新疆三种葡萄病毒RT-PCR检测及序列分析

为研究新疆葡萄中沙地葡萄茎痘伴随病毒(Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPa V)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFk V)及葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)的发生情况和新疆分离株系统进化关系,分别克隆3种病毒新疆分离株部分基因区域,应用RT-PCR对新疆64份葡萄样品中上述3种病毒进行检测,并进行系统进化分析。结果显示,GRSPa V、GFk V和GVA的检出率分别为31.3%、62.5%和25.0%。新疆GRSPa V分离株(KJ801847)与美国GRSPa V分离株(AY368590)同源性达96.59%;新疆GFk V分离株(KJ801846)与日本GFk V分离株(AB222861)及中国辽宁GFk V分离株(JF927942)的同源性分别为91.70%和91.03%;新疆GVA分离株(KJ801845)与波兰GVA分离株(JN860997)同源性为93.88%,与中国四川GVA分离株(HQ671655)及辽宁GVA分离株(FJ445220)的同源性分别为92.92%和89.53%。表明3种葡萄病毒在新疆发生比较普遍,且新疆分离株与国内其它地方的分离株存在较大差异。     

警惕种子传带的南方番茄病毒Southern tomatovirus对我国番茄产业的危害

南方番茄病毒Southern tomato virus (STV)是近年来新发现的一种侵染番茄的病毒, 通常与多种病毒复合侵染, 可能与番茄的褪绿、黄化、衰退、果实变小等症状相关。该病毒最早在1984年发现, 并于2005年命名。我国首先于2015年在山东寿光发现。最近, 我们在山东和北京市多地的番茄样品中均检测到了该病毒, 并通过检测发现国内一些主要品种番茄种子的STV携带率达40%。STV基因组为一条双链RNA, 隶属Amalgaviridae科Amalgavirus属, 是严格种传病毒, 不能通过汁液摩擦接种和嫁接传播。鉴于STV的潜在危害以及与其他病毒高度复合侵染造成的严重损失, 本文介绍了STV检测方法, 并提出应开展对主栽品种的种子检测和针对性防控。     

番茄黑环病毒分子生物学检测方法及分离物序列分析

根据TBRV运动蛋白基因的保守序列设计引物，RT-PCR和IC-RT-PCR能从6个TBRV的分离物中分别扩增到与预期大小相同的DNA条带，序列测定和分析表明所测定的序列为TBRV运动蛋白基因的部分序列，在系统关系树上与TBRV的其它分离物形成一簇，表明所建立的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法是可靠的。     

RT-PCR检测番茄不孕病毒

根据番茄不孕病毒 (TAV)RNA3上外壳蛋白基因序列设计、合成引物 ,以感病组织和健康组织总RNA为模板 ,进行cDNA合成和PCR扩增 ,结果从感病组织中扩增出与预期的6 42bp大小一致的目标片段 ,而健康组织无此扩增产物 ;将PCR产物插入 pGEM T载体克隆并测序 ,序列分析表明与TAV不同株系的序列同源性达到 96 2 %以上 ;将感病组织总RNA以 1 0倍梯度稀释成不同浓度 ,测出RT PCR检测TAV的灵敏度为 1 0 -5 ;PCR产物克隆作为RT -PCR反应的阳性对照 ,解决了毒源保存和传播的问题 ,从而建立了TAV快速、灵敏、准确的RT -PCR鉴定和检测技术     

侵染番茄的番茄褪绿病毒山东泰安分离物的分子鉴定和序列分析

2012年秋季, 在山东泰安番茄主要种植区中采集到叶片褪绿, 叶脉颜色变深的疑似番茄褪绿病毒病和番茄侵染性褪绿病毒病的番茄样品。利用番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)的特异引物 ToCV1/ToCV2和番茄侵染性褪绿病毒(Tomato infectious chlorosis virus, TICV)的特异引物TICV1/TICV2分别对样品进行扩增, 最后仅得到利用引物 ToCV1/ToCV2 扩增的101 bp 的核苷酸序列, 对该核苷酸序列克隆并测序。序列比对表明, 山东泰安地区分离物与已登录的番茄褪绿病毒(ToCV)分离物相似性都在99%以上。随后, 对山东泰安种植区ToCV番茄分离物进行外壳蛋白(CP)及热激蛋白(HSP70)序列的扩增、克隆和测序(GenBank登录号KC812620/KC812625), 经NCBI BLAST比对发现, 目的序列与番茄褪绿病毒日本番茄分离物ToCV Japan/Tochigi (GenBank登录号AB513442/AB513443)相似性最高为99%, 同属于毛型病毒属的番茄褪绿病毒, 这是首次明确山东地区番茄受到番茄褪绿病毒的侵染。     

