经IFN-γ诱导的人IL-2基因修饰的成纤维细胞体外免疫学特性的研究

早期的成纤维细胞介导的基因治疗多采用外源基因修饰成纤维细胞,旨在利用其作为表达目的蛋白的“工厂”,回输体内后表达一定水平的目的蛋白,而起到抗肿瘤作用.但这些研究往往忽视了成纤维细胞自身的功能,以往的研究表明,成纤维细胞经免疫激活剂或细胞因子诱导后.不仅分泌多种细胞因子而且在特定的条件下具有一定的抗原提呈作用.因此,我们采用IFN-γ诱导IL-2基因修饰的人原代成纤维细胞,对其体外生物学特性进行观察,采用含有人IL-2cDNA的逆转录病毒载体感染原代培养的人皮肤成纤维细胞,经G418筛选、扩增出表达hlL-2的成纤维细胞,置含有100U/ml IFN-γ的条件培养液中培养72小时,弃去培养液.调整细胞浓度至1×10~5/ml,继续培养24/小时,收集培养上清,     

IL-2、IFN-α和IFN-γ上调肾透明细胞癌786-0细胞B7-H1的表达

目的： 研究IL-2、IFN-α和IFN-γ对人肾透明细胞癌786-0细胞上B7-H1表达的影响。 方法： IL-2、IFN-α和IFN-γ刺激786-0细胞,RT-PCR检测刺激后786-0细胞B7-H1 mRNA的表达,免疫细胞化学、免疫荧光染色和流式细胞术检测刺激后786-0细胞中B7-H1蛋白的表达。 结果： RT-PCR检测结果显示,IL-2、IFN-α和IFN-γ组786-0细胞的B7-H1 mRNA表达量明显高于未经刺激的786-0细胞（0.75±0.06、0.68±0.05、0.95±0.08 vs 0.30±0.03,P﹤0.05或P<0.01）;免疫细胞化学和免疫荧光检测结果显示,B7-H1蛋白主要表达在786-0细胞的细胞膜上,IL-2、IFN-α和IFN-γ刺激后B7-H1表达明显上调;流式细胞术检测结果显示,IL-2、IFN-α和IFN-γ组786-0细胞的B7-H1分子表达阳性率明显高于未经刺激的786-0细胞\[（6570±326）%、（56.52±1.75）%、（84.05±3.52）% vs（20.49±1.03）%,P<0.01\]。 结论： IL-2、IFN-α和IFN-γ均上调786-0细胞B7-H1 mRNA和蛋白的表达,其中IFN-γ上调程度最高,IFN-α上调程度最低。     

IL-2、IFN-α、IFN-γ对肾透明细胞癌786-0细胞中B7-H4表达的影响

目的：探究IL-2、IFN-α和IFN-γ对人肾透明细胞癌786-0细胞B7-H4表达的影响。方法：IL-2、IFN-α、IFN-γ处理786-0细胞24 h后,RT-PCR法检测 B7-H4 mRNA的表达,ELISA法、免疫细胞化学法、流式细胞术检测B7-H4蛋白的表达。结果：RT-PCR结果显示,IL-2组（0.75±0.06）、IFN-α组（0.68±0.05）、IFN-γ组（0.95±0.08）786-0细胞中B7-H4 mRNA的表达均明显高于未处理组细胞（0.30±0.03）（P<0.05）。免疫细胞化学染色结果显示,于786-0细胞膜与细胞质均可检测到B7-H4蛋白表达,IL-2、IFN-α、IFN-γ处理均可增加786-0细胞B7-H4蛋白的表达。ELISA结果显示,IL-2组\[（44.89±0.97）ng/ml\]、IFN-α组\[（46.74±2.25） ng/ml\]、IFN-γ组\[(47.31±1.12) ng/ml\] 786-0细胞上清液中分泌型B7-H4的表达明显高于未处理组\[（34.42±1.69）ng/ml\]（P<0.05）。流式细胞术检测结果表明,IL-2组\[（44.89±0.94）%\]、IFN-α组\[（46.41±0.55）%\]、IFN-γ组\[（54.18±1.42）%\] 786-0细胞表面B7-H4蛋白的阳性表达率明显高于未处理组\[（30.45±0.96）%\]（P<0.05）。结论：IL-2、IFN-α、IFN-γ在转录与翻译两个环节均可上调786-0细胞B7-H4的表达水平,其中以IFN-γ上调能力最强。     

