胰岛素介导的内皮依赖性血管舒张功能与高血糖关系的实验研究

目的：研究不同浓度胰岛素，葡萄糖对培养血管内皮细胞一氧化氮（NO）产生的影响，探讨糖尿病时内皮依赖性血管舒张异常的作用机制。方法：用放免法测定内皮细胞cGMP水平来反映NO的量，半定量RT－PCR检测NO合酶（eNOS)mRNA水平。结果：胰岛素（0.18-6.0nmol/L)，葡萄糖（20mmol/L,40mmol/L)能增加内皮细胞cGMP产量，并呈浓度和时间依赖性；高浓度葡萄糖上调eNOS mRNA水平，而胰岛素对其无影响，在高浓度葡萄糖下，胰岛素（6.0nmol/L)刺激NO的生成作用明显降低。结论：胰岛素介导的内皮依赖性血管扩张与胰岛素刺激内皮细胞NO合成有关；血管内皮对胰岛素的敏感性减低是胰岛素抵抗的一部分；高浓度葡萄糖可能会抑制胰岛素介导的内皮依赖性血管舒张。     

高糖作用下脐静脉内皮细胞中血管内皮生长因子基因表达与蛋白激酶C通路的关系

目的观察高糖作用人脐静脉内皮细胞时血管内皮生长因子mRNA和蛋白的表达与蛋白激酶C通路被激活和抑制的关系。方法提取并体外培养人脐静脉内皮细胞,分别加入不同浓度葡萄糖(5.5、11、22及44mmol/L)、蛋白激酶C激活剂和阻断剂并分别作用不同时间,应用逆转录聚合酶链反应检测血管内皮生长因子mR-NA水平,免疫细胞化学检测血管内皮生长因子及蛋白激酶C蛋白表达。结果经高糖处理的人脐静脉内皮细胞中血管内皮生长因子mRNA的转录水平明显高于对照组(P<0.05或P<0.01),但脐静脉内皮细胞经22 mmol/L葡萄糖作用72 h或佛波酯作用6 h,血管内皮生长因子mRNA水平不再升高,而呈下降趋势(P<0.05)。经22 mmol/L葡萄糖作用72 h后,血管内皮生长因子蛋白表达也逐渐下降。蛋白激酶C在22 mmol/L葡萄糖处理2 h后出现膜转位。而蛋白激酶C抑制剂GF109203X可阻断上述现象。结论高糖能引起脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子mR-NA和蛋白表达增高。高糖引起脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子基因表达增高,其机制与高糖激活蛋白激酶C通路有关。     

苯扎贝特对血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖和小凹蛋白1表达的影响

目的 观察苯扎贝特对血小板源生长因子诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖及小凹蛋白1表达的影响并探讨其机制.方法 体外植块贴壁法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,噻唑兰比色法检测各组细胞增殖情况,Western Blotting法观察各组小凹蛋白1的表达情况.结果 不同浓度的苯扎贝特对血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖均有一定的抑制作用,随浓度增加,其抑制作用增强(P<0.01).血小板源生长因子干预组小凹蛋白1的表达较对照组明显降低(P<0.01),而用不同浓度的苯扎贝特干预后小凹蛋白1的表达明显升高(P<0.01),且随着苯扎贝特浓度增加,小凹蛋白1的表述明显增加.结论 苯扎贝特抑制血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的同时可以上调小凹蛋白1的表述.     

