PCR扩增杂交试验检测HCV-RNA

目的：评价ＰＣＲ扩增杂交试验（ＰＣＲ－Ｈｙｂ）在ＨＣＶ－ＲＮＡ检测中的应用。方法：对２８例丙型肝炎患者和５例非丙型肝炎患者采用ＰＣＲ扩增杂交（ＰＣＲ－Ｈｙｂ）试验、套式ＲＴ－ＰＣＲ及ｂＤＮＡ信号扩增试验检测ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果：三种方法的阳性率分别为７１．３４％（２０／２８）、７８．５７％（２２／２８）、１００％（２７／２７）。ＰＣＲ－Ｈｙｂ与套式ＲＴ－ＰＣＴ的阳性符合率为９３．９３％（３１／３３），与ｂＤＮＡ结果呈现较好的相关性（ｒ＝０．８０８３）。结论：ＰＣＲ－Ｈｙｂ具有较好的特异性和敏感性，并在抗病毒治疗时的动态观察有一定价值。     

高效单链DNA探针在β—珠蛋白基因表达调控研究中的应用

直接以克隆的逆病毒载体为模板，在反应管中加入适当比例的α－３２ｐ－ｄＡＴＰ及其他三种ｄＮＴＰ，以单引物进行线性聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增，标记与扩增同时进行，经过一轮ＰＣＲ（５０次循环）。可得到高度特异及高效的单链ＤＮＡ探针。作者已将其成功地应用于人类β－珠蛋白基因表达调控的研究。     

系列PCR方法检测淋巴细胞白血病克隆性基因重排的选择应用

以１次、半巢式及多重ＰＣＲ方法扩增５８例淋巴细胞白血病ＩｇＨ及ＴＣＲＶγＩ－Ｊγ克隆性基因重排。结果显示：多重ＰＣＲ和１次ＰＣＲ的敏感度为１０￣（－４）～１０￣（－５）水平；半巢式ＰＣＲ敏感度可达１０￣（－５）～１０￣（－６）水平。ＩｇＨ和ＴＣＲＶγＩ－Ｊγ重排阳性率为６７．２％和６２．０％；半巢式ＰＣＲ检测ＩｇＨ重排阳性率为７０．７％。上述结果表明：多重ＰＣＲ可同时检测两对目的基因，适于初治病例检测，而对缓解病例的检测则需采用敏感度较高的半巢式ＰＣＲ方法。     

用尿嘧啶－DNA－糖基化酶控制聚合酶链反应的产物污染

聚合酶链反应（ＰＣＲ）灵敏度极高，痕量的ＰＣＲ产物能污染新的ＰＣＲ体系（称为产物污染）导致假阳性结果，我们通过在所有的ＰＣＲ扩增中掺入ｄＵＴＰ使ＰＣＲ产物含“ｄＵ”，在以后的ＰＣＲ扩增前用尿嘧啶－ＤＮＡ糖基化酶（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ－Ｇｌｙｃｏｌａｓｅ，ＵＤＧ）处理，然后加热去除ＵＤＧ活性防止了产物污染。ＵＤＧ切割磷酸糖骨架上的尿嘧啶，可阴止ＤＮＡ聚合酶对它的复制，而对普通ＤＮＡ（即含”ｄＴ”）无影响。因为ＵＤＧ不与ｄＵＴＰ反应，而且在ＰＣＲ扩增前加热变性失活，使含尿嘧啶的污染物的污染得到很好控制。     

用聚合酶链反应快速检测痰液中结核杆菌

本研究以结核杆菌染色体中重复出现的长度为１２３个碱基对（ｂｐ）的ＤＮＡ片段作为作为聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增的模板，合成一对寡核苷酸引物。痰液标本先经三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ），乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ－２Ｎａ）和三硝基甲苯（Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００）加热、震荡处理，裂解结核杆菌，再作ＰＣＲ扩增和琼脂糖凝胶电泳。同时，与痰液直接涂片、抗酸染色镜检抗酸染色阳性杆菌作比较。用该ＰＣＲ扩增和琼脂糖凝     

用PCR检测人淋巴组织中弓形虫

将淋巴结病理组织提取ＤＮＡ后，用Ｔｇ－ＤＮＡＰＣＲ药盒体外扩增弓形虫ＤＮＡ。结果显示，１２０例淋巴结病理标本中，７例可检出２１０ｂｐ的扩增产物，其中３例ＨＤ（３／３２），２例ＮＨＬ（２／４１），２例ＣＬ（２／４７）。取ＰＣＲ扩增产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交试验（ＰＣＲ－ＳＢＨ），发现除原有７例阳性外，ＣＬ患者中另１例阳性；总检出率为６．６７％（８／１２０）。ＨＤ，ＮＨＬ及ＣＬ的阳性率分别为９．３８％，４．８８％和６．３８％。     