IFN-γ和IL-4对人乳腺癌细胞系MCF-7成瘤性、黏附能力的影响及其机制

目的：探讨Th1类细胞因子IFN-γ和Th2类细胞因子IL-4对MCF-7细胞的成瘤、黏附能力的调节作用及其相关机制。方法：常规体外培养人乳腺癌细胞系MCF-7。以前期工作中筛选出的以有效剂量rhIFN-γ（100 ng/ml）或rhIL-4（10 ng/ml）或细胞因子稀释液分别处理细胞96 h后,应用半定量RT-PCR法、Western blotting技术、双层软琼脂集落形成实验、细胞体外黏附实验等观察IFN-γ和IL-4对细胞VEGF表达、致瘤性和黏附侵袭特性的影响,并对其相关信号通路机制进行分析。结果： IFN-γ或IL-4可分别抑制或促进人乳腺癌细胞MCF-7的成瘤和黏附能力。分子机制研究表明,与对照组相比,rhIFN-γ可抑制MCF-7细胞VEGF、MMP-9的基因转录和蛋白表达水平,抑制Raf/MEK/ERK信号通路;rhIL-4可促进MCF-7细胞的VEGF、MMP-2和MMP-9的基因转录和蛋白表达水平,促进PI3K/AKT、Raf/MEK/ERK 信号通路激活。结论： 肿瘤微环境中,IFN-γ和IL-4可分别抑制和促进人乳腺癌细胞系MCF-7的VEGF表达和体外成瘤、黏附能力,其机制可能与PI3K/AKT、Raf/MEK/ERK 信号通路相关。     

IL-1β对人肺成纤维细胞增殖及MMP-2表达的影响

目的:建立人肺成纤维(HFL)细胞三维立体培养模型,探讨IL-1β对HFL细胞MMP-2表达及细胞增殖的影响。方法:采用HFL细胞建立三维立体培养模型,随即分成对照组与实验组,对照组用不含IL-1β的DMEM培养,实验组分别加入含不同浓度的IL-1β(10,20 ng/m l)的DMEM培养液,用倒置显微镜观察细胞的形态,培养24、72h后收集培养上清液,应用明胶酶谱法测各组MMP-2的表达情况;利用MMT比色实验观察IL-1β对HFL细胞增殖的影响。结果:观察三维胶原立体培养中细胞生长情况,HFL细胞均悬浮生长于胶原中,细胞在胶原内几乎不分裂,呈单细胞生长。各实验组的HFL细胞在不同浓度的IL-1β作用下,细胞表达的MMP-2有差异(P<0.05),且随着IL-1β浓度的增大,表达MMP-2的量增加。IL-1β可促进HFL细胞的增殖(P<0.05),且具有浓度及时间依赖性,随着IL-1β的浓度升高,其对HFL细胞促增殖的作用越明显。结论:IL-1β可能参与调节肺成纤维细胞合成和分泌MMP-2及细胞的增殖,从而促进肺癌的侵袭和转移。     

