靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

本研究构建并鉴定靶向mdr-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BamHI和HindⅢ双酶切线性化的pGCsilencer人U6启动子质粒载体中;为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染的方法将构建好的3个重组载体(pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3)导入慢性髓系白血病耐药细胞株K562/A02,采用实时PCR方法检测转染细胞的mdr-1基因表达,Western-blot检测P-gp表达量的变化。结果表明:应用PCR电泳图谱和测序证实了克隆RNAi打靶序列完全正确,而且该载体又同时表达GFP标记基因,用于测定转染效率。分别转染pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3后K562/A02细胞的mdr-1基因表达和P-gp表达水平下降,证明shRNA可以特异性沉默mdr-1基因。结论:靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体构建成功,为进一步研究mdr-1基因在K562/A02细胞中的作用奠定了实验基础。     

GITRL联合IL-21基因真核表达载体的构建及体外研究

本研究构建人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体（GITRL）联合白介素-21（IL-21）基因真核表达载体,为探讨目的基因对慢性髓系白血病（CML）来源树突状细胞（DC）的影响.应用脂质体介导法将重组真核表达载体转染至纯化的DC,而此纯化的DC来源于经伊马替尼治疗有效或无效的慢性期CML患者或健康志愿者.应用ELISA法检测转染后DC细胞因子的浓度变化.将转染后的DC与纯化的自体NK混合培养使之成为DC-CIK.以DC-CIK细胞为效应细胞,应用乳酸脱氢酶释放法观察其对靶细胞的杀伤率.结果表明：所获目的基因经测序 与GenBank比对序列一致,PCR及限制性核酸内切酶检测显示,真核表达载体质粒经限制性酶切鉴定片段大小正确,并均可转染至伊马替尼治疗有效、无效的慢性期CML患者及健康志愿者来源的DC细胞.成功转染相应载体后的DC分别表现出IL-2和IFN-γ分泌量增加;细胞毒活性试验表明,转染后的DC可增加自体NK细胞对K562细胞的杀伤活性.结论：DC能够通过转染IL-21和GITRL基因的方式获得自我活化、上调自身细胞因子分泌的能力,为酪氨酸激酶抑制剂治疗无效的CML患者的免疫治疗奠定了理论依据和实验基础.     

DerP2基因真核表达载体构建及其在小鼠树突状细胞中的表达

背景：树突状细胞是目前已知的最强大的抗原提呈细胞，已经被应用于免疫治疗的研究中。目的：构建DerP2真核表达载体，并证明能在小鼠骨髓来源的树突状细胞中表达。设计、时间及地点：单～样本观察，实验于2005-05／12在解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所完成。材料：C57BL／6小鼠；plambd—DerP2购自美国HESKA公司；pCI-neo质粒为解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所保存。方法：体外分离，培养小鼠骨髓来源树突状细胞。将原核表达质粒plambdDerP2携带的DerP2全长cDNA切下，重组到真核表达质粒pCl-neo中，然后在脂质体介导下，将重组质粒转染到小鼠骨髓来源的树突状细胞，以未转染质粒和转染空白载体pCl—neo的树突状细胞为对照。主要观察指标：①pCl—neoDerP2重组质粒结构鉴定。②并用反转录-聚合酶链反应、Western Blot检测DerP2mRNA和蛋白表达。结果：测序证实构建的重组质粒中携带了DerP2的全长cDNA序列，且与GeneBank序列完全一致。反转录-聚合酶链反应和Western Blot检测结果提示，重组质粒转染的树突状细胞能表达DerP2mRNA和DerP2蛋白。结论：成功构建重组DerP2基因真核表达载体，其转染树突状细胞后，能有效地表达于树突状细胞中。     

MYCT-1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建MYCT-1(myc target)基因真核表达载体,观察其转染胃粘膜GES-1细胞系后的表达。方法用RT-PCR法合成MYCT-1 cDNA,克隆至表达载体pcDNA3.1上,测序验证无突变发生。将表达载体转染GES-1细胞,用RT-PCR和Western blot检测MYCT-1基因的表达。结果限制性内切酶酶切和DNA测序证实成功克隆了MYCT-1 cD-NA全长并正确插入了表达载体,在GES-1细胞中检测到MYCT-1 mRNA和蛋白。结论成功构建了MYCT-1真核表达载体,可在GES-1细胞中稳定表达。     