蚕豆萎蔫病毒2号安徽分离物全基因组序列测定与分析

利用酶联免疫和RT-PCR技术对采自安徽地区的蚕豆病株进行检测,确定其病原为蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2(BBWV2)。为明确BBWV2安徽分离物(BBWV2-AH)的分类地位,克隆了该分离物的全基因组序列,分析了其基因组特征。结果表明,BBWV2-AH RNA1全长为5 944 bp(GenBank登录号:KY606992),含有1个ORF;BBWV2-AH RNA2全长3 587bp(GenBank登录号:KY606993),含有1个ORF。全序列核苷酸和氨基酸相似性分析显示,BBWV2-AH RNA1与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为78.4%~96%和87.1%~99%;BBWV2-AH RNA2与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为76.8%~95.5%和88.2%~98.3%。全基因组核苷酸序列系统发育分析显示,BBWV2-AH RNA1与中国的BBWV2-Hunan RNA1的亲缘关系最近,而BBWV2-AH RNA2与韩国的多个分离物聚集在一起,再与中国的分离物BBWV2-B935形成一个分支。     

吉林番茄黄化曲叶病毒分离物的检测及其DNA-A全基因组序列分析

从吉林省松原市田间表现黄化曲叶症状的番茄上分离到病毒分离物JLSY,基因组全序列测定结果表明,基因组全长2781 bp,共编码6个ORF。序列比对表明,JLSY基因组与番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）安徽分离物（FN650807）相似性最高,为99.5%,而与其他双生病毒的序列相似性低于89%。经系统进化分析,该病毒分离物属于TYLCV以色列株系（TYLCV-IL）。这是首次在我国吉林省检测到番茄黄化曲叶病毒。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒安徽分离物全基因组序列测定及分析

通过胶体金免疫层析试纸条和RT-PCR等手段对采自安徽和县的西瓜病株进行检测,确定其病原为黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)。为明确CGMMV安徽分离物CGMMV-Anhui的分类地位,进一步克隆了该病毒的全基因组序列,分析了其基因组结构特征。结果表明,CGMMV-Anhui基因组全长为6 423bp(GenBank登录号KT236095),与已报道的CGMMV的编码区的基因结构一致,仅5′和3′端非编码区核苷酸数目略有差异。将CGMMV-Anhui与已报道的分离物的全基因组序列和外壳蛋白基因序列进行系统发育分析,显示CGMMV不同分离物可分为亚洲和欧洲两个组,安徽分离物CGMMV-Anhui与亚洲分离物亲缘关系较近,可能具有共同的侵染源。     

广东省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析

番茄黄化曲叶病毒病是世界番茄生产上一种毁灭性病害,番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)是引起该病害的主要病原病毒之一。本文采用滚环扩增及基因克隆方法,获得了侵染广东佛山和肇庆番茄的TYLCV 4个分离物全基因组;它们均为2 781 nt,编码6个ORF,其中病毒链上编码AV1和AV2,互补链上编码AC1、AC2、AC3和AC4。同源性比较结果表明,4个广东分离物基因组序列两两间同源性为99%以上;与已报道的TYLCV各分离物同源性在90%以上,而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的同源率均在98%以上。系统进化分析显示,广东分离物与来自中国不同地区的TYLCV分离物亲缘关系较近,并聚类在一个分支。因此,侵染引起广东佛山和肇庆番茄黄化曲叶病的病毒应来自国内其他地区。本研究是对TYLCV广东分离物分子特征的首次报道。     

番茄褪绿病毒RT-PCR检测技术的优化及河南分离物的鉴定

为获得高效、灵敏和稳定的番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)RT-PCR检测体系,选取文献报道的和重新设计的共9套ToCV的RT-PCR引物,经过一系列测试和比较,筛选出了灵敏度、特异性均较高的引物组合,并对反应条件、参数进行了优化,确定了最优反应条件。应用优化的ToCV RT-PCR检测体系对从河南设施蔬菜生产区采集的疑似感病番茄样品进行检测,扩增产物测序后经BLAST比对发现,河南分离物的CP和HSP70基因序列与GenBank上注册的ToCV典型分离物序列的相似性均达94%以上,通过对ToCV病毒粒子的电镜观察而进一步确定ToCV已在河南侵染设施番茄。     

