JNK-c-Jun信号通路下调连接蛋白43的表达引起肾小管上皮细胞转分化

目的 观察c-Jun氨基末端激酶（JNK）-c-Jun通路对连接蛋白43（Cx43）表达的影响及在转化生长因子（TGF）β1诱导的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（TEMT）中的作用。 方法　大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）随机分成3组：对照组、TGF-β1（10 μg/L）组和TGF-β1（10 μg/L）+JNK选择性抑制剂SP600125（50 μmol/L）组。用免疫细胞化学、Western印迹检测JNK、c-Jun、连接蛋白43（Cx43）、上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）和肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达。用RT-PCR检测Cx43的mRNA水平。用激光共聚焦显微镜荧光漂白恢复（FRAP）技术检测NRK-52E细胞间通讯功能。 结果 TGF-β1引起肾小管上皮细胞α-SMA、JNK、c-Jun表达上调（均P < 0.05）,Cx43、E-cadherin表达下调（均P < 0.05）,Cx43的mRNA水平下降（P < 0.05）,细胞间通迅功能下降 （P < 0.05）。JNK抑制剂处理后,上述改变明显减轻。 结论 TGF-β1引起肾小管上皮细胞内JNK表达上调,增加c-Jun活性,从而抑制Cx43的表达和降低细胞间通迅功能,导致TEMT。     

微小病变患者尿蛋白对肾小管上皮细胞的损伤作用及其机制研究

目的探讨尿蛋白对肾小管损伤的途径及加重肾脏病变的相关机制.方法用硫酸铵沉淀法提取肾小球微小病变患者尿液中的总蛋白成分.体外培养人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞.用3H-TdR掺入法测定细胞增殖水平,Western blot方法检测细胞合成单核细胞趋化因子(MCP-1)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平,RT-PCR检测细胞TGF-β mRNA表达,间接竞争ELISA检测细胞上清的纤连蛋白(FN)水平.结果(1)提取的尿蛋白主要成分为白蛋白、转铁蛋白和IgG,分别是84.5%、8.0%和1.2%.(2)0.2～10 mg/ml浓度的尿蛋白能刺激HK-2细胞增殖,为对照组的3.33～8.59倍(P＜0.01～0.001).(3)在0.5～5 mg/ml浓度的尿蛋白作用下,HK-2细胞分泌FN也明显高于对照组(P＜0.001),5 mg/ml时的作用最强,为对照组的(2.908±0.544)倍.(4)尿蛋白还诱导HK-2细胞合成MCP-1、α-SMA蛋白及上调表达TGF-β mRNA,当浓度为5～10 mg/ml时其作用最强.(5)TGF-β1中和抗体在浓度为1～2 μg/ml时可部分阻断尿蛋白(5 mg/m1)对HK-2细胞FN分泌和MCP-1蛋白合成的刺激作用.结论人类微小病变来源的尿蛋白可刺激人近端肾小管上皮细胞增殖、分泌细胞外基质蛋白、合成炎症趋化因子,诱导肾小管细胞发生以α-SMA为标志物的表型转化.这一效应部分通过TGF-β1的介导作用.这可能在蛋白尿诱导的肾小管间质损伤和肾脏病进展中起重要作用.     

甲状旁腺激素通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达

目的 观察甲状旁腺激素（PTH）对人肾小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的影响，并探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径在此过程中的作用。 方法 采用实时定量PCR、Western印迹、报告基因等技术，观察PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的情况。使用信号通路抑制剂PD98059、U0126阻断信号通路以明确PTH发挥作用的信号途径。 结果 正常HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达水平显著增加。10-10 mol/L PTH作用12 h后，荧光素酶活性较对照组明显升高[（1.8884±0.0780）比（0.9891±0.0300） A，P ＜ 0.01]。正常HK-2细胞有少量p-ERK1/2表达，PTH刺激后p-ERK1/2表达明显升高，以10-10 mol/L PTH作用30 min时效应最强；MAPK通路抑制剂PD98059、U0126作用后，CTGF mRNA、蛋白、基因启动子表达均明显下降。 结论 PTH可诱导HK-2细胞CTGF表达，其作用可能是通过MAPK信号通路来实现的。     

