登革2型病毒04株基因组全序列的测定

目的 对我国登革２型病毒０４株（Ｄ２－０４）基因组进行全序测定及分析，为了解其基因组织结构与生物功能的关系及研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法 根据登革２型国际标准株ＮＧＣ的序列，设计１３对重叠引物，通过ＲＴ－ＰＸＣＲ扩增同Ｄ２－０４株不同的ｃＤＮＡ片段，分别克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体，转化受体菌ＤＨ５α，挑取阳性克隆进行ＰＣＲ、酶切鉴定及序列测定。结果 Ｄ２－０４株的基因组全长１０７２３个碱基，     

我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因免疫原性的研究

目的 构建含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因片段的真核表达质粒,观察重组质粒DNA的免疫原性,为登革多价疫苗的研究提供依据。方法 首先将包含我国登革2型病毒43株E蛋白Ⅰ/Ⅱ抗原区和4型病毒B5株E蛋白Ⅲ抗原区的嵌合E基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,通过测定确定嵌合基因序列的正确性。然后将重组质粒以肌肉注射途径,免疫Balb/C小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果 构建的含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因的真核表达质粒pcDNA-D2/4,经序列测定表明,导入的嵌合E基因片段的序列是正确的。将重组质粒DNA免疫小鼠,在初次免疫后的第3周,可同时检测到针对登革2型和4型病毒的特异荧光。结论 所构建的含有不同血清型的我国登革病毒株嵌合E基因片段的真核重组质粒,可诱导小鼠同时产生针对两个血清型病毒的特异抗体,该研究为新型登革多价疫苗的研制提供了依据。     

登革2型病毒全长cDNA克隆定点诱变的OL-PCR方法

目的 对带有登革2型病毒（DEN-2）全长cDNA的质粒pDVWS501上E62、E203位点进行定点诱变。方法 设计4对点诱变引物,运用OL-PCR（overlapPCR)法,扩增出分别在E62或E203位带有点突变的2条DNA片段,克隆至T载体,获T-TB62、T-TB203两个克隆,将T-TB62用ClaⅠ和SphⅠ分别酶切,T-TB203用SphⅠ NheⅠ酶切后,用T4连接酶分别连接至pDVWS501,获重组质粒TB62和TB203。对TB62和TB203进行序列测定。结果 成功得到分别在E62、E203位带有点突变的TB62、TB203克隆。结论 OL-PCR法是具有较高突变效率的定点诱变方法。     

登革2型病毒NGC株E基因扩增和部分序列分析

目的 体外扩增、克隆登革2型病毒（NGC株）包膜糖蛋白E基因约1．5kb的基因片段,并对目的基因片段进行部分碱基序列测定和分析。方法 采用逆转录聚合酶链反应扩增出E目的基因片段,经限制性内切酶Kpn1/Xbal酶切后用低熔点琼脂糖挖块回收法回收纯化,插入真核表达载体pcDNA3的多克隆位点,构建重组体pcDNA3-E,转化大肠杆菌DH5a,通过对目的基因片段的部分碱基序列测定鉴定克隆的正确性,并分析其氨基酸变异。结果 从登革2型病毒（NGC株）中扩增出约1．5kb的DNA片段,目的基因片段的部分测序与参考序列的同源性为96．53％,7个氨基酸发生变异,4个变异氨基酸与登革2型病毒Jamaica株相应位置的氨基酸相同。结论 体外成功扩增并克隆DV2（NGC株）全长E基因片段,其序列变异及与其他毒株的同源性研究为登革病毒致病机理和疫苗的研究提供材料。     

TT病毒的检测及部分核苷酸序列比较

目的 为阐明ＴＴ病毒（ＴＴＶ）流行病学特征和基因级异质性以及血清学诊断试剂的研制提供资料。方法 从健康查体者的血清中提取ＤＮＡ，设计一套引物，采用套式聚合酶链反应（ｎｅｓｔｅｌ－ＰＣＲ）检测ＴＴＶ，对其中７例阳性标本进行了克隆测序，并与２株ＴＴＶ的核苷酸序列作了比较。结果 １１１例正常人中ＴＴＶ的感染率为１２．６％。７株中国株ＴＴＶ间的核苷酸同源性为９０．６％～９５．４％，与日本株ＴＸ０１１（Ｏ）     