IL-1β对人肺成纤维细胞增殖及MMP-2表达的影响

目的：建立人肺成纤维（HFL）细胞三维立体培养模型,探讨IL-1β对HFL细胞MMP-2表达及细胞增殖的影响。方法：采用HFL细胞建立三维立体培养模型,随即分成对照组与实验组,对照组用不含IL-1β的DMEM培养,实验组分别加入含不同浓度的IL-1β（10,20 ng/m l）的DMEM培养液,用倒置显微镜观察细胞的形态,培养24、72h后收集培养上清液,应用明胶酶谱法测各组MMP-2的表达情况;利用MMT比色实验观察IL-1β对HFL细胞增殖的影响。结果：观察三维胶原立体培养中细胞生长情况,HFL细胞均悬浮生长于胶原中,细胞在胶原内几乎不分裂,呈单细胞生长。各实验组的HFL细胞在不同浓度的IL-1β作用下,细胞表达的MMP-2有差异（P〈0.05）,且随着IL-1β浓度的增大,表达MMP-2的量增加。IL-1β可促进HFL细胞的增殖（P〈0.05）,且具有浓度及时间依赖性,随着IL-1β的浓度升高,其对HFL细胞促增殖的作用越明显。结论：IL-1β可能参与调节肺成纤维细胞合成和分泌MMP-2及细胞的增殖,从而促进肺癌的侵袭和转移。     

成纤维细胞介导的IL-2及IL-6基因疗法增强常规瘤苗抗肿瘤作用的实验研究

研究表明，IL-2、IL-6单独或联合应用具有较强的抗肿瘤作用，但当大剂量使用时，却伴随着一系列毒副作用的发生，IL-6相对其它细胞因子具有毒性小功能广泛等优点，它能刺激T细胞的分化与增殖、诱导IL-2及IL-2R的表达，IL-2在免疫反应过程中也发挥了重要调节作用．其作用之一是能刺激杀伤性T细胞的增殖并增强其杀伤活性。     

IL-7与IL-2,PHA或/及αCD3联用诱导人外周血LAK细胞的协同和抑制作用的研究

本文将IL-7与IL-2,PHA或/及αCD3联用诱生PHA-LAK,CD3Ak和PHA-αCD3LAK细胞,观察IL-7对上述三种细胞的激活作用,为肿瘤的过继性细胞免疫治疗提供新思路.方法:应用活细胞计数的方法测定细胞增殖活性;应用MTT法测定外源性IL-2的消耗和细胞毒活性;应用APAAP法检测mIL-2R的表达和效应细胞表型等指标.结果发现,1.IL-7对效应细胞增殖活性的影响各组效应细胞增殖曲线均于第6天达增殖的峰值,但以IL-7 PHA-LAK细胞为最高,达2.22×10~6/ml,IL-7 CD3AK也高于其IL-7~-对照组,而IL-7 PHA-αCD3LAK细胞则最低,仅有1.49×10~6/ml.IL-7~ PHA-LAK和IL-7 CD3AK细胞扩增倍数也高于各自的IL-7~-对照组(P<0.01),IL-7 PHA-αCD3LAK细胞的扩增     

PD-L1抑制剂对非小细胞肺癌小鼠血清IL-4、IFN-γ及生存率的影响

目的:分析程序性细胞死亡蛋白配体-1（PD-L1）抑制剂对非小细胞肺癌（NSCLC）小鼠血清白细胞介素-4（IL-4）、干扰素-γ(IFN-γ)及生存的影响。方法:将20只重量16～20 g小鼠随机分为对照组、实验组各10只,对照组在制备NSCLC荷瘤鼠模型后注射0.9%氯化钠溶液,实验组在制备NSCLC荷瘤鼠模型后注射PD-L1抑制剂尼伏单抗,均连续注射4周,测定其体积大小、肿瘤抑制率与血清IL-4、IFN-γ变化,并记录小鼠生存率、生存时间。结果:注射前、注射3 d两组小鼠肿瘤体积比较差异无统计学意义（P>0.05）,注射1周、2周、3周、4周实验组肿瘤体积均低于对照组（P<0.05）,尤其在注射2～3周时实验组肿瘤体积抑制率基本达最大值;注射1周、2周、3周、4周实验组血清IL-4、IFN-γ水平明显高于对照组（P<0.05）;注射4周实验组生存率高于对照组,实验组平均生存时间较对照组长（P<0.05）,注射1周、2周、3周两组生存率比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:PD-L1抑制剂能抑制NSCLC小鼠生长,可能通过上调其血清IL-4、IFN-γ水平而延长小鼠生存时间。     

125I粒子植入联合TACE治疗原发性肝癌的效果及对患者IL-8和IFN-γ水平的影响

目的 探究125 I粒子植入联合TACE治疗原发性肝癌的效果及对患者IL-8和IFN-γ水平的影响.方法 选取原发性肝癌患者81例,随机分为观察组(n=41)和对照组(n=40).观察组接受125I粒子植入联合TACE治疗,对照组采用单纯TACE治疗.比较2组的临床疗效、治疗后血清IL-8和IFN-γ水平以及不良反应情...     

