葎草花粉变应原的纯化及免疫特性分析

目的 纯化葎草花粉变应原并分析其免疫学活性.方法 粗制葎草花粉提取液经Sephadex G-75Sephacryl S-200HR层析柱纯化,分段收集各组份.SDS-PAGE检测各组分蛋白相对分子质量,ELISA抑制实验及免疫印迹实验分析各组分蛋白质对特异性IgG和IgE的抑制率及与患者血清的反应率.结果 浓缩粗制葎草花粉提取液经SephadexG-75层析柱纯化,得到两个峰,第一峰富含蛋白质,第二峰含有大量色素,蛋白含量甚微,弃之;收集第一峰及其谷段洗脱液(P液),经Sephacryl S-200HR层析柱纯化,分离出4个组份,即第一峰(P1)、谷段(V)、第二峰(P2)和末段(E).电泳结果显示纯化后的蓓草花粉含20多种蛋白质条带,相对分子质量区带为5.0×103～97.4×103,P1段主要是相对分子质量为43×103～97.4×103的蛋白质,P2段和V段主要是相对分子质量为5.0X103～43×103的蛋白质,E段主要是相对分子质量为5.0×103以下的蛋白质;ELISA抑制实验结果显示P1、V、P2、E对sIgG抑制率分别为68%、70%、95%,5%,对sIgE抑制率分别为25%、64%、71%、11%;免疫印迹实验结果显示P1、V、P2、E与患者血清sIgG的反应率分别为65.63%、78.13%、87.50%、6.25%,与患者血清sIgE的反应率分别为25.00%、71.88%、84.38%、15.63%.结论 葎草花粉舍20多种蛋白质成分,相对分子质量在5×103～43×103之间的蛋白质变应原性和免疫原性均较强,为主要变应原;相对分子质量在43×103～94.7×103的蛋白质免疫原性强而变应原性弱,为次要变应原.     

纯化花粉变应原免疫治疗的疗效观察

目的:观察纯化花粉(黄蒿、葎草、藜草花粉)变应原特异性免疫治疗(SIT)的疗效.方法:采取凝胶过滤方法分别提纯上述花粉变应原.采取随机、对照方法将102例确诊为季节性黄蒿、葎草、藜草花粉过敏性哮喘患者分为观察组(A组)及对照组(B组),应用纯化花粉变应原(PPA)及粗花粉变应原(CPA)分别对两组患者进行季节前SIT,疗程3 mo.临床疗效判断标准为显效、好转及无效.临床不良反应观察包括局部或全身皮疹、哮喘加重等.实验观察指标为两组SIT前后的皮肤试验(ID)风团直径、特异性IgE(sIgE)、A值均值.结果进行组内和组间比较.结果:A组SIT总有效率90%(47/52),B组78%(39/50),前者明显高于后者(P<0.05);A组仅3例轻度副反应,B组有13例(26%)出现副反应;A组及B组SIT后ID风团直径、sIgE, A值均值都较SIT前明显下降(P<0.01);A组SIT后上述指标下降程度较B组更明显(P<0.05).结论:PPA及CPA的SIT疗效均较满意,但用PPA进行SIT的安全性和疗效更好.     

藜草花粉变应原免疫活性分析

目的:分析藜草花粉变应原成分及其变应原性、免疫原性.方法:用Sephacryl S-200HR葡聚糖凝胶层析法分离、纯化藜草花粉变应原,通过十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电脉法(SDS-PAGE)测定变应原各组分的分子质量;应用免疫印迹法检测各组分蛋白质与藜草花粉过敏性哮喘患者血清中sIgG和sIgE的反应率.结果:藜草花粉经电泳后得到12条蛋白质区带,分子质量依次为92,63.1,61,52,45,43,39.7,38.9,34,31.6,28.4和18.5～12 ku;免疫印迹可见4条sIgE反应带,蛋白分子质量依次为92,34,31.6和18.5～12 ku;与患者血清反应率分别是70%,50%,80%和90%;与血清sIgG结合的反应带有8条,蛋白分子质量为92,61,52,45,43,39.7,31.6和18.5～12 ku;与患者血清反应率分别是80%,40%,10%,20%,80%,10%,10%和100%.结论:藜草花粉变应原主要含12种蛋白质成分,其中分子质量为18.5～12 ku和92 ku的蛋白质变应原活性及免疫原活性均很强,是主要变应原成分;分子质量在34和31.6 ku的蛋白质有较强的变应原性而无或仅有较弱的免疫原性;而分子质量为43,61,45,52和39.7 ku的蛋白质具有一定的免疫原性而无变应原性.     