我国登革2型病毒E基因的克隆与表达研究

以我国登革２型病毒４３（Ｄ２－４３）株ＲＮＡ为模板，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了Ｅ基因。扩增的ｃＤＮＡ片段约１２９０ｂＰ， 与预期大小相一致，经ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实了Ｅ基因片段的特异性。将Ｅ基因的扩增片段首先克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐtⅡＫＳ~＋质粒ＤＮＡ中，利用重组子中载体的酶切位点，将该基因片段再克隆到高效表达载体ｐＢＶ２２０中。用ＰＣＲ技术从２０个重组子中筛选出６个阳性克隆　，经ＳａｌⅠ和ＰｓｔⅠ酶切进一步鉴定，证明这６个重组质粒中均含有Ｅ基因片段。采用温控诱导，４小时表达的蛋白量约占菌体总蛋白的２０％。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明，表达的蛋白可与该病毒株的多克隆腹水抗体和登革２型病毒标准株的单克隆抗体起特异反应。     

登革2型病毒43株膜蛋白前体基因片段的克隆与表达

依照国际标准株ＮＧＣ的序列，设计合成了一对引物，用于扩增登革２型病毒中国分离株Ｄ２－４３的ＰｒＭＣ端抗原区的基因片段，结构分析及特异性分析的结果表明引物合乎要求，反转录（ＲＴ）－ＰＣＲ扩增出一３８５ｂｐ的目的片段，经ＨａｅⅢ酶切得到２１９、１６６ｂｐ的两条预期片段，表明ＲＴ－ＰＣＲ扩增出ＰｒＭ基因片断。扩增产物经ＢａｍＨＩ酶切后插入经ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＥｘ１中，转化ＭＣ１０６１菌，表达与β－半乳糖苷酶的融合蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明有一约１３０ｋＤ的目的蛋白带，表达量占菌体总蛋白的３０％，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及ＥＬＩＳＡ结果表明表达产物能与Ｄｅｎｇｕｅ－２多抗血清结合，为ＰｒＭ的免疫学及生物学性质研究打下了基础。     

抗登革3型病毒单链抗体的可溶性表达和鉴定

目的为解决鼠源性单克隆抗体用於临床会引起变态反应等负作用问题，试图从基因水平上对登革３型病毒鼠源性单抗进行人源化改造以减少其鼠源性。方法选用对登革病毒４个血清型及部分黄病毒具有中和活性的抗登革３型病毒单克隆抗体３Ｄ３的轻重链可变区基因，通过反转录和聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩，扩增后的轻重链可变区ＰＣＲ产物通过连接引物连接成单链抗体基因，然后与噬菌体载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ连接，转化大肠杆菌ＨＢ２１５１，使单链抗体以可溶性的形式表达在上清液中。结果通过免疫荧光和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明，可溶性表达的单链抗体能与登革３型病毒抗原发生特异性结合，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中在２８ｋＤ处有一条带和单链抗体的分子量大小一致。结论表达产物与原单抗３Ｄ３一样，具有与登革３型病毒抗原结合的特性。     

我国登革2型病毒prM基因与甲病毒载体重组RNA的构建

目的 将我国登革２型病毒的ｐｒＭ（Ｄ２－ｐｒＭ）基因导入甲病毒载体（ＰＳｆＶ）,研究该基因及其编码蛋白介导的抗病毒作用。方法 首先将扩增的病毒ｐｒＭ基因导入ｐＳｆＶ的Ｓｐ６启动子下游并进行核苷酸序列测定。用ＳｐｅⅠ酸将ｐＳｆＶ－ｐｒＭ重组ＤＮＡ线形化,再将其体外转录成５’末端含帽子结构的重组ＲＮＡ。然后通过电穿孔法将此重组ＲＮＡ转染ＢＨＫ－２１／１３细胞。采用Ｘ－Ｇａｌ原位染色和免疫荧光法对转染细     

登革2型病毒海南分离株全长E基因的测定与分析

目的 测定我国登革2型病毒海南分离株E基因的全序列，并分析其病毒学特性和分子进化特征。方法 运用RT-PCR法扩增我国登革2型病毒海南分离株D2V—HN89)E基因，测序并用计算机分析序列，作毒株感染细胞及乳小白鼠试验。结果 D2V-HN89株E基因核苷酸全长1464bp，核苷酸和氨基酸序列与D2V—NGC株的同源性分别为95％和980A，系统树分析显示其与登革2型牙买加株及登革2型巴西90株的亲缘关系最近。D2V—HN89株的细胞病变效应与D2V—NGC株相同，但对乳小白鼠神经毒力较弱。结论 D2V-HN89株的E基因区有缺失，该流行毒株可能来源于牙买加或巴西登革热流行区。     