肿瘤相关成纤维细胞促进肝癌细胞HepG2生长及Wnt2基因的表达

摘 要：［目的］ 探讨肿瘤相关成纤维细胞(CAF)对肝癌细胞HepG2生长及Wnt2基因表达的影响。［方法］ 体外培养CAF并建立CAF与肝癌细胞HepG2相互作用体系,采用MTT法检测CAF 对肝癌细胞HepG2增殖能力的影响,qRT-PCR法与Western Blot检测CAF刺激导致的HepG2细胞中Wnt2基因与蛋白表达水平变化。［结果］ 通过MTT法检测CAF培养上清制备的条件培养基刺激HepG2细胞发现,与对照组相比,CAF上清刺激48h后能够明显促进HepG2细胞的增殖,96h OD490nm值达到最高（2.01±0.41,P<0.05）。qRT-PCR与Western Blot法检测CAF上清刺激后HepG2细胞中Wnt2表达发现,CAF上清能够在基因与蛋白水平增加Wnt2的表达,并明显高于对照组（P<0.05）。［结论］ CAF能够促进HepG2细胞的增殖,并且在基因与蛋白水平增加肝癌HepG2细胞Wnt2的表达。     

2-甲氧基雌二醇对瘢痕疙瘩成纤维细胞活性及Bcl-2和Bax表达水平的影响

目的 探讨2-甲氧基雌二醇(2ME2)对瘢痕疙瘩成纤维细胞活性及细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达水平的影响.方法 对6例胸部瘢痕疙瘩患者经手术切除的瘢痕疙瘩组织行成纤维细胞原代培养,取第3代细胞分为对照组(K组)、DMSO对照组(CTL组)及实验组(2ME2组),分别用常规培养基、含有0.7‰DMSO的培养基、含有6.975μmmol/L 2ME2+0.7‰DMSO的培养基进行培养,培养24 h后通过CCK8细胞活性试验和蛋白质印迹(Western Blot)法检测细胞活性及Bcl-2、Bax蛋白的表达水平.结果 细胞培养24 h后,2ME2组可见细胞凋亡形态,细胞膜内陷,细胞质成分减少.2ME2组的细胞活性为(50.40％±5.59％),明显低于K组的(99.12％±7.39％)和CTL组的(98.67％±3.78％),差异均有统计学意义(P﹤0.001).Western Blot结果显示,2ME2组的Bcl-2蛋白表达水平为(0.11±0.04),高于K组的(0.06±0.02)和CTL组的(0.07±0.01),差异均有统计学意义(P﹤0.05);2ME2组的Bax蛋白表达水平为(2.64±3.12),高于K组的(0.40±0.47)和CTL组的(0.54±0.50),差异均有统计学意义(P﹤0.05);2ME2组的Bcl-2/Bax比值为(0.08±0.06),明显低于K组的(0.61±0.62)和CTL组的(0.53±0.48),差异均有统计学意义(P﹤0.001).结论 2ME2能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性,提高Bcl-2和Bax的表达水平,降低Bcl-2/Bax的比值,促进细胞凋亡.     