小凹蛋白-1与内皮型一氧化氮合成酶活性变化在大鼠门静脉高压形成中的作用

目的 探讨肝硬化发生发展过程中小凹蛋白-1的动态变化及与其肝纤维化程度、门静脉压力的关系,探讨小凹蛋白-1对内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)作用的可能调控机制.方法 构建二甲基亚硝胺致肝硬化大鼠模型,分别在造模后的1、2、3、4、6周,病理组织学观察肝纤维化程度及测定门静脉压力(PVP),放射强度测定法检测肝硬化组织中eNOS活性,免疫沉淀与Western blot检测小凹蛋白-1和eNOS蛋白变化及其相互作用.结果 造模过程中肝纤维化程度逐渐加重,至第4周已形成典型的肝硬化,其后逐渐减轻;免疫沉淀与Western blot实验结果表明eNOS和小凹蛋白-1可免疫共沉淀,且小凹蛋白-1与eNOS的结合可随造模时间延长而增加;小凹蛋白-1表达与肝纤维化程度、PVP呈显著正相关(r=0.967,P＜0.01;r=0.922,P＜0.01);NOS与肝纤维化程度、PVP呈显著负相关(r=-0.973,P＜0.01;r=-0.947,P＜0.01).结论 小凹蛋白-1作为eNOS的一个负调控因子,参与肝硬化门静脉高压的形成.     

血管内皮生长因子与细胞黏附分子-1的表达及其对血管内皮功能的影响

目的 通过观察高脂血症大鼠NO、血管内皮生长因子(VEGF)与血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)水平及调脂药物辛伐他汀对其表达的影响,探讨高脂血症在动脉粥样硬化早期对内皮功能的损伤机制.方法 将30只SD大鼠随机分为正常对照组、高脂血症组及辛伐他汀治疗组,分别检测3组大鼠血脂变化及NO、VEGF、VCAM-1水平.结果 与正常对照组比较,高脂血症组NO水平较低、VCAM-1表达较强且范围较广,黏附于内皮的白细胞数明显增多(P＜0.05);VEGF水平与对照组比较,差异无统计学意义;高脂血症组血NO2-/NO3-水平为(29.6±7.2)μmol/L,与正常对照组(38.0±9.9)μmol/L比较明显降低(P＜0.05);辛伐他汀组血NO2-/NO3-水平为(37.4±9.5)μmol/L,高于高脂血症组(P＜0.05),VEGF较高脂血症组明显增高(P＜0.05);血NO2-/NO3-与VEGF呈正相关(r=0.644,P＜0.05).血清NO浓度与VCAM-1表达强度及范围呈负相关(r分别为-0.676、-0.684,均为P＜0.05).结论 NO、VCAM-1参与高脂血症血管内皮的损害;辛伐他汀对内皮功能的改善,可能是通过提高NO水平、减少内皮细胞VCAM-1的表达及促进VEGF的分泌而实现的.     

醛固酮对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的醛固酮对人脐静脉内皮细胞增殖的影响及其机制。方法应用MTT法测试细胞的生长曲线,检测不同浓度的醛固酮对人脐静脉内皮细胞的增殖,流式细胞仪检测醛固酮对人脐静脉内皮细胞的凋亡,半定量RT-PCR及Western印迹分别检测人脐静脉内皮细胞的血管内皮生长因子mRNA水平及蛋白水平的表达。结果①MTT比色法显示,醛固酮对人脐静脉内皮细胞增殖具有抑制作用且呈浓度依赖性;②当醛固酮浓度增加到800μg/L后,其增殖抑制率不再升高,而此浓度时人脐静脉内皮细胞的凋亡率达到峰值的26.5%±3.3%;③经过醛固酮处理,人脐静脉内皮细胞的血管内皮生长因子mRNA及蛋白水平的表达量均显著下降。结论醛固酮通过降低人脐静脉内皮细胞的血管内皮生长因子表达抑制人脐静脉内皮细胞增殖并促进人脐静脉内皮细胞凋亡。     

内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子重组腺病毒对同型半胱氨酸致人血管内皮细胞损伤的拮抗作用

目的探讨内皮抑素(ENDO)-血管内皮细胞抑制因子(VEGI)重组腺病毒对同型半胱氨酸(Hcy)致人血管内皮细胞损伤的拮抗作用。方法应用内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子融合蛋白重组腺病毒(Ad-hENDOVEGI151)转染Hcy损伤的人血管内皮细胞ECV304,用免疫印迹法检测受染细胞融合蛋白的表达,用自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,用台盼蓝染色法计算细胞存活率,用ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达。结果制备的重组腺病毒具有较高的转基因效率,Ad-hENDO-VEGI151重组腺病毒能够在ECV304细胞中表达41 kDa大小的融合蛋白,Hcy(0.1~1.0 mmol/L)呈浓度依赖性地增加细胞LDH漏出量和降低细胞存活率,重组腺病毒能够有效地拮抗Hcy对人血管内皮细胞的损伤作用(P0.05)。结论内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子重组腺病毒对Hcy致人血管内皮细胞损伤有拮抗作用,为治疗高同型半胱氨酸血症等疾病提供新的思路。     