小鼠RAPD—PCR反应体系及扩增程序的筛选

筛选优化小鼠ＲＡＰＤ－ＰＣＲ反应体系及扩增程序。;方法以４０条引物对９个品系的小鼠基因组ＤＮＡ在各种不同条件下进行ＲＡＰＤ－ＰＣＲ,分析比较扩增结果。结论以上述反应体系及扩增程序进行小鼠ＲＡＰＤ－ＰＣＲ,扩增结果稳定。     

用PTVS检测t（14；18）PCR产物的DNA序列

为确定聚合酶链反应（ＰＣＲ）和地高辛（ＤＩＧ）系统检测ｔ（１４；１８）的特异性，我们采用ＰＧＥＭ－Ｔｖｅｃｔｏｒ系统（ＰＴＶＳ）和双脱氧链终止技术克隆并测定了ＲＬ细胞系和一个ＮＨＬ患者－Ａｍｂｒｏｓｅｎ的ｔ（１４；１８）ＰＣＲ产物的ＤＮＡ序列。结果表明两者的ＰＣＲ扩增产物均为ｂｃｌ－２－ＪＨ融合基因片段，证实ＰＣＲ－ＤＩＧ系统是一种特异的检测ｔ（１４；１８）的方法。同时还表明用ＰＴＶＳ对ＰＣＲ。产物进行克隆测序优于直接用双脱氧法测序。     

PCR─SSCP分析实验中的注意事项

ＰＣＲ─ＳＳＣＰ分析实验中的注意事项张学，姜莉，金春莲，孙开来，肖卫国（基础医学院医学遗传学教研室，第一临床学院内科）关键词聚合酶链反应；基因突变ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析，即聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物的单链构象多态（ＳＳＣＰ）分析，是ＰＣＲ扩增产物的单链...     

人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

抗2型登革病毒特异性免疫球蛋白重链可变区基因的扩增与纯化

提取抗２型登革病毒单克隆抗体杂交瘤细胞ｍＲＮＡ和ＤＮＡ反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和ＰＣＲ扩增并纯化特异性免疫球蛋白重链可变区（ＶＨ）基因。琼脂糖凝胶和聚丙烯胺凝胶电泳观察结果;该ＶＨ基因约４５０ｂｐ。实验证明,上述两种方法均是分离和扩增ＶＨ基因的有效方法,但提取ＤＮＡ后进行ＰＣＲ较提取ｍＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ经济,简单。     

一种检测异基因骨移植后供体植活的巢式PCR方法

目的 利用ＢＡＬＢ／Ｃ（Ｈ－２Ｋ＾ｄ）和Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２Ｋ＾ｂ）小鼠Ｈ－２Ｋ等位基因不同,建立一种检测异基因骨髓移植后供体植活的方法。方法 分别以供鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）和受鼠（Ｃ５７ＢＬ／６）及ａｌｌｏ－ＢＭＴ后小鼠骨髓和脾细胞ＤＮＡ为模板进行巢式ＰＣＲ,并用琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ扩增产物。结果 以供鼠和移植后小鼠骨髓和脾细胞ＤＮＡ行巢式ＰＣＲ可扩增了约４２１ｂｐ的特异性片段,而未经移植的Ｃ     

HIV-1基因限制性显示片段的克隆与序列分析

目的　克隆并分析经限制性显示－聚合酶链反应（ＲＤ－ＰＣＲ）扩增的ＨＩＶ－１基因片段。方法　将所有ＨＩＶ－１基因片段 分成１０组并进行ＲＤ－ＰＣＲ扩增,纯化各组ＰＣＲ产物后将之克隆至Ｔ载体上并快速鉴定。从阳性克隆中提取质粒,扩 增靶片段并测序。结果　序列分析表明,所扩增的片段均属于ＨＩＶ基因。结论　改良了一种多片段的克隆及鉴定方法并 用于限制性显示扩增片段的克隆。     

逆转录—半套式聚合酶链反应检测汉坦病毒RNA及其临床初步应用

目的：建立可用于汉坦病毒检测的ＲＴ－ＰＣＲ方法，并对其临床应用进行初步研究，方法：比较７６－１１８株和ＳＲ－１１株Ｓ基因序列，选择其保守区设计半套式引物，通过病毒培养上清及患者血清的扩增检测进行ＰＣＲ方法的敏感性，特异性及临床应用研究。结果所建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法可检出１．２５ＰＦＵ的病毒量；对照组（正常细胞培养上清和正常人血清）经扩增检测为阴性，８６份级ＩＦＡ检测抗ＨＶ－ＩｇＭ阳性的肾综合征出血     