转基因人胃腺癌细胞(MKN45/IL-2)的体外生物学特性及体内抗肿瘤作用研究

目的研究转hIL-2基因的人胃腺癌细胞(MKN45/IL-2)的体外生物学特性及小鼠体内抗肿瘤作用.方法以逆转录病毒PLXSN为载体,人白细胞介素2基因(hIL-2)为目的基因转染人胃腺癌细胞系,利用PCR技术对转染后的细胞进行检测并应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞IL-2的分泌量;利用MTT法绘制生长曲线;然后建立人胃腺癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型,以肿瘤体积、抑瘤率、生存期等指标观察MKN45/IL-2对移植瘤的抑制作用.结果转染后的MKN45肿瘤细胞体外生长能力无明显变化.24小时细胞培养上清IL-2的分泌量为100～200u/106细胞,体内实验表明MKN45/IL-2治疗组的移植瘤生长速度缓慢,体积明显小于生理盐水对照组(P＜0.05),生存期显著延长(P＜0.05).结论逆转录病毒介导的hIL-2转染的MKN45肿瘤细胞体外生物学特性未见明显变化,而体内实验显示具有明显的抗肿瘤作用.     

原发性肝癌患者索拉非尼联合TACE术治疗的有效性及对患者HIF-1α、VEGF、IL-10、IFN-γ的影响

目的 探讨原发性肝癌(HCC)患者索拉非尼联合经肝动脉化疗栓塞(TACE)术治疗的有效性及对患者低氧诱导因子-1α(HIF-α)、白介素细胞-10(IL-10)、干扰素γ(IFN-γ)及血管内皮(细胞)生长因子(VEGF)水平的影响.方法 选取120例HCC患者,依据不同治疗方法分两组,对照组应用TACE术治疗,研究组...     

ELL2在人成骨肉瘤中的表达及对MG-63细胞增殖的影响

目的:研究ELL2在人成骨肉瘤中的表达情况以及其对人成骨肉瘤细胞增殖的影响.方法:运用RT-PCR检测ELL2在人成骨肉瘤组织及其正常毗邻组织中的表达,RT-PCR及Western-blot检测ELL2在人成骨肉瘤细胞系及人正常成骨细胞系中的表达.构建ELL2过表达载体,MTT和细胞计数试验检测过表达ELL2对人成骨肉瘤细胞系MG-63增殖的影响.结果:ELL2在人成骨肉瘤组织中的表达显著低于其正常毗邻组织(P=0.001).ELL2在人成骨肉瘤细胞系中的表达相比于人正常成骨细胞系明显下调(P<0.05).过表达ELL2能够显著抑制MG-63细胞的增殖(P<0.05).结论:ELL2在人成骨肉瘤中表达下调,其过表达能够抑制肿瘤细胞的增殖.     

乳腺癌B7-H4异常表达及与肿瘤内CD8+T细胞浸润IFN-γ分泌的相关性研究

  目的  探讨B7同源体4(B7 homolog 4, B7-H4)在人乳腺癌组织的表达及其与肿瘤内CD4+T、CD8+T细胞的数量和IFN-γ细胞因子分泌的关系。  方法  应用S-P免疫纽织化学染色检测B7-H4在乳腺癌、癌旁组织和乳腺良性病变组织中的表达; 间接免疫荧光双标染色分析乳腺癌组织内浸润的CD4+T、CD8+T细胞数量及TGF-β1和IFN-γ分泌情况。  结果  B7-H4在乳腺癌、乳腺良性病变和癌旁组织的阳性表达率分别为75.0%、37.5%和25.0%, 三组间存在显著性差异(均P < 0.01);B7-H4阳性乳腺癌组织内浸润的CD8+T细胞及IFN-γ分泌细胞数量明显低于B7-H4阴性的乳腺癌组织(P < 0.05), 但B7-H4的表达与乳腺癌组织内浸润的CD4+T细胞及TGF-β1分泌细胞数量无关。  结论  B7-H4在乳腺癌中表达明显上调, 并与抑制CD8+T细胞浸润和分泌IFN-γ有关。B7-H4在下调乳腺癌抗肿瘤细胞免疫中具有一定作用。      