金雀异黄素在甲状旁腺激素诱导的人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达中的调控作用

目的 探讨金雀异黄素（Gen）对甲状旁腺激素（PTH）引起的人近曲小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的调控作用。 方法 应用实时定量-聚合酶链反应（real time-PCR）、Western蛋白印迹、报告基因等技术,观察Gen对PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的影响。使用MAPK通路抑制剂U0126阻断信号通路以明确Gen发挥作用的机制。 结果 HK-2细胞有基础量的CTGF mRNA和蛋白表达,PTH刺激后其表达量显著增加（P ＜ 0.05）。10-10 mol/L PTH作用12 h后,荧光素酶活性较对照组明显升高（1.8884±0.0780比0.9891±0.0300,P ＜ 0.01）。Gen剂量依赖性下调PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达。正常HK-2细胞有少量磷酸化（p）ERK1/2表达,PTH刺激后p-ERK1/2表达明显升高,以10-10 mol/L PTH作用30 min时效应最强。U0126作用后,CTGF mRNA、蛋白表达均明显下降（P ＜ 0.05）。Gen抑制PTH所致的HK-2细胞ERK1/2活化。 结论 Gen可通过阻断MAPK信号通路抑制PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达。     

低渗非离子造影剂对肾小管上皮细胞凋亡的作用及其机制

目的 探讨低渗非离子型造影剂碘必乐诱导体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）凋亡的作用及机制。 方法 体外培养的HK-2细胞,分为阴性对照组、不同剂量（1.16、4.63、18.5、74、296 gI/L）的碘必乐作用组（作用时间为6 h）。通过流式细胞仪、Hoechst 33258染色观察细胞凋亡的比例和形态学变化;Western印迹方法检测凋亡蛋白天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的表达水平,并选取作用最强的剂量（296 gI/L）刺激2、4、6、12 h,观察caspase-3表达变化。选取不同剂量碘必乐作用1 h,与阴性对照组比较,观察细胞外信号调节激酶（ERK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路磷酸化水平的变化,并观察不同剂量p38MAPK抑制剂SB203580对碘必乐诱导的caspase-3和Bcl-2表达的影响。 结果 流式细胞仪检测结果示74、296 gI/L碘必乐作用下细胞凋亡率较阴性对照显著升高（均P < 0.05）。Hoechst 33258染色结果示296 gI/L碘必乐可致明显的细胞凋亡形态学改变,凋亡细胞核呈致密浓染或核碎裂。Western印迹检测方法表明,碘必乐以剂量和时间依赖方式诱导细胞内caspase-3表达,以296 gI/L作用12 h表达最强;各剂量碘必乐作用下细胞内ERK1/2磷酸化水平与阴性对照组的差异均无统计学意义（均P > 0.05）,而一定剂量的碘必乐处理组细胞内p38MAPK磷酸化水平较阴性对照组显著升高（均P < 0.05）。应用p38MAPK特异性抑制剂（30 μmol/L）预处理2 h可以阻断细胞内p38MAPK信号通路的磷酸化,抑制碘必乐诱导的细胞内caspase-3表达并部分上调Bcl-2表达,与碘必乐阳性对照组的差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 低渗非离子型造影剂碘必乐以剂量和时间依赖方式诱导体外培养的HK-2细胞凋亡,其机制可能与上调caspase-3和下调抗凋亡蛋白Bcl-2有关,而p38MAPK信号通路的激活可能参与了该过程的调控。     