杨树花粉变应原的提取及纯化

本文通过对杨树花粉变应原的纯化过程,作为治疗花粉症的各种花粉变应原的纯化方法推行探索。杨树花粉经过脱脂、提取、分离和葡聚糖G—25柱层析纯化,经紫外吸收光谱进行分组,冷冻干燥贮存,各组分经过免疫双扩散和临床33例杨树花粉粗浸出液皮内试验为阳性的病人对照证明有活性的组分,然后进行聚丙烯酰胺电泳证实为一纯品,同时以正常人血清对照测得分子量约为6.7万左右。     

银杏花粉的部分纯化和变应原性、免疫原性分析

作者采用层析法对银杏花粉进行部分纯化。将各组分对40例变应性鼻炎或/和哮喘患者进行皮试,结合ELISA抑制试验测试其对特异性IgE和IgG的抑制率,阐明各组分具有不同的变应原活性和免疫原活性。为临床应用提出了初步意见。     

轮状病毒培养纯化及重组子代分析

人轮状病毒Wa和Hu7株细胞培养条件中,胰蛋白酶处理和旋转培养,在病毒增殖和细胞病变生成过程中起关键作用。通过对一株人轮状病毒FH4232株与猴轮状病毒SA11株的混合感染株的体外培养和空斑纯化,发现子代克隆中有2株FH4232与SA11株生成的重组子代。重组子代病毒株的第5、11条泳带来自亲代FH42321株,其余多条则来自亲代SA11株。体外轮状病毒重组子代的发现对研究其基因重组变异有重要意义,而且为疫苗制备和应用提供有效途径。     

大鼠甲胎蛋白的分离纯化和抗体制备

用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离纯化大鼠羊水中的甲胎蛋白(AFP)具有简便、省时的特点。将微量AFP注入淋巴结内,制备高效价的AFP抗体。比较四种固定液对AFP免疫组织化学染色的影响,示丙酮-甲醛固定液能很好保存AFP的抗原性,具有阳性颗粒强、背景染色淡的优点,故是AFP免疫组织化学的最佳固定液。     

二球悬铃木花粉主要变应原蛋白编码基因克隆的制备

目的:构建含二球悬铃木花粉主要变应原蛋白编码基因的重组质粒。方法:用PCR扩增二球悬铃木花粉主要变应原编码基因的cDNA序列,将扩增的目的片段用双酶切法与质粒pET32a连接,CaCl2法转入工程菌DH5α制备基因克隆。碱裂解法提取质粒DNA,测序鉴定目的片段存在。结果:构建了含二球悬铃木花粉主要变应原编码基因的重组质粒。结论:用天然二球悬铃木花粉可成功地制备含有其主要变应原编码基因的重组质粒,用于变应原蛋白诱导表达。     

梧桐花粉主要变反原的分离纯化

以离子交换和凝胶过滤层析对梧桐花粉变应原进行分离和纯化,采用生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附分析法（BSA-ELISA）测定其抗原活性,得到两个具高活性的单一变应原组分PT13和PT53。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得它们的分子质量分别为20ku和18ku。     