非对称性二甲基精氨酸对人脐静脉内皮细胞功能的影响

目的 探讨非对称性二甲基精氨酸对人脐静脉内皮细胞表达可溶性细胞间粘附分子1、内皮素1、一氧化氮的影响。并观察不同浓度L-精氨酸对非对称性二甲基精氨酸效应的拮抗作用。方法 以不同浓度的非对称性二甲基精氨酸（分别为1、4、8、12和16μmol/L）与人脐静脉内皮细胞共育及固定浓度的非对称性二甲基精氨酸（16μmol／L）加不同浓度的L-精氨酸（分别为0.2、0．4、0．8、1．6和3．2mmol／L）与人脐静脉内皮细胞共育24h，分别用酶联免疫吸附法、硝酸还原酶法、放射免疫法检测培养基中可溶性细胞间粘附分子1、内皮素1及一氧化氮的浓度。结果 非对称性二甲基精氨酸呈剂量依赖性增加人脐静脉内皮细胞可溶性细胞间粘附分子1和内皮素1的表达，降低一氧化氮的表达（P〈0．05），接近生理范围的非对称性二甲基精氨酸（即1μmol／L）对内皮功能没有明显的影响；外源性补充L-精氨酸可逆转非对称性二甲基精氨酸的效应，且呈剂量依赖性（P〈0．05），但当外源性L-精氨酸的剂量大到一定程度时即加入L-精氨酸／非对称性二甲基精氨酸〉100时，内皮功能并不能得到进一步改善。相关分析显示培养基中可溶性细胞间粘附分子1、一氧化氮、内皮素1的表达和加入非对称性二甲基精氨酸的的浓度明显相关。其相关系数r分别为0．943、-0．937和0．934（P〈0.01）。结论 非对称性二甲基精氨酸可通过增加内皮细胞表达可溶性细胞间粘附分子1和内皮素1，减低内皮细胞产生一氧化氮来导致内皮功能紊乱，且内皮功能紊乱的程度与非对称性二甲基精氨酸的浓度明显相关；外源性补充L-精氨酸可逆转非对称性二甲基精氨酸的效应；寻找有效的方法调节非对称性二甲基精氨酸的浓度可能是改善内皮功能，防治心血管疾病的一个新目标。     

血管紧张素Ⅱ对外周血早期内皮祖细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ对外周血早期内皮祖细胞血管内皮生长因子表达的影响。方法密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,培养7天,收集贴壁细胞,随机分对照组、血管紧张素Ⅱ各浓度(10-3mol/L、10-5mol/L、10-7mol/L)组、血管紧张素Ⅱ+缬沙坦组、血管紧张素Ⅱ+PD123319组。多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC标记荆豆凝集素Ⅰ和D iI标记的乙酰化低密度脂蛋白双染色阳性为早期内皮祖细胞,流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定。酶联免疫吸附测定法对早期内皮祖细胞血管内皮生长因子的表达进行测定。结果血管紧张素Ⅱ呈浓度依赖方式上调早期内皮祖细胞血管内皮生长因子的表达,此作用可被缬沙坦显著抑制,使之接近正常水平,PD123319对此无明显作用。结论血管紧张素Ⅱ通过血管紧张素Ⅱ受体1介导上调早期内皮祖细胞的血管内皮生长因子的表达,并呈浓度依赖性,血管紧张素Ⅱ受体2不参与血管紧张素介导的血管内皮生长因子的分泌。     