红细胞生成素对马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞凋亡的保护机制研究

目的探讨红细胞生成素（EPO）抑制马兜铃酸（AA）所诱导的肾小管上皮细胞（LLC—PK1）凋亡的作用机制。方法以不同浓度AA（5、10、20mg／L）刺激LLC—PK1细胞株，同时培养体系中加入不同浓度的EPO（5、10、20U／m1），另设对照组。各组细胞培养24h后，TUNEL法原位检测细胞凋亡情况；流式细胞仪检测凋亡细胞的比例；Western印迹检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶（caspase）3、bcl—xL的蛋白表达。结果（1）与对照组（6．09±1．84）％相比，AA5mg／L组TUNEL阳性细胞比例增加【（9．79±2．58）％】；AA10、20mg／L阳性细胞比例显著增加[（37．67±8．23）％、（62．95±8．29）％】，与对照组差异有统计学意义（P〈0．05）。AA10mg／L组细胞经EPO10、20U／ml干预后，阳性细胞比例显著下降f（22．41±3．47）％、（14．63±2．66）％，P〈0．051；AA20mg／L组细胞经不同浓度EPO干预后，阳性细胞比例无显著变化。（2）与对照组相比，AA5mg／L组细胞caspase-3的活性表达有少量增加；AA10mg／L组细胞caspase-3显著增加；而AA20mg／L组caspase-3表达降低。与AA10mg／L组相比，EPO10U／ml和EPO20U/ml干预后，细胞caspase-3的表达显著降低。（3）与对照组相比，AA5mg／L组细胞bcl—xL的表达明显增加；AA10mg／L组细胞bcl-xL表达减少；AA20mg／L组细胞bcl—xL表达显著减少。与AA10mg／L组相比，EPO5U/ml干预后，细胞bcl-xL有所增加；EPO10U／ml和EPO20U／ml干预后，细胞bcl—xL的表达显著增加。结论EPO可能通过促进抗凋亡蛋白bcl-xL的表达、抑制凋亡蛋白酶caspase-3的过高表达，从而抑制了AA诱导的肾小管上皮细胞的凋亡。     

狼疮肾炎患者尿蛋白通过p38丝裂素活化蛋白激酶信号途径刺激近端肾小管上皮细胞上调表达骨调素

目的探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在狼疮肾炎(LN)尿蛋白介导近端肾小管上皮细胞(HK-2)表达骨调素(DPN)中的作用。方法收集狼疮肾炎患者24h的尿液提纯总蛋白，体外刺激HK-2细胞，分别用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western印迹法观察应用p38MAPK特异性阻断剂SB203580对。HK-2细胞表达OPN mRNA及蛋白的影响：免疫荧光法检测OPN及其受体CD44在细胞中的表达。结果狼疮肾炎患者尿蛋白可刺激HK-2细胞OPN mRNA及蛋白上调表达，并呈时间和浓度依赖性，而SB203580可明显抑制这一作用。结论狼疮肾炎尿蛋白可通过p38MAPK途径刺激HK-2细胞OPN mRNA和蛋白上调表达。     

白细胞介素6刺激人近端肾小管上皮细胞-α-平滑肌肌动蛋白的表达的机制研究

目的观察白细胞介素6（IL-6）在体外对人近曲肾小管上皮细胞株（HK-2）信号转导因子和转录活化因子1（STAT1）酪氨酸磷酸化的影响,探讨IL-6刺激人近端肾小管上皮细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的分子机制。方法采用流式细胞仪检测10、25、50 ng/mL浓度的IL-6刺激48 h后α-SMA阳性细胞表达百分数;采用Western blot方法检测0、5、10、25、50 ng/mL的IL-6刺激30 min以及IL-6（25 ng/mL）刺激0、15min、30min、60min、120min后P-STAT1蛋白的表达水平;同样方法检测,AG490预处理细胞4 h,IL-6（25 ng/mL）分别刺激30 min后及48 h后P-STAT1和α-SMA蛋白表达水平。结果与刺激前比较,IL-6以剂量依赖方式上调α-SMA阳性细胞表达百分数;与刺激前比较,IL-6以时间和剂量依赖方式上调HK-2细胞P-STAT1的表达,高峰发生在30 min;AG490部分抑制STAT1激活,下调α-SMA蛋白的表达。结论HK-2细胞中,信号蛋白STAT1酪氨酸磷酸化介导了IL-6诱导的α-SMA的表达,参与了肾间质纤维化的发病过程。     