大鼠Akt1基因真核表达载体构建及其在293细胞中的表达

背景:Akt在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着重要角色.虽然Akt的作用机制目前尚有很多的未知领域,但其作为生存信号的一个重要组件,已成为近年分子生物研究中的一个重要课题.目的:构建Akt1基因真核表达载体pDC316-Akt1,观察其在293细胞(人胚肾母细胞)中的表达.设计、时间及地点:观察性实验,于2006-09/12在解放军军事医学科学院分子生物实验室完成.材料:pDC316质粒,由本元正阳公司提供;DH5 α、293细胞为自备.方法:采用反转录-聚合酶链反应方法自大鼠肝组织总RNA中克隆AktlDNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体pDC316的EcoR Ⅰ、Hind m的酶切位点,构建Akt1真核表达载体Akt-pDC316,脂质体介导法转染293细胞.主要观察指标:蛋白免疫印迹检测转染293细胞中Akt1的表达.结果:经测序鉴定,构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符.将Akt-pDC316转入293细胞,蛋白免疫印迹检测可见相对分子质量55 000位置有Akt1的表达.结论:构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分的表达.     

Der p 2基因真核表达载体构建及其在小鼠树突状细胞中的表达(英文)

背景：树突状细胞是目前已知的最强大的抗原提呈细胞，已经被应用于免疫治疗的研究中。目的：构建DerP2真核表达载体，并证明能在小鼠骨髓来源的树突状细胞中表达。设计、时间及地点：单～样本观察，实验于2005-05／12在解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所完成。材料：C57BL／6小鼠；plambd—DerP2购自美国HESKA公司；pCI-neo质粒为解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所保存。方法：体外分离，培养小鼠骨髓来源树突状细胞。将原核表达质粒plambdDerP2携带的DerP2全长cDNA切下，重组到真核表达质粒pCl-neo中，然后在脂质体介导下，将重组质粒转染到小鼠骨髓来源的树突状细胞，以未转染质粒和转染空白载体pCl—neo的树突状细胞为对照。主要观察指标：①pCl—neoDerP2重组质粒结构鉴定。②并用反转录-聚合酶链反应、Western Blot检测DerP2mRNA和蛋白表达。结果：测序证实构建的重组质粒中携带了DerP2的全长cDNA序列，且与GeneBank序列完全一致。反转录-聚合酶链反应和Western Blot检测结果提示，重组质粒转染的树突状细胞能表达DerP2mRNA和DerP2蛋白。结论：成功构建重组DerP2基因真核表达载体，其转染树突状细胞后，能有效地表达于树突状细胞中。     

MAGE-3-HSP70融合基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:疫苗诱导的抗肿瘤CD8+T细胞反应被认为在增加机体对肿瘤抵抗力方面起重要作用.研究发现,抗原递呈细胞摄取热休克蛋白70与肿瘤相关抗原的融合蛋白,并在MHC Ⅰ类分子上处理提呈有此热休克蛋白为伴侣的肽后,会启动CD8+细胞毒性T淋巴细胞反应.目的:构建黑色素瘤抗原3(MAGE-3)、人热休克蛋白70(HSP70)融合基因的真核表达载体.设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/12在国家卫生部纳米生物技术重点实验室完成.材料:pcDNA3.1(-)Vector为BD公司产品,pINCY/MAGE-3,pOTB7/HSP70为Open Biosystems公司产品,DH5α由纳米生物技术重点实验室保存.方法:设计含Xho Ⅰ酶切位点MAGE-3引物及含Kpn Ⅰ酶切位点人热休克蛋白70引物,以pINCY/MAGE-3和pOTB7/HSP70为模板扩增黑色素瘤抗原3和人热休克蛋白70基因片段,以基因片段为模板,采用MAGE-3上游引物(含Xho Ⅰ酶切位点)及人热休克蛋白70下游引物(含Kpn Ⅰ酶切位点),PCR扩增MAGE-3-HSP70融合基因片段,Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切并连接至pcDNA3.1(-),转化感受态大肠杆菌DH5α,获得阳性克隆进行双酶切和测序鉴定.主要观察指标:真核表达载体pcDNA3.1(-)IMAGE-3+HSP70的鉴定.结果:测序结果显示黑色素瘤抗原3与Gene Bank上公布的序列完全一致,人热休克蛋白70有3处同义突变.结论:成功构建MAGE-3-HSP70融合基因真核表达载体.     