老年高血压的组织因子以及血管内皮生长因子变化

目的了解老年原发性高血压患者冠状动脉粥样斑块及肱动脉内皮功能与组织因子和血管内皮生长因子的关系。方法老年原发性高血压患者175例,男96例,女79例,年龄(73±17)岁。应用B超扫查肱动脉,测量在静息和反应性充血时肱动脉内径,用冠状动脉造影了解冠状动脉狭窄程度。用酶联免疫吸附法测定血组织因子和血管内皮生长因子水平。分析冠状动脉造影及超声结果与组织因子和血管内皮生长因子水平的关系。结果①高血压分级与组织因子和血管内皮生长因子水平与冠状动脉狭窄分级呈正相关,与内皮依赖性血管扩张负相关;②随着病变冠状动脉支数增加,组织因子和血管内皮生长因子水平亦增多;③组织因子与收缩压呈直线相关(r=0．483,P<0．001)、血管内皮生长因子与收缩压呈直线相关(r=0．426,P<0．001);Flow-MD与组织因子呈负相关(r=-0．613,P<0．001),与血管内皮生长因子呈负相关(r=-0．679,P<0．001)与收缩压呈负相关(r=-0．661,P<0．001);组织因子、血管内皮生长因子及Flow-MD与舒张压、平均压、年龄、性别及吸烟之间无明显相关。结论老年原发性高血压患者血液中组织因子、血管内皮生长因子水平增高与高血压分级、肱动脉内皮细胞功能受损及冠状动脉粥样硬化关系密切。     

葡萄糖对不同氧浓度下内皮祖细胞表达低氧诱导因子-1α的影响

目的 观察葡萄糖对低氧（1%氧浓度）和常氧（21%氧浓度）状态下内皮祖细胞表达低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）的影响,探讨低氧在糖尿病周围血管病发生中的可能作用.方法 常规培养健康人外周血来源的内皮祖细胞,加入不同浓度葡萄糖（5、10、33 mmol/L）分为A、B、C 3组,并在常氧和低氧条件下分别进行培养.实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测内皮祖细胞表达HIF-1α及VEGF的水平,免疫印迹法检测HIF-1α蛋白表达,ELISA法检测VEGF分泌水平.结果 （1）低氧组表达HIF-1α mRNA（A、B和C组分别为1.25±0.34、1.35±0.26和0.75±0.22）高于常氧组（A、B和C组分别为1.03 ±0.25、1.21±0.28和0.61±0.17）,差异具有统计学意义（A、B和C组t值分别为1.96,2.11,1.89,均P＜0.05）;而在相同氧浓度下,B组的内皮祖细胞表达HIF-1α mRNA高于A组和C组,差异具有统计学意义（低氧组F=23.54,P＜0.01;常氧组F=29.46,P＜0.01）.（2）在相同葡萄糖浓度下,低氧组和常氧组VEGF的蛋白表达差异无统计学意义（t值分别为0.933、1.258和1.001,均P＞0.05）.在低氧浓度下,VEGF的蛋白表达A、B和C组分别为2953±237、2473±205和1768±195,差异具有统计学意义（F=137.43,P=0.000）;在常氧浓度下,A、B和C组VEGF蛋白分别为2868±247、2377±197和1844±203,F=97.96,P=0.000.结论 高糖对低氧条件下的内皮祖细胞具有毒性作用,能减弱其表达HIF-1α和VEGF,可能在糖尿病周围血管病的发生中发挥一定作用.     

毒死蜱下调内皮型一氧化氮合酶的表达降低了脑基底动脉内皮依赖性舒张功能

目的探讨毒死蜱对血管舒张功能的影响及其可能的机制。方法采用离体血管环灌流方法,观察不同浓度的毒死蜱预处理对新西兰兔脑基底动脉环对乙酰胆碱和硝普钠介导的舒张反应以及血管组织中一氧化氮含量的影响。同时,观察不同浓度的毒死蜱预处理对培养的人脐静脉内皮细胞培养液中一氧化氮含量和内皮型一氧化氮合酶表达的影响。结果毒死蜱(0.001~0.1 mmol/L)预处理30 min,浓度依赖性地抑制乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张反应和降低了血管组中一氧化氮的含量,而对硝普钠引起的非内皮依赖性舒张反应没有影响。阿托品预处理则不影响毒死蜱的作用。毒死蜱(0.001~0.1 mmol/L)预处理30 min,浓度依赖性降低了培养液中一氧化氮的含量和内皮型一氧化氮合酶的表达。结论毒死蜱能降低血管内皮依赖性舒张反应,其机制可能与毒死蜱下调内皮型一氧化氮合酶的表达,减少一氧化氮的生成,损伤内皮细胞的功能有关。     