介导血管紧张素Ⅱ上调近端肾小管上皮细胞金属蛋白酶组织抑制剂1表达的信号分子研究

目的 研究信号转导子和转录激活子(STAT)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞表达基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)过程中的作用。方法 采用凝胶阻滞电泳(EMSA)测定DNA-STAT结合活性变化。Supershift和Western印迹分析STAT蛋白的组成。激光扫描共聚焦显微镜观察活化STAT蛋白的核转位。采用RT-PCR方法检测HK-2细胞AT1和AT2受体的表达。Northern印迹检测TIMP-1的mRNA表达。结果 AngⅡ能够以剂量和时间依赖方式激活STAT1和STAT3。AngⅡ刺激后TIMP-1 mRNA的表达显著增加。HK-2细胞可表达AT1和AT2两种受体。AngⅡ激活STAT蛋白和上调TIMP-1的作用能被AT1受体拮抗剂阻断，而不能被AT2受体拮抗剂阻断。结论 AngⅡ通过激活近端肾小管上皮细胞的AT1受体来活化STAT1和STAT3信号分子，并可以进而上调TIMP-1的mRNA表达。     

不同病理类型肾综患者尿蛋白对肾小管上皮细胞增殖和凋亡相关蛋白Fas表达的影响

目的：观察不同病理类型肾病综合征（NS）患者尿蛋白对肾小管上皮细胞（RTECs）增殖和凋亡的影响,以进一步明确尿蛋白所致肾小管-间质损害的机制.方法：（1）从局灶-节段性肾小球硬化症（FSGS）、膜性肾病（MN）、微小病变肾病（MCN）三种不同病理类型的NS患者尿液中提取尿蛋白,经成份分析、灭菌等处理后以0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml浓度分别刺激体外培养的HK-2细胞,另设空白对照组.（2）MTT法检测不同病理类型NS患者尿蛋白刺激后细胞的增殖情况.（3）乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测不同病理类型NS患者尿蛋白的细胞毒作用.（4）Western Blotting法检测Fas蛋白表达.结果：各病理类型所提取的尿蛋白成分相同,主要为白蛋白、转铁蛋白、IgG等,但各病理类型组成比例不同;肾小管上皮细胞MTT值低浓度有明显增殖作用,高浓度时细胞过度增殖则导致凋亡;肾小管上皮细胞LDH释放率和Fas蛋白的表达水平随尿蛋白浓度的升高而升高;以上各项检测指标中FSGS患者尿蛋白对HK-2细胞的作用最强,MN次之,MCD最弱.结论：在体外条件下,尿蛋白对RTECs呈剂量依赖性的细胞毒作用,低剂量尿蛋白诱导RTECs异常增殖,较高剂量尿蛋白可诱导RTECs凋亡;除尿蛋白的量决定了损伤严重程度外,尿蛋白的性质也决定了损伤的严重程度.     