小鼠 miR-214真核表达载体的构建及其鉴定

目的：构建小鼠 miR-214的 pcDNA3．1（＋/-）真核表达载体并在 COS -7细胞中转染检测其表达。方法小鼠基因组 DNA 扩增得到 miR -214序列,将酶切后的 miR -214克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋/-）,重组 pcDNA3．1（＋/-）-miR-214经过酶切和测序鉴定后转染 COS-7细胞并应用萤光定量 PCR 法检测 miR-214表达水平。结果小鼠 miR-214真核表达载体序列分析完全正确;转染 COS-7细胞后miR-214的表达水平可增加1．41倍。结论成功构建了 pcDNA3．1（＋/-）-miR-214真核表达载体并能在真核细胞中进行表达,为进一步进行 miR-214的功能研究提供了实验基础。     

FRAT1基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建FRAT1siRNA真核干涉表达载体pSINsi-FRAT1,并测序鉴定证实克隆正确。方法设计以FRAT1基因为靶标的RNAi序列和阴性对照片段序列,并克隆入载体pSINsi-hU6,用基因测序进行重组克隆验证。结果PCR检测证实siRNA插人pSINsi-hU6质粒,测序分析证实插入序列正确。结论成功构建FRAT1基因的RNAi载体,为研究FRAT1基因对结肠癌细胞增殖凋亡侵袭的影响提供了稳定转染的RNA干扰质粒。     

PIAS-1基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建PIAS-1 siRNA干扰载体Plko.1、PIAS-1。方法 设计以PIAS-1基因为靶标的siRNA序列,并克隆人载体Plko.1,用基因测序进行重组克隆验证。结果 PCR检测证实siRNA插入Plko.1质粒,测序分析证实插入序列正确。结论成功构建PIAS-1基因的siRNA载体,为研究PIAS-1基因对宫颈癌细胞增殖凋亡的影响提供了稳定转染的骨架载体。     

pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取VEGF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T/VEGF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒。结论为进一步研究利用VEGF基因修饰骨组织工程骨,促进血管再生提供实验基础。     

pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取骨形态发生蛋白（BMP-2）的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T/BMP-2重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果通过测序、酶切鉴定,证明pMD18-T/BMP-2质粒构建成功。结论本实验成功构建了pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒,为进一步研究利用BMP-2基因修饰骨组织工程骨种子细胞提供实验基础。     

靶向人SSH1L的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向人SSH1L的siRNA真核表达载体（pSUPER-SSH1L）。方法将设计好的SSH1L的siRNA的寡聚脱氧核苷酸链与真核表达载体pSUPER连接,构建重组pSUPER-SSH1L真核表达载体。对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序;通过Westernblot检测SSH1L蛋白的表达。结果酶切鉴定、DNA测序以及Westernblot检测结果证实表达质粒构建成功,无碱基突变。结论成功构建了靶向人SSH1L基因表达的siRNA干扰质粒载体pStrPEn-SSH1L,为进一步运用RNA干扰技术进行SSH1L基因功能研究奠定了基础。     

人PIF1全长基因及其截短体真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人PIF1基因5端、3端及全长基因的真核表达载体。方法从pCR2.1-TOPO-PIF1原始质粒中,采用PCR方法扩增目的基因PIF1,PIF1N及PIF1C,将目的基因和目的载体pcDNA3.1(-)分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化大肠杆菌DH5α,对生长出的克隆行特异限制性内切酶酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆送样测序。结果凝胶成像结果显示重组基因pcDNA3.1(-)-PIF1,pcDNA3.1(-)-PIF1N及pcDNA3.1(-)-PIF1C酶切后条带大小分别为1 926,540,1 428bp。结论成功构建hPIF1基因5端、3端及全长基因表达载体,分别为pcDNA3.1(-)-PIF1N,pcDNA3.1(-)-PIF1C及pcDNA3.1(-)-PIF1。     