Coculture of Vascular Endothelial Cells and Smooth Muscle Cells from Spontaneously Hypertensive Rats

The effect of endothelium‐released vasoactive factors on vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation was studied in a coculture system. Isolated aortic endothelial cells and smooth muscle cells from 4‐week‐old spontaneously hypertensive rats (SHR) and age‐matched Wistar–Kyoto (WKY) rats were cocultured. After coculture, the VSMC proliferation rate was examined by ³H‐thymidine incorporation assay and the levels of the vasoactive factors in medium were determined by enzyme immunoassay (EIA). The results indicate that the proliferation rate of VSMCs in SHR was significantly higher than in WKY rats when VSMCs were cultured alone. When SHR vascular endothelial cells (VECs) were cocultured with VSMCs, the proliferation rate of SHR VSMCs was enhanced; however, there was no growth promoting effect in WKY VSMCs. When WKY VECs were cocultured with VSMCs, no VSMC proliferation effect was observed. When VSMCs were cultured alone, the endothelin‐1 (ET‐1) secretion in SHR was significantly higher than in WKY rats. When VECs and VSMCs were cocultured, the ET‐1 concentration increased in both SHR VEC and WKY VEC coculture groups in a similar manner; but the SHR VECs tended to release more thromboxaneA₂ (TXA₂) and less PGI₂ than WKY VECs. These results suggest that some kind of interaction between SHR VSMCs and SHR VECs is responsible for the high proliferation of SHR VSMCs but not the effects of SHR VECs per se.     

p38MAPK-eNOS-N0信号通路在人脐静脉内皮细胞凋亡中的保护作用

目的探讨p38MAPK信号通路在胰高血糖素样肽1(GLP-1)拮抗人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用。方法实验分为对照组、糖基化终末产物(AGE)组、GLP-1组、AGE+GLP-1组、AGE+SB203580组、AGE+GLP-1+SB203580组及AGE+GLP-1+L-NAME组,Western blot检测p-p38MAPK/p38MAPK、磷酸化内皮型一氧化氮合酶/内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS/eNOS)蛋白表达情况,NO检测试剂盒(一步法)检测NO含量,DCFH-DA荧光探针检测细胞活性氧(ROS)含量,Annexin V/PI流式检测细胞凋亡率。结果与AGE组相比,GLP-1预处理可诱导p-p38MAPK蛋白表达下降(P=0.000);与对照组比较,GLP-1或p38 MAPK抑制剂(SB203580)预处理后,受AGE抑制的eNOS蛋白表达或诱导的ROS水平分别显著升高(P=0.004)或下降(P=0.000);GLP-1预处理后,因AGE诱导的细胞凋亡率显著降低(P=0.000),而加入L-NAME后,GLP-1的抗凋亡作用显著减弱(P=0.002);GLP-1预处理后,细胞NO含量较单纯AGE组明显升高(P=0.000),而予以L-NAME后,细胞NO含量显著降低(P=0.011)。结论GLP-1可抑制p38 MAPK信号通路的活化,拮抗AGE对血管内皮细胞的氧化损伤;上调eNOS蛋白的表达,拮抗AGE诱导的内皮细胞NO生成障碍及细胞凋亡,从而延缓糖尿病合并动脉粥样硬化的发生发展。     

Phosphatidylethanol Mediates its Effects on the Vascular Endothelial Growth Factor via HDL Receptor in Endothelial Cells