表面活性蛋白A在脂多糖诱导的人肾小管上皮细胞中的表达

目的 研究表面活性蛋白A（SP-A）及其亚型在人肾组织和人肾小管上皮细胞（HK-2）的表达和分布,同时分析脂多糖（LPS）对HK-2细胞中SP-A亚型的 mRNA和蛋白表达的影响。 方法 收集10例人的肾组织,以5例人的肺组织作为对照,同时培养HK-2细胞。免疫组化法检测SP-A在人肾组织的表达部位;RT-PCR法检测SP-A mRNA在人肾组织和HK-2细胞中的表达;限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）和测序的方法分析SP-A亚型在HK-2细胞的表达;实时定量PCR法比较SP-A mRNA在人肾组织和在人肺组织中的相对含量;Western印迹法检测人肾组织和HK-2细胞中SP-A蛋白的表达;Western印迹和ELISA法检测人的尿液和HK-2细胞培养上清液中SP-A的分泌量。RT-PCR和Western印迹检测LPS在不同浓度（0、0.1、1、2、5、10 mg/L）作用8 h及5 mg/L LPS在不同时间（0、2、4、8、16、24 h）作用HK-2细胞后,SP-A mRNA和蛋白表达的变化情况。 结果 免疫组化结果显示SP-A主要表达在肾皮质的远曲和近曲小管的肾小管上皮细胞。RFLP和测序的方法均证实HK-2细胞可同时表达SP-A1和SP-A2亚型。实时定量PCR证实SP-A mRNA在人肾组织的表达量仅为肺组织的30%（n = 5）。Western印迹检测到人肾组织和HK-2细胞可表达SP-A蛋白。同时在人的尿液和HK-2细胞培养上清液中也检测到SP-A的分泌,其分泌量分别为（106.614±72.772） nmol/L（n = 30）和（85.533± 58.622） nmol/L（n = 10）。应用1、2、5、10 mg/L的 LPS刺激HK-2细胞8 h后,SP-A1和SP-A2 mRNA及SP-A蛋白表达较0、0.1 mg/L显著升高（P < 0.05）;同时,应用5 mg/L的LPS作用HK-2细胞4、8、16、24 h后, SP-A1和SP-A2 mRNA及SP-A蛋白表达较LPS作用0、2 h显著升高（P < 0.05）。 结论 HK-2细胞能同时表达SP-A1和SP-A2亚型,能产生和分泌SP-A蛋白。SP-A1和SP-A2可能在肾脏的天然免疫和炎性反应调节方面起重要作用。     

二甲基乙二酰基甘氨酸对缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用及其机制

目的 通过脯氨酸羟化酶抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸（DMOG）稳定缺氧诱导因子1α（HIF-1α）表达,探讨其对缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞（HKC）损伤的保护作用及其机制。 方法 制作无糖缺氧复氧细胞损伤模型,用不同浓度的DMOG预处理,锥虫蓝染色和乳酸脱氢酶（LDH）活性方法检测细胞活力及损伤;Annexin V和PI染色流式细胞仪技术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR方法检测红细胞生成素（EPO）、热休克蛋白70（HSP70）和血红素氧合酶1（HO-1） mRNA的表达;Western印迹法检测HIF-1α、活性caspase-3和Bcl-2蛋白表达。 结果 正常情况下HKC细胞内几乎无HIF-1α蛋白表达,DMOG刺激6 h后HIF-1α蛋白及其靶基因EPO、HSP70和HO-1 mRNA表达均显著上调（均P ＜ 0.01）,且呈浓度依赖性。500 μmol/L或1 mmol/L DMOG预处理可明显改善缺氧复氧诱导的细胞损伤,表现为细胞存活率升高（95.6%±1.8%、96.1%±1.0%比 83.3%±3.1%）;培养上清液中LDH 活性下降;细胞凋亡减少（8.6%±2.7%、6.1%±2.3%比19.2%±4.0%）（均P ＜ 0.05）。另外,细胞内活性caspase-3蛋白表达显著下调,而Bcl-2蛋白表达则显著上调（均P ＜ 0.05）。 结论 DMOG预处理可稳定肾小管上皮细胞内HIF-1α表达,对缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞损伤具有一定保护作用。其机制可能与促进EPO、HSP70和HO-1表达,抑制caspase-3活化,上调Bcl-2表达有关。     

血红素加氧酶1对白蛋白诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的 探讨血红素加氧酶1（HO-1）对白蛋白诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响及其可能机制。 方法 体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）为正常对照。白蛋白对照组加去脂的小牛血清白蛋白（BSA）30 g/L共同培养。干预组先加钴卟啉（Cobalt protoporphyrin IX,CoPP,血红素加氧酶1诱导剂）5 μmol/L,0.5 h后再加入BSA 30 g/L,作用24 h。四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测CoPP对BSA抑制NRK-52E细胞增殖的影响。细胞免疫荧光染色检测细胞凋亡率。RT-PCR法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax mRNA表达情况。 结果 与正常对照组比较,BSA对细胞增殖具有抑制作用并诱导细胞凋亡,差异有统计学意义（P < 0.05）,而CoPP对BSA引起的细胞毒性作用具有保护作用（P < 0.05）;BSA对照组HO-1 mRNA表达增加（0.44±0.06比0.39±0.05,P < 0.05),差异有统计学意义（P < 0.05）。CoPP预处理后,HO-1 mRNA表达（0.50±0.06）较BSA对照组增加（P < 0.05）。BSA可上调Bax mRNA表达(0.87±0.04比0.67±0.03,P < 0.05）及下调Bcl-2 mRNA的表达（0.25±0.04比0.42±0.02,P < 0.05),当加入CoPP预处理后可抑制上述改变（Bax mRNA：0.75±0.07,Bcl-2 mRNA：0.36±0.03,均P < 0.05）。 结论 BSA可显著增加细胞的凋亡率并直接调控凋亡相关蛋白mRNA的表达,CoPP可抑制上述BSA的作用。HO-1对BSA所致肾小管上皮细胞凋亡具有保护作用,可以抑制细胞凋亡。     