法国梧桐花粉变应原Pla a1基因的克隆与原核表达

目的克隆编码法国梧桐花粉主要变应原(Platanus acerifolia pollen allergen 1)的Pla a1基因,并构建原核表达载体进行表达。方法采用RT-PCR法从法国梧桐花粉总RNA中扩增Pla a1基因全长cDNA以及不含信号肽的编码区,克隆至pMD18-T载体中进行测序。采用SalⅠ SphⅠ双酶切,将不含信号肽的编码区定向亚克隆到pQE-30载体,形成原核表达载体pQE-30-Pla a1E,转化大肠杆菌M15菌株,PCR和酶切图谱鉴定为阳性的克隆子采用IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE电泳检测蛋白表达结果。结果通过RT-PCR从法国梧桐花序总cDNA中扩增出了Pla a1基因的全长cDNA,与已报道序列基本一致,但发现该基因在非编码区存在SNP位点,尤其是在起始密码子ATG之前的Oligo A序列存在长度多态性。本研究还克隆了一条与Pla a1高度同源的新基因Pla a1′的大部分编码区序列。以基因组DNA为模板的对比克隆表明,该基因没有内含子。克隆子菌液PCR和质粒酶切图谱鉴定均表明,pQE-30-Pla a1E构建成功。IPTG诱导的含有pQE-30-Pla a1E的大肠杆菌M15菌液表达的具有6×His标签的PLA A1E蛋白,经SDS-PAGE电泳,显示了一条约16kd的条带。结论发现了法国梧桐花粉主要变应原Pla a1基因的多态性位点,克隆了与其高度同源的另一条新基因Pla a1′的大部分编码区,成功构建了原核表达载体pQE-30-Plaa1E,并在大肠杆菌中获得高效表达,为获得重组纯化Pla a1变应原并用于花粉变应性疾病的诊治奠定了基础。     

重组葎草花粉主要变应原免疫特性研究

目的鉴定重组葎草花粉主要变应原pTSX2的免疫特性,并初步评价其安全性。方法应用Western blotting鉴定pTSX2
的免疫特性;ELISA法检测经pTSX2免疫的小鼠血清sIgE、sIgG水平;pTSX2免疫治疗小鼠哮喘模型后：ELISA法测定小鼠血
清sIgE、sIgG水平;计数小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数及嗜酸性粒细胞（Eos）比值;ELISA法检测小鼠BALF中及
脾组织匀浆中细胞因子（IL-4、IFN-γ）水平;评价小鼠肺组织炎症程度。结果Western blotting结果显示重组表达的pTSX2可与
70%的葎草花粉特异性过敏的变应性哮喘患者血清发生抗原抗体反应;pTSX2免疫正常小鼠后主要诱导产生血清sIgG;pTSX2
免疫治疗小鼠哮喘模型后：血清中sIgE、sIgG的抗体水平分别为（146.74±28.57）和（548.76±11.98）μg/ml,与哮喘模型组的
（603.06±10.00）和（260.32±6.40）μg/ml相比差异有统计学意义（P<0.05）;BALF中细胞总数及Eos百分比与哮喘模型组相比明
显下降（P<0.05）;BALF中IL-4、IFN-γ水平分别为（56.74±28.57）和（49.7±11.98）pg/ml,与哮喘模型组的（89.03±10.00）和
（23.10±6.40）pg/ml相比差异有统计学意义（P<0.05）;脾组织匀浆中IL-4、IFN-γ水平分别为（126.24±37.00）和（1547.72±490.43）
pg/ml,与哮喘模型组的（457.95±70.06）和（720.34±93.96）pg/ml相比差异有统计学意义（P<0.05）;肺组织炎症程度减轻。结论
重组葎草花粉主要变应原pTSX2具有较好的免疫治疗作用,且安全性较高,其机制可能是抑制变应原sIgE抗体、诱导变应原
sIgG抗体产生,降低气道炎症细胞浸润,调节Thl/Ih2平衡。
     

王棕花粉变应原的分析与鉴定

目的对我国南方常见的棕榈科植物王棕花粉(Roystonea regia pollen)变应原蛋白进行分离、分析与鉴定,为标准化变应原疫苗的研制提供基础。方法取常规方法制备的王棕花粉浸出液,采用SDS-PAGE分离王棕花粉蛋白质组分,测定其相对分子量,同时用10例对王棕花粉过敏的患者血清作Western-blot鉴定其变应原及主要变应原成分。结果SDS-PAGE显示王棕花粉有10条可辨蛋白带,其中主要条带有8条,分别为100000、66000、38000、36000、29000、30000、24000、16000和14000Mr,Western-blot结果表明,10例王棕花粉过敏患者血清全部呈阳性反应,有66000、24000、16000和14000Mr共4条致敏条带,其中分子量在16000和14000Mr的蛋白为主要变应原。结论王棕花粉变应原的分析与鉴定为临床王棕花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