食管鳞癌组织环氧化酶-2表达与血管生成相关性的研究

目的:研究食管鳞状细胞癌组织中环氧化酶-2(COX-2)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)表达情况与食管癌病理特征的关系。方法:采用免疫组织化学(SP)法检测58例食管鳞癌组织中COX-2、b-FGF及CD34蛋白的表达。结果:58例患者食管鳞癌组织中,COX-2、b-FGF均高表达,阳性表达率分别为70.6%和75.9%,而MVD为46.71±11.65,COX-2、b-FGF蛋白表达与性别、分期、淋巴结转移无关(P均>0.05),COX-2、CD34与肿瘤的分化程度有关(P均<0.05)。COX-2与b-FGF表达及微血管密度(MVD)无相关(P均>0.05)。结论:COX-2、b-FGF在食管鳞癌组织中高表达,可能在食管癌的发生发展中起关键作用,两者联合检测对食管癌的诊断有一定价值。     

SCRN1在口腔鳞状细胞癌肿瘤相关成纤维细胞中的表达及对HSC3细胞株生物学特性的影响

目的:探究胞吐作用相关蛋白(SCRN1)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中的表达及对CAFs分泌MMP2功能的影响,进一步研究CAFs对HSC3细胞株迁移、侵袭能力的影响。方法:通过免疫组织化学染色(IHC)检测SCRN1在OSCC组织及癌旁组织中的表达。原代培养、分离、纯化、验证正常成纤维细胞(NFs)和CAFs,用免疫细胞化学染色法(ICC)、蛋白免疫印迹(WB)、qRT-PCR检测NFs、CAFs中SCRN1的表达情况。CCK-8、Transwell实验检测NFs、CAFs及CAFs-shSCRN1增殖、迁移及侵袭能力。收集NFs、CAFs上清并用ELISA和明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶2(MMP2)水平及活性,然后分别与HSC3细胞株共培养,探究两种上清共培养对HSC3细胞株迁移、侵袭能力的影响。沉默CAFs的SCRN1基因后,收集CAFs、CAFs-shSCRN1和CAFs-Vector上清并检测MMP2水平及活性,然后分别与HSC3共培养,探究三种上清培养条件对HSC3细胞株迁移、侵袭能力的影响。结果:SCRN1在OSCC组织中阳性表达率及表达水平...     

IL-6通过活化STAT3/Notch信号促进癌相关成纤维细胞衰老及宫颈癌上皮细胞侵袭与放疗抵抗的机理研究

背景与目的：肿瘤微环境中衰老的癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)介导上皮肿瘤的转移和放化疗抵抗,而CAFs分泌的炎性细胞因子IL-6可能促进宫颈癌的侵袭和放疗抵抗,但其作用机制并不清楚。该研究旨在探讨IL-6对CAFs衰老及宫颈癌上皮细胞侵袭与放疗抵抗的作用。方法：以宫颈癌CAFs、宫颈组织正常成纤维细胞(normal ifbroblasts,NFs)、宫颈癌细胞系HeLa、Siha和ME180为材料,采用IL-6、STAT3和Notch抑制剂处理不同细胞,用细胞染色、免疫荧光、蛋白[质]印迹法(Western blot)和流式细胞术等方法测定细胞衰老、STAT3、Notch信号、细胞侵袭能力和对放射线诱导的细胞凋亡变化。结果：CAFs条件培养基(conditioned medium,CM)或IL-6可以激活STAT3和Notch信号诱导细胞衰老或促进宫颈癌细胞的侵袭能力;CAFs与宫颈癌细胞混合培养能促进宫颈癌细胞的侵袭,但IL-6抗体、STAT3抑制剂S31-201或Notch抑制剂DAPT处理细胞则会抑制宫颈癌细胞的侵袭。IL-6/STAT3作为Notch信号的上游分子,可能主要通过自分泌或旁分泌的方式上调成纤维细胞或癌细胞中Notch信号关键配体Jagged-1而活化Notch信号,最后赋予宫颈癌细胞对放射线的抵抗作用。结论：CAFs在肿瘤微环境中可能通过IL-6/STAT3活化Notch信号诱导宫颈癌上皮细胞的侵袭和放疗抵抗,靶向STAT3/Notch信号相关分子有可能提高宫颈癌的放疗效果。