高糖与切应力对肾小管上皮细胞megalin及cubilin表达的影响及其意义

目的 观察高糖与切应力对肾小管上皮细胞白蛋白受体megalin、cubilin表达的影响并探讨其意义。 方法 链尿菌素（STZ）腹腔注射SD雄性大鼠制作糖尿病肾病（DN）模型，以健康SD雄性大鼠为对照。于第2、4、6周分别检测尿白蛋白量（24 h）；免疫组化法检测各组肾脏megalin、cubilin蛋白的表达。将体外培养的肾近端小管上皮细胞(NRK-52E)分为空白对照组、甘露醇组、高糖组，并以平行板流室系统提供0.5、1.0 Pa的切应力处理各组NRK-52E细胞, 分别作用1、3、6 h。以RT-PCR法检测各组细胞megalin、cubilin mRNA表达。 结果 对照组肾脏megalin、cubilin蛋白表达水平高于相应时间点DN组(P < 0.05)。肾脏megalin、cubilin表达水平与尿白蛋白量（24 h）呈负相关(r =－0.832及－0.815，均P < 0.05)。高糖抑制NRK-52E细胞megalin、cubilin mRNA的表达(P < 0.05)。切应力加载抑制细胞megalin、cubilin mRNA的表达,其抑制作用比单纯高糖更明显，且与切应力大小及作用时间有关(P < 0.05)。 结论 DN早期高滤过导致滤出液对肾近端小管上皮细胞的切应力增加，其与高糖协同作用可下调细胞megalin、cubilin mRNA的表达，减少肾小管对白蛋白的重吸收,是DN早期微量白蛋白尿发生的机制之一。     

改良的大鼠近端肾小管上皮细胞分离纯化方法

目的　建立纯度高、操作简便的大鼠近端肾小管上皮细胞分离纯化方法。 方法 Wistar大鼠无菌取肾前先心脏抽血替代原位肾脏灌注，分离肾皮质，经Ⅰ型胶原酶消化后用45% Percoll分离液制备细胞悬液直接连续密度梯度离心。所得细胞用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基原代培养并传代，根据细胞形态、细胞角蛋白18（CK18）和水通道蛋白1（AQP1）免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶化学染色进行鉴定。 结果 此简化方法获得的肾小管细胞中肾小球掺杂明显减少，培养4～5 d后细胞融合长满，呈典型上皮样细胞的鹅卵石状，其CK18、AQP1免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶化学染色几乎均呈阳性，证实所培养细胞为近端肾小管上皮细胞。 结论 改良后的分离纯化方法可获得大量高纯度近端肾小管上皮细胞，操作简便。     