检测南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条的建立

由白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth)传播的南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice blackstreaked dwarf virus,SRBSDV)是目前我国南方水稻上危害最严重的病毒,为开发简便、快速、准确的SRBSDV病毒检测技术和检测试剂,以感染SRBSDV的植物粗提液为免疫原,利用杂交瘤技术制备了2株抗SRBSDV的单抗(14A8和15G6),并利用制备的单抗建立了可快速、特异、灵敏地检测SRBSDV的胶体金免疫试纸条。结果表明,2株制备单抗的抗体类型及亚类均为Ig G1、kappa链,单抗腹水的间接ELISA效价均达到10~(-7);Western blot分析表明,2株单抗均与SRBSDV的外壳蛋白亚基有特异反应,而不与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)反应。以制备14A8和15G6单抗分别为捕获抗体和胶体金标记抗体,开发成能在5 min内准确、特异地检测水稻植物和白背飞虱传毒介体体内SRBSDV的胶体金免疫试纸条;灵敏度分析表明,该检测试纸条的检测水稻病叶的灵敏度达到1∶6 400倍(g/m L),检测单头携毒白背飞虱的灵敏度达到1∶51 200倍(单头/μL)。田间样品检测结果表明,该试纸条的检测结果与RT-PCR的符合率达到100%。建立的SRBSDV胶体金免疫试纸条可对南方水稻黑条矮缩病毒进行快速、特异、灵敏的诊断和检测。     

南方水稻黑条矮缩病毒安徽分离物S7片段的克隆及其S7-1基因编码蛋白的原核表达

为探讨南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的种群变异并获得S7-1原核表达蛋白,采用RT-PCR技术扩增SRBSDV安徽分离物S7片段,并进行克隆、测序及序列分析,再利用特异性引物扩增该分离物S7-1基因并克隆到原核表达载体p ET-GST上,重组质粒p ET-S7-1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导及Ni~(2+)-NTA亲和柱纯化融合蛋白,再进行Western blot检测。结果显示,SRBSDV安徽分离物S7片段与其它SRBSDV各个分离物S7片段的序列相似性极高,达99.3%~99.9%,而与斐济病毒属Fijivirus其它种之间的序列相似性较低,为35.5%~73.3%。SRBSDV安徽分离物与其它SRBSDV各个分离物聚成1个单独的分支,彼此间亲缘关系较近。试验获得了分子质量约为68 k D的S7-1融合蛋白,且GST单抗能够与S7-1融合蛋白发生特异性反应,表明本研究得到的融合蛋白确为靶标蛋白。     

南方水稻黑条矮缩病防控药剂的创制与应用

南方水稻黑条矮缩病是我国及越南等东南亚国家稻区水稻的重要病毒病。该病害潜隐性强、危害重、防控难度大,对水稻生成构成极大威胁。本文综述了南方水稻黑条矮缩病毒的基因组结构及功能、分子进化、病毒与植物寄主或媒介昆虫间的互作、测报技术、药剂创制和田间综合防控的研究进展,并对未来工作进行了展望与讨论。     

烟粉虱传播的番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒对不同番茄品种的复合侵染

为明确烟粉虱传播的番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)与番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)对不同番茄品种的复合侵染情况,于2015年11月在山东省寿光市温室内采集13个番茄品种共390份疑似发病植株叶片,对不同番茄品种的TYLCV抗性和2种病毒的复合侵染以及温室内发病番茄植株上烟粉虱成虫的带毒率进行检测。结果表明,采集的13个番茄品种经分子标记检测鉴定均为TYLCV杂合抗性;不同番茄品种ToCV与TYLCV的复合侵染率存在明显差异,大果番茄粉宴和贝瑞上复合侵染率最高可达73.3%,而樱桃番茄八喜上未检测到这2种病毒的复合侵染。此外,在发病番茄植株上采集的烟粉虱成虫体内可检测到2种病毒,其中烟粉虱ToCV带毒率为90.7%,TYLCV带毒率为80.0%,同时检测到ToCV与TYLCV的概率为71.3%。表明ToCV和TYLCV的复合侵染在山东省番茄生产中普遍发生,烟粉虱可同时携带这2种病毒并广泛传播。     

我国部分地区常见农作物上黄瓜花叶病毒分离物核酸多样性分析

为明确我国黄瓜花叶病毒株系分化及系统进化基本情况,从湖南、新疆、青海和海南4省区采集1 367个样品对其进行酶联免疫和RT-PCR检测,并对分离获得的15个黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)纯化分离物CP、MP、2b核苷酸序列进行相似性和进化树分析及生物学性状比较。结果表明,辣椒、龙葵和黄瓜的CMV阳性检出率较高,分别为54.13%、29.19%和18.46%。进化树分析显示CMV-Q5与CMV亚组II的亲缘性较高;CMV-N7为新发现的重组株系,其CP、2b基因属于CMV亚组IB,MP基因却属于CMV亚组II;其余13个分离物均属于CMV亚组IB。CMV-N7和CMV-Q5在系统寄主心叶烟和枯斑寄主苋色藜上引发的症状相似,但比对照株系CMV-P3613(IB)的发病时间要晚1~2 d,系统花叶较温和,枯斑较小。表明在以上4省区常见农作物上广泛流行的CMV存在分子变异。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查