Background:  Previous epidemiological studies have shown that light to moderate alcohol consumption has protective effects against coronary heart disease but the mechanisms of the beneficial effect of alcohol are not known. Ethanol may increase high density lipoprotein (HDL) cholesterol concentration, augment the reverse cholesterol transport, or regulate growth factors or adhesion molecules. To study whether qualitative changes in HDL phospholipids mediate part of the beneficial effects of alcohol on atherosclerosis by HDL receptor, we investigated whether phosphatidylethanol (PEth) in HDL particles affects the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) by a human scavenger receptor CD36 and LIMPII analog-I (CLA-1)-mediated pathway.
Methods:  Human EA.hy 926 endothelial cells were incubated in the presence of native HDL or PEth-HDL. VEGF concentration and CLA-1 protein expression were measured. Human CLA-1 receptor-mediated mechanisms in endothelial cells were studied using CLA-1 blocking antibody and protein kinase inhibitors.
Results:  Phosphatidylethanol-containing HDL particles caused a 6-fold increase in the expression of CLA-1 in endothelial cells compared with the effect of native HDL. That emergent effect was mediated mainly through protein kinase C and p44/42 mitogen-activated protein kinase pathways. PEth increased the secretion of VEGF and that increase could be abolished by a CLA-1 blocking antibody.
Conclusions:  High density lipoprotein particles containing PEth bind to CLA-1 receptor and thereby increase the secretion of VEGF from endothelial cells. Ethanol-induced protective effects against coronary heart disease may be explained, at least partly, by the effects of PEth-modified HDL particles on VEGF via CLA-1-mediated mechanisms in endothelial cells.     

血管内皮生长因子与心肌缺血

血管内皮生长因子（VEGF）是内皮细胞特异性的促有丝分裂原,属分泌性的糖蛋白。有促进内皮细胞增生,增强血管通透性;加速新血管形成的作用。VEGF通过与其特异性受体结合发挥生物学作用。VEGF在生理和病理状态下新生血管形成中起重要作用。VEGF及其受体在缺血和／或缺 氧的 心肌细胞中表达升高。VEGF蛋白应用于心肌缺血可以通过促进缺血区新生血管形成,提高侧枝血流量而改善心功能。VEGF基因治疗心肌缺血具有广阔应用前景。     

X-linked inhibitor of apoptosis protein is an important regulator of vascular endothelial growth factor-dependent bovine aortic endothelial cell survival

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a critical regulator of endothelial cell biology and vascular function. Chronic VEGF treatment has been shown to inhibit tumor necrosis factor-induced apoptosis in endothelial cells. However, the mechanism for this cell survival is unclear. Interestingly, VEGF also enhances the expression of X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP), a well-established antiapoptotic factor. XIAP has been shown to suppress apoptosis by blocking caspase activity in cancer cells, but it remains under studied in the endothelium. Therefore, we hypothesized that VEGF affects important endothelial functions, such as apoptosis and cell migration, by regulating XIAP expression and downstream caspase activity. To test this hypothesis, caspase activity, apoptosis, and cell migration were assessed following XIAP overexpression or depletion in bovine aortic endothelial cells. Much like VEGF treatment, ectopic expression of XIAP blocked tumor necrosis factor-induced apoptosis. Surprisingly, the mechanism was caspase-independent. In addition, XIAP-associated cell survival was the result of enhanced nitric oxide (NO) production, and XIAP was partially localized in caveolae. In these lipid rafts, XIAP interacted with a regulator of NO production, caveolin-1, via a binding motif (FtFgtwiY, where the bold letters represent aromatic amino acids) in the baculoviral IAP repeat-3 domain. Endothelial NO synthase binding to caveolin-1 was competitively inhibited by XIAP, suggesting that XIAP acts as a modulator of NO production by releasing endothelial NO synthase from caveolin-1. Further studies showed that endothelial cell migration was also controlled by XIAP-dependent NO. Taken together, these results suggest that XIAP plays a novel role in endothelial cells, interacting with caveolin-1 and acting as a regulator of vascular antiatherogenic function.     