甲状旁腺素对人肾小管上皮细胞细胞外基质合成与降解的影响

目的 研究甲状旁腺素（PTH）对人肾小管上皮细胞（HK-2）合成分泌Ⅲ型胶原、纤连蛋白以及对纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）、基质金属蛋白酶1（MMP-1）、金属蛋白酶1组织抑制剂（TIMP-1）基因表达的影响,以探讨PTH在肾间质纤维化发病机制中的作用。 方法 HK-2细胞培养于含5％ FBS的DMEM-F12培养液中,加入终浓度为0、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8 mol/L PTH的培养液刺激HK-2细胞48 h,或10-8 mol/L PTH刺激HK-2细胞不同时间（0、12、24、48、72 h）。应用半定量RT-PCR法检测细胞中Ⅲ型胶原、纤连蛋白、PAI-1、MMP-1、TIMP-1基因的表达;Western印迹法检测HK-2细胞中Ⅲ型胶原的蛋白表达;ELISA法检测细胞培养上清液中纤连蛋白的含量。 结果 PTH 呈剂量和时间依赖性促进HK-2细胞中Ⅲ型胶原、纤连蛋白、PAI-1、TIMP-1 mRNA的表达,抑制MMP-1 mRNA的表达,MMP-1/TIMP-1 比值降低。PTH呈剂量和时间依赖性增加HK-2细胞中Ⅲ型胶原的蛋白表达及细胞培养上清液中纤连蛋白的含量。 结论 PTH通过促进HK-2细胞中PAI-1、TIMP-1的基因表达,抑制MMP-1的基因表达,导致细胞外基质合成增加而降解减少。     

Numb基因在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用

目的 探讨Numb在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用。 方法 重组人转化生长因子β1（TGF-β1）刺激大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞),不同浓度TGF-β1 （0、1、5、10、15、20 μg/L）作用48 h与TGF-β1 10 μg/L作用不同时间(0、24、48、72 h)后,采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光染色分别检测NRK52E细胞内E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Numb 的表达。采用RNA干扰技术下调Numb表达,Western印迹观察改变Numb水平对E-cadherin、α-SMA蛋白水平的影响。 结果 TGF-β1以剂量及时间依赖的方式诱导NRK52E细胞E-cadherin 蛋白表达下调,α-SMA 蛋白表达增高。Numb蛋白的表达随TGF-β1浓度的增加而增高,在5、10、15和20 μg/L时分别为0 μg/L时的1.33倍（P = 0.024)、1.39倍（P = 0.035）、1.45倍（P = 0.025）和1.51倍（P = 0.000)。而Numb蛋白和mRNA的表达亦随TGF-β1作用时间的延长而增高,作用24 h、48 h、72 h,Numb蛋白分别为0 h的1.48倍（P = 0.046)、1.54倍（P = 0.011）、1.79倍（P = 0.028）,Numb mRNA分别为0 h的1.56倍（P = 0.012)、1.82倍（P = 0.008）、1.82倍（P = 0.002）;同时Numb的分布也发生了改变,大量聚集在胞质中。下调Numb表达可以显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA表达上调（为Numb表达正常时的18.1%,P = 0.004）、E-cadherin表达下调（为Numb表达正常时的2.19倍,P = 0.004）。 结论 Numb可以促进肾小管上皮细胞发生转分化。     

甲状旁腺激素对人近曲小管上皮细胞转分化及分泌结缔组织生长因子的影响

目的 探讨甲状旁腺激素（PTH）对人近曲小管上皮细胞系HK-2细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）及细胞转分化的影响。 方法 应用实时定量PCR和Western印迹观察PTH诱导HK-2细胞CTGF mRNA和蛋白表达情况，从转录水平探讨PTH对CTGF基因启动子活性的调控作用。应用免疫荧光技术检测PTH作用下HK-2细胞中α平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）的表达。 结果 HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达量显著增加。PTH最佳刺激浓度是10－10 mol/L，最佳刺激时间是72 h。10－10 mol/L PTH干预HK-2细胞12 h后，荧光素酶活性较对照组显著升高（1.888±0.078比0.989±0.030，P ＜ 0.01）；光镜下可见细胞由立方形铺路石样转变为梭形，随作用时间延长转分化现象更显著。PTH刺激HK-2细胞12 h后，免疫荧光检测可见细胞质中有α-SMA表达；PTH刺激24 h后，α-SMA表达明显增多，与CTGF mRNA和蛋白表达的时间效应一致。 结论 PTH可上调HK-2细胞CTGF表达，并具有促进HK-2细胞转分化的作用。