为明确近年来在浙江省葫芦科作物上发生的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)基因组特征及其发生分布情况,从浙江省及上海地区的甜瓜、西瓜和瓠瓜上采集疑似样品进行RT-PCR鉴定,通过分段扩增测序的方法拼接获得基因组全序列并进行系统进化分析,利用特异性引物扩增获得CGMMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列,制备CGMMV CP抗血清进行Western-blot和Dot-ELISA检测。结果显示,来自甜瓜、西瓜和瓠瓜的3个CGMMV分离物基因组全序列均具有烟草花叶病毒属典型基因组结构特征,全部由6 423 nt构成;3个全序列间的核苷酸同源性高达99.11%~99.67%,编码的CP氨基酸同源性为100%。系统进化分析发现,CGMMV不同分离物形成2个进化相关群体,3个浙江的CGMMV分离物均位于第I组内,与已报道的中国CGMMV分离物和韩国CGMMV分离物亲缘性较高。Western-blot检测表明CGMMV CP抗血清可以与感病植株中的病毒发生特异性反应,可用于CGMMV鉴定;Dot-ELISA检测发现CGMMV在浙江省和上海市的葫芦科作物上普遍存在。     

黄瓜绿斑驳病毒河北分离物基因组克隆及序列分析

为揭示河北省黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)分类地位及系统进化情况,通过分子克隆测定了来自河北省西瓜产区分离获得的分离物CGMMV-chb的近全基因组序列,分析其基因组结构特征;并依据近全基因组核苷酸序列及外壳蛋白氨基酸序列进行了系统进化关系分析。结果表明,CGMMV-chb近全基因组大小为6 383 nts,Gen Bank登录号为KJ658958,含4个开放阅读框,编码4种蛋白;与Gen Bank库中的其它12个CGMMV分离物的核苷酸相似性为92%~100%,氨基酸相似性为98%~100%。CGMMV-chb与韩国分离物CGMMV-KW基因序列相似性最高,为98%~100%,与以色列分离物CGMMV isolate Ec基因序列相似性最低,为92%~99%;系统进化关系中CGMMV-chb与其它中国分离物、日韩分离物亲缘关系较近,处于同一亚组的不同分支中,与以色列分离物亲缘关系相对较远。     

侵染牡丹的烟草脆裂病毒的检测鉴定及序列分析

为明确江苏省牡丹上烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)的发生情况,利用ELISA和RT-PCR方法对采集自扬州市的40份牡丹叶片样品进行了检测鉴定,测定了其中一个分离物Peony-11中TRV RNA1分子的部分蛋白编码区序列,并结合Gen Bank中已报道的相关序列对其进行了多样性和系统发生分析。结果显示,江苏省扬州市牡丹上TRV的检出率高达62.5%;序列分析表明本研究获得的TRV牡丹分离物Peony-11与Gen Bank中其它63个分离物的核苷酸序列一致率为90.5%~99.7%;系统发生和遗传距离分析表明TRV可以分成2个组10个亚组,组间、亚组间具有较为清晰的地理和寄主特异性,其中Peony-11分离物位于亚组I-1。     

李属坏死环斑病毒新疆分离物运动蛋白基因片段的克隆与序列分析

为进一步揭示李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)新疆巴旦木分离物的分子特征、遗传变异及其与宿主之间的相互关系,采用RT-PCR方法扩增并克隆了4个PNRSV新疆巴旦木分离物运动蛋白(move protein,MP)基因片段,并进行了测序及序列同源性分析。结果表明,4个新疆巴旦木PNRSV分离物MP基因片段分别为259、258、254、260 bp;其核苷酸和氨基酸序列与已报道的PNRSV分离物的同源性分别为72.7%~91.7%和75.6%~92.9%,表现出明显差异,其中与美国分离物CH9同源性最高,分别达88.8%~91.7%和82.6%~92.9%;而与同属03亚组的苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,Ap MV)同源性较低,仅为51.2%~58.1%和52.3%~61.9%;新疆PNRSV各分离株之间MP基因核苷酸序列同源性较高。系统发育树显示,4个新疆巴旦木PNRSV分离物与Ⅰ组代表毒株PV32的核苷酸序列同源性达88.4%~91.3%,并与Ⅰ组分离物聚集成簇,表明PNRSV新疆巴旦木分离物属于引起严重症状的Ⅰ组株系,且Ⅰ组中各分离物之间表现出一定的寄主相关性,而Ⅱ组和Ⅲ组中各分离物之间未表现出明显的寄主相关性。