重组腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因在培养大鼠心肌细胞中的表达

目的探讨2型腺相关病毒载体介导的人血管内皮生长因子165基因在离体心肌细胞中的表达及表达产物的生物活性。方法构建携带人血管内皮生长因子的2型腺相关病毒载体(rAAV-2/hVEGF165),感染大鼠原代心肌细胞,采用逆转录聚合酶链反应、免疫印迹法和酶联免疫吸附测定等方法检测心肌细胞人血管内皮生长因子165的表达,应用MTT法检测转染后细胞上清液中血管内皮生长因子165的生物学活性。结果逆转录聚合酶链反应检测结果发现感染的心肌细胞可表达人血管内皮生长因子165 mRNA;免疫印迹法检测结果表明感染的心肌细胞中有人血管内皮生长因子165,酶联免疫吸附测定法检测到血管内皮生长因子蛋白分泌水平为546.5±15.6pg/L,未转染组未检测到血管内皮生长因子蛋白的分泌;还发现感染的心肌细胞上清具有明显的促人内皮细胞增殖作用。结论2型腺相关病毒载体介导的人血管内皮生长因子165可有效转染大鼠心肌细胞,且表达产物具有促内皮细胞增殖作用。     

葡萄糖对人血管内皮细胞多元醇通路的激活作用及其机理

观察葡萄糖对人血管内皮细胞多元醇通路的影响 ,并探讨其作用机理。体外培养人脐静脉内皮细胞 ,加不同浓度葡萄糖或作用不同时间 ,采用高效液相色谱仪、硝酸还原酶法、生物化学检测及逆转录聚合酶链反应等方法测定内皮细胞山梨醇、一氧化氮、醛糖还原酶活性及醛糖还原酶基因mRNA。结果发现 ,经高浓度葡萄糖处理的人脐静脉内皮细胞山梨醇浓度明显高于对照组 (P <0 .0 5) ,一氧化氮浓度明显低于对照组 (P <0 .0 5)。醛糖还原酶基因mRNA水平及其活性均呈浓度及时间依赖性 ,但是内皮细胞经 2 2mmol L葡萄糖作用 48h或 44mmol L葡萄糖作用 2 4h后 ,醛糖还原酶基因mRNA水平及其活性均不再升高 ,而呈下降趋势 (P <0 .0 5)。结果提示 ,高浓度葡萄糖能引起内皮细胞功能改变 ,其机制可能是高浓度葡萄糖能增强醛糖还原酶基因的转录并提高其活性 ,从而活化多元醇通路。     

MicroRNA-181b诱导血管内皮细胞衰老和功能异常的机制研究

目的研究micro RNA-181b（mi R-181b）和胰岛素样生长因子1受体（Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R）参与血管内皮细胞衰老和血管新生的调节机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）,传代培养计算细胞群体倍增水平（Population doublings,PDL）,将PDL≤8 HUVECs定义为年轻细胞,PDL≥44 HUVECs定义为衰老细胞,并检测mi R-181b和IGF1R在年轻（PDL8）和年老（PDL44）HUVECs中的表达。PDL8 HUVECs过表达或抑制mi R-181b后,分别用MTS比色法、划痕（Wound healing）和成管（Tube formation）实验检测内皮细胞的增殖、迁移、成管等血管新生能力。采用双荧光素酶报告系统法检测mi R-181b对IGF1R转录后水平的调控。此外,给予缺氧刺激,观察缺氧应激条件下mi R-181b对IGF1R表达的调控作用。结果过表达mi R-181b可抑制PDL8内皮细胞的增殖能力22%（P〈0.001）、迁移能力23%（P〈0.001）,对成管能力没有显著影响（P〉0.05）。与PDL8HUVECs比较,mi R-181b在PDL44衰老内皮细胞中上调64%（P=0.046）,IGF1R的m RNA和蛋白水平分别下调39%和45%（P=0.004,P=0.014）。荧光素酶活性实验显示mi R-181b可与IGF1R的3’UTR结合,但过表达mi R-181b对IGF1R的表达水平无显著影响（P〉0.05）。在缺氧应激条件下,mi R-181b可上调IGF1R的表达（P=0.005）。结论 Mi R-181b抑制血管内皮细胞增殖、迁移等血管新生能力,这一作用与mi R-181b在缺氧应激条件下上调血管发育相关基因IGF1R的表达相关,其机制仍需进一步研究。