沙眼衣原体基因分型及其应用

本文分别以沙眼衣原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｃｔ）隐蔽性质粒引物（Ｐｐ）及主要外膜蛋白基因（ｏｍｐ；）引物（Ｐｍ）．用ＰＣＲ扩增Ｃｔ特异性ＤＮＡ，并用单链构象多态性（Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｉｙｍｏｒｐｈ－ｉｓｍ，ＳＳＣＰ）作基因分型。４２６份标本中，９２例质粒ＰＣＲ阳性，用质粒ＰＣＲ阳性标本作ｏｍｐ：ＰＣＲ，６６例为阳性。其中５２例标本经ＳＳＣＰ分析显示７种不同的电泳图谱，１８例与标准株ＴＥ５５电泳图谱相同。其中两份标本分别取羊水及新生儿睑结膜，其ＳＳＣＰ图谱相同，表明两株Ｃｔ核酸序列完全相同。在分子水平上证实了Ｃｔ的垂直传播。临床标本可先采用敏感的质粒ＰＣＲ作初筛。阳性者再作ｏｍｐ１ＰＣＲ进行基因分型。应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ对Ｃｔ作基因分型，在分子流行病学研究中有重要意义。     

T—载体在聚合酶链反应扩增产物克隆中的应用

目的 探讨克隆聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增产物的简便方法。方法 用ＰＣＲ方法分别特异性扩增Ｗｉｌｍｓ瘤基因ｗｔ１和尿激酶受体（ＵＰＡＲ）基因,并利用Ｔａｐ聚合酶具有的延伸酶活性将扩增产物直接克隆入Ｔ－载体,ＥｃｏＲＩ酶切鉴定阳性重组子。结果设计的引物可分别扩增ｗｔ１基因锌指区（３４３ｂｐ）和ＵＰＡＲ基因编码区全长（１０８３ｂｐ）;未经修饰的常规ＰＣＲ和高保真ＰＣＲ扩增产物可被直接克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ     

RT-PCR半定量法检测人脐静脉内皮细胞t-PA和PAI-1 mRNA表达

目的 建立一种敏感的检测组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）及其抑制剂（ＰＡＩ－１）基因表达的方法。方法 用异硫氰酶胍一步法提取细胞总ＲＮＡ。用单管ＲＴ＿ＰＣＲ法逆转录－扩增ｔ－ＰＡ、ＰＡＩ－１和内参照三磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ，扩增产物经电泳分离后，用凝胶图像分析仪照相和扫描分析，测定各条带分子量和光密度值。结果 ＰＣＲ产物均与预期长度相吻合，且ＰＣＲ产一与扩增初始模板量之间存在良好的     

用聚合酶链反应快速检测痰液中结核杆菌

本研究以结核杆菌染色体中重复出现的长度为１２３个碱基对（ｂｐ）的ＤＮＡ片段作为聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增的模板，合成一对寡核苷酸引物。痰液标本先经三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ），乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ－２Ｎａ）和三硝基甲苯（Ｔｒｉｔｏｎｘ－１００）加热、震荡处理，裂解结核杆菌，再作ＰＣＲ扩增和琼脂糖凝胶电泳。同时，与痰液直接涂片、抗酸染色镜检抗酸染色阳性杆菌作比较。用该ＰＣＲ检测的检出率为９１．４％（３２／３５），而涂片抗酸染色的检出率仅为３４．３％（１２／３５）。两者相比有非常显著性差异（ｘ２＝２４．４７６，Ｐ＜０．００１）。由于改进了ＰＣＲ前痰液标本的处理方法，使整个ＰＣＲ检测过程所需时间缩短至９ｈ。我们认为该ＰＣＲ检测结核杆菌是特异、敏感和快速的，可在临床实验室应用。     

日本血吸虫大国大陆株副肌球蛋白编码基因的PCR扩增

根据已知的日本血吸虫菲律宾株的副肌球蛋白分子的部分ｃＤＮＡ序列，设计两对寡核苷酸引物（引物１／２和引物３／４），以聚合酶链式反应（ＰＣＲ），用引物１／２从本室两个日本血吸虫中国大陆株ｃＤＮＡ库中均扩增出与预期大小（９２７ｂｐ）一致的特定ＤＮＡ片断。巢式ＰＣＲ－以第一扩增产物为模板，用引物３／４扩增出约５０００ｂｐ的单一条带，与预期片段（４９４ｂｐ）大小一致。表明ＰＣＲ产物为编码副肌球蛋白的目的基因     

人白细胞介素－2基因真核表达载体pDORIL－2的构建

目的：构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆人表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ．结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆人ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２．结论：用ＰＣＲ扩增目的基因片断，有快速、获得量大、可改变酶切位点等优点；ｐＤＯＲＩＬ－２的构建成功，为开展基因治疗的研究打下了基础。