

传统的蛋白质生物素标记多采用体外化学修饰法,涉及生物素和蛋白质的活化、透析和纯化等多种处理,该方法步骤繁琐,且对目的蛋白的损失较大。本实验利用原核共表达质粒pCDFDuet-1,将含有6个组氨酸标签的人己糖苷酶D(hexosaminidase D,HexD)的cDNA与生物素受体多肽(biotin acceptor peptide,BAP)DNA进行PCR拼接,连入pCDFDuet-1的多克隆位点1(multiple cloning site1,MCS1);将以大肠杆菌Trans5α基因组为模板克隆得到的生物素连接酶(biotin ligase,BirA)基因连入MCS2,构建重组质粒pCDFDuet-hexD-BAP-birA。初步验证后将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,利用0.1 mmol/L的IPTG和80μmol/L的生物素进行诱导表达,采用Ni-NTA亲和层析和超滤对HexD进行纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小(60 kDa)和纯度(90%以上)。以anti-HexD和链霉亲和素-HRP为抗体,Western blot检测发现,HexD-BAP表达正确,且被生物素标记;同时以4-MU-O-GalNAc为荧光底物,检测到生物素化标记HexD的糖苷酶活性为3.6 nmol/(min·μg),与未标记HexD的活性(3.06 nmol/(min·μg))相当。结果表明,可以利用BirA及其受体多肽,通过共表达质粒pCDFDuet-1,一步转化、表达和纯化,在大肠杆菌中进行外源蛋白的表达和生物素标记,且不改变目的蛋白的生物活性,可应用于免疫标记、互作蛋白的捕获等生物学研究。     

细胞印迹法

<正> 免疫印迹法即利用免疫学检测混合物中蛋白有效成分的一种技术:经凝胶电泳分离后的蛋白有选择地印迹到NC纸上。该技术已被广泛地应用于现代生物学研究中。相反,细胞印迹法即检测特异蛋白质束缚于专一细胞上的一种方法:经电泳分离后印迹到NC纸上。该法仅在必要时才应用。本文就两种细胞印迹技术及有关操作方法作了介绍,并就这些技术的可能意义进行了讨论。     

蚕豆染色体鞘的免疫荧光显示和其抗原的分析

本文应用本实验室发现的着染HeLa细胞染色体鞘的一例红斑狼疮病人抗血清对分离出的蚕豆染色体及核和蚕豆根尖生长点压片进行了免疫荧光染色,从两种不同制片方法得到的染色体上均染出了清晰的染色体鞘免疫荧光。之后又用此血清对蚕豆三天龄幼苗中(去除子叶、种皮)提取出的总蛋白进行Western印迹分析,获得的带型显示分子量为41K,39K,18K,17K的蛋白质可与抗血清中的抗体特异性结合,另有分子量为87K,38K,35K,34K,32K的蛋白质也可能具有与抗体特异性结合的能力。     

生物素化FOXM1真核表达体系的构建及鉴定

建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir A真核表达载体pcDNA3.1-Bir A,将pcDNA3.1-AP-FOXM1和pcDNA3.1-BirA共转染人胚肾293T(HEK293T)细胞,用银染及Western印迹检测细胞裂解液,确定相关蛋白表达;用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的FOXM1,并考察FOXM1的互作蛋白是否可以同时被洗脱下来。研究发现构建的生物素标签真核表达体系能有效表达生物素化的目标蛋白FOXM1;该蛋白在Western印迹、pull-down等实验中可实现无需抗体的一步法应用;该体系可用于FOXM1互作蛋白的鉴定和功能分析。结果表明建立了基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达体系,为FOXM1互作蛋白与功能的深入研究奠定了技术基础。