人PIF1全长基因及其截短体真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人PIF1基因5端、3端及全长基因的真核表达载体。方法从pCR2.1-TOPO-PIF1原始质粒中,采用PCR方法扩增目的基因PIF1,PIF1N及PIF1C,将目的基因和目的载体pcDNA3.1（-）分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化大肠杆菌DH5α,对生长出的克隆行特异限制性内切酶酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆送样测序。结果凝胶成像结果显示重组基因pcDNA3.1（-）-PIF1,pcDNA3.1（-）-PIF1N及pcDNA3.1（-）-PIF1C酶切后条带大小分别为1 926,540,1 428bp。结论成功构建hPIF1基因5端、3端及全长基因表达载体,分别为pcDNA3.1（-）-PIF1N,pcDNA3.1（-）-PIF1C及pcDNA3.1（-）-PIF1。     

人同源盒基因HoxB4真核表达载体的构建及鉴定

本研究旨在构建人同源盒基因HoxB4真核表达载体并进行鉴定,为进一步研究HoxB4的作用提供物质基础。采用RT-PCR的方法从健康产妇脐血单个核细胞中扩增出该基因,并将HoxB4的PCR产物用EcoRI和BamHI双酶切后连接到用EcoRI和BamHI双酶切的带有EGFP编码序列和内部核糖体转入位点(IRES)的真核表达载体pIRES2-EGFP中,重组质粒在大肠杆菌DH5α内扩增后,对其进行双酶切及测序鉴定以证实载体构建成功。结果表明,双酶切和质粒测序结果证明HoxB4基因正确的连接到真核表达载体pIRES2-EGFP中,开放阅读框架正确,pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体构建成功。结论 :利用PCR,DNA重组等分子生物学技术,成功构建了pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体,为探讨HoxB4基因在造血干细胞的增殖和分化的调控功能提供了实验基础。     

大鼠脑源性神经营养因子基因重组真核表达载体的构建及其表达

背景：脑源性神经营养因子对多种神经元的发育、存活及轴突再生中起着重要作用，但由于血脑屏障的存在，限制了其应用。 目的：构建大鼠脑源性神经营养因子基因重组真核表达载体，观察其在真核细胞内的表达。 设计、时间及地点：单一样本实验。于2005—09／2006—09在昆明医学院神经科学研究所完成。 材料：清洁级健康雄性8周龄SD大鼠，体质量250g。 方法：①以反转录聚合酶链反应从大鼠脑组织总RNA扩增脑源性神经营养因子基因编码序列，将其克隆到真核表达载体pcDNA3中，构建重组表达载体pcDNA3／BDNF。②将L939细胞分为pcDNA3／BDNF转染组、pcDNA3转染组和未转染组，以FuGeneHD转染试剂介导相应质粒转染。 主要观察指标：①重组质粒pcDNA3／BDNF的酶切鉴定与序列分析。②免疫细胞化学和western blot鉴定脑源性神经营养因子在L929细胞中的表达。 结果：①重组质粒pcDNA3／BDNF经酶切产生783bp和5．2kb的片段，DNA测序证实783 bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因编码序列完全一致。②基因转染后，免疫细胞化学、western blot结果表明脑源性神经营养因子能在真核细胞中正确表达。 结论：成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3／BDNF，为后续研究奠定了基础。     

组织因子途径抑制物2基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人组织因子途径抑制物2(tissuefactorpathwayinhibitor2,TFPI-2)基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,并对其进行酶切鉴定。方法:实验于2006-09/12在安徽省立医院中心实验室完成。实验方法:①从人胎盘组织中提取总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增TFPI-2基因全长mRNA。②扩增产物回收纯化后用限制性内切酶酶切,与经同样处理的载体pEGFP-C1进行连接反应,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α。③碱变性法提取质粒进行限制性内切酶酶切分析,并进行DNA序列测定。结果:①成功克隆了708bp的TFPI-2基因片段。②构建了人TFPI-2基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,经限制性内切酶酶切,电泳分析后得到了大小分别为708bp的目的基因片段和4.6kb的载体片段,测序结果与TFPI-2mRNA的cDNA序列吻合。结论:通过基因重组技术,构建了稳定表达TFPI-2的人TFPI-2的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2。