中国龙虾过敏原的分离纯化研究

目的:分离、纯化和鉴定中国龙虾的主要过敏原。方法:利用传统的硫酸铵分级沉淀和等电点沉淀方法对过敏原粗提夜进行初分,在蛋白核酸检测仪检测控制下,用DEAE-52离子交换层析柱进行阶段洗脱和Sepha-dex G-100凝胶柱层析,免疫斑点法(Dot-ELISA)确定其免疫活性部分。结果:中国龙虾过敏原蛋白的硫酸铵沉淀范围在35%～60%之间,pH=4.7、4.5时的等电点沉淀蛋白质有明显的过敏原活性;离子交换层析中的具过敏原活性蛋白峰的蛋白条带分子量为15 000、20 700、34 000、60 000和83 200;Sephadex G-100凝胶层析后具过敏原活性蛋白峰SDS-PAGE显示只有34 000分子量的蛋白条带,纯度为91.5%。结论:分离、纯化鉴定出中国龙虾分子量为34 000的主要过敏原,对于过敏原的标准化、提高过敏性疾病诊治水平具有重要的意义。     

粉尘螨Der f2变应原的分离纯化及其特征

目的 用粉尘螨（Dermatophagoides farinae）代谢培养基浸液（Dff）分离纯化粉尘螨2类变应原（Der f2）。方法 Sephadex G-100层析、DEAE离子交换层析、PAGE等方法分离纯化Der f2,并对Der f2作SDS-PAGE测定和热稳定性测定。结果 从Dff分离纯化得到较纯Der f2,经SDS-PAGE测定其相对分子质量为14000,并经100℃加热15min后,仍保留50%～83.3%生物学活性。结论 从Dff中分离纯化的变应原,其物化性质符合Der f2特征。     

蒿属花粉 cDNA文库的构建和初步鉴定

目的构建蒿属花粉cDNA表达文库。方法应用定向克隆技术将相应dscDNA片段插入λExCell/NotI/EcoRI/CIP载体的NotI和EcoRI双酶切位点间,经包装、转染宿主菌,构建成cDNA文库。检测文库库容量和重组效率,并采用PCR方法对插入片段大小进行分析。结果成功构建了一个含有5.6×105个重组子的cDNA表达文库,重组率为100%,插入片段大小平均约1.3kb。结论所建文库容量及插入片段大小适合对蒿属花粉特异性重组变应原的进一步研究。     

变态反应患者过敏原体外检测与分析

目的探讨变态反应性疾病患者外周血清中总IgE和过敏原特异免疫球蛋白E（sIgE）的情况以及它们的相互关系。方法采用德国Mediwiss公司生产过敏原检测系统以免疫印迹法定量检测血清中总IgE和过敏原特异性sIgE抗体。结果272例变态反应性疾病患者在吸入组总IgE阳性检出率86.8%（236/272）,食物组总IgE阳性检出率为26.1%（71/272）;过敏原特异性抗体sIgE阳性检出率为80.5%（219/272）,检出2种和2种以上sIgE阳性率为60.3%（164/272）;189人检测到吸入组过敏原,64人检测到食物组过敏原,36人为吸入组和食物组混合过敏原。吸入组过敏原检出阳性项次共357项,最常见的过敏原为户尘螨,阳性率为44.1%（120/272）,其次为猫毛皮屑、狗毛皮屑组合26.8%（73/272）,蟑螂24.6%（67/272）和树花粉组合15.4%（42/272;,食物组检出阳性项次共74项,主要食物组过敏原阳性检出率依次为蟹、虾9.2%（25/272）、羊肉7.4%（20/272）、腰果3.7%（10/272）、小麦、2.6%（7/272）。对主要致病过敏原特异性sIgE浓度（分级）分析,户尘螨4~6级阳性检出率显著高于其它过敏原（P〈0.01）。结论体外总IgE和过敏原特异免疫球蛋白E（sIgE）检测,可以为临床确认过敏性体质、寻找相应过敏原、为变态反应性疾病的预防、诊断和治疗提供依据。