登革2型病毒广东流行株结构蛋白基因序列测定及分析

目的 对广东省90年代以来流行的3株登革2型病毒(DEN2)的结构蛋白基因序列测定及分析，了解流行株之间的相互关系、变异及基因型：方法 应用RT-PCR技术扩增广东省不同年份流行的3株DEN2型病毒的结构蛋白基因(C、PrM、E基因)。分别克隆到pMD18T载体，转化JM109宿主菌，挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定。结果 3株DEN2病毒结构蛋白基因序列长度均为2325bv，编码775个氨基酸。三者核苷酸(氨基酸)的同源性分别是：GD06／93与GD19／2001为96％(97％)、GD06／93与GD08／98为94％(97％)、GD08／98与GD19／2001为92％(94％)。其在相关毒力位点E383～385处均为GLU—PRO-GLY、E126处均为GLU。3株DEN2与国际参考株比较表明：GD06／93与GD19／2001和澳大利亚TSV01株共享序列非常接近，核苷酸(氨基酸)的同源性为98％(98％)；GD08／98与泰国株ThNH-P28／93核苷酸(氨基酸)同源性为98％(98％)。此3株DEN2二级结构与对乳鼠不致病的04株比较，主要差别位于其393～400氨基酸处，本室分离的3株对乳鼠致病毒株为EEEEHHHH，而04株为EEEE----；337～343处本室分离的3株对乳鼠致病毒株为HH-------HHHHH，而04株为--------HHHHE-，恰好位于Dengue病毒E基因的Ⅲ区：结论 GD06／93、GD19／2001与TSV01亲缘关系较近，属同一基因型。GD08／98与ThNH—P28／93共享序列非常接近，属同一基因型。3株DEN2病毒在E蛋白Ⅲ区结构有一定变异，可能与毒力有关。     

我国2型登革病毒NS1基因的克隆及部分碱基序列的测定

将我国登革２型病毒株ＮＳ１基因的聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增片段直接克隆到Ｔ－载体ＤＮＡ中。用限制性内切酶分析经蓝／白斑筛选和ＰＣＲ鉴定的阳性克隆的ＤＮＡ，证明插入片段与扩增的ＮＳ１片段的大小一致。用双脱氧链末端终止法测序结果表明，ＮＳ１基因扩增片段５’端的部分碱基序列并未发生改变。     

登革2型病毒NS3基因的酵母表达及其免疫反应性的测定

目的克隆登革2型病毒(DEN2)NS3基因并用酵母真核表达,获得全长的重组NS3蛋白质,为其结构与功能的研究提供条件。方法从感染DEN2(NGC株)后病变的C6/36细胞上清液中提取RNA,通过RTPCR扩增NS3基因片段,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P.pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut 菌诱导表达,SDSPAGE检测表达产物。结果RTPCR得到1.85kb的NS3基因片段,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长NS3基因;Mut 酵母转化菌可分泌表达Mr约78000的蛋白质,与DEN2多抗和登革2型病毒患者恢复期血清的免疫印迹证实它为型特异的重组NS3蛋白质。结论成功将克隆的全长DEN2NS3基因在酵母菌中表达,获得的重组NS3蛋白质具有免疫反应性。     

我国三株登革Ⅱ型病毒分离株包膜蛋白基因变化的…

本文报告了我国登革Ⅱ型病毒３个分离 株（０４、０５和４３株）包膜蛋白基因的核苷酸序列及推断的氨基酸序列。并通过美国ＭＡＣＡＷ微机程序对３株之间的核甘酸与氨基酸序列进行了比较分析，并分别与其它Ⅱ型毒株进行比较，发现０４、０５和４３株核苷酸序列同源性为９５．７６％～９５．９６％，它们之间无明显差别。氨基酸类似性为９２．１２％～９４．３０％，氨基酸类似性略低于核苷酸序列同源性。通过变化的核苷酸在三联密码     

新分离的无乳鼠神经毒力的登革2型病毒福建株基因组结构特征的研究

目的 测定对乳鼠不致病登革2型病毒福建株（DEN2－FJ11）全基因组序列，探讨其基因组结构与功能关系。方法 采用RT－PCR和5′、3′端RACE方法测定病毒基因组的全序列，并运用DNASTAR软件的Clustal法将该毒株的序列与其它6株登革2型病毒进行比较，分析其进化关系。结果 DEN2－FJ11株基因组全长10723个核苷酸，含有1个单一的读码框架，编码3391个氨基酸。5′、3′端非编码区（NCR）长度分别为96和454个核苷酸。DEN2－FJ11与同时分离的对乳鼠致病的FJ10株之共有32个核苷酸不同及13个氨基酸的变化，其中8个氨基酸是其极性或电荷的改变。3′端非编码区134位的单个核苷酸变化导致其二级结构改变。DEN2－FJ11与FJ10株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.7%和99.6%，这2株病毒与印度尼西亚株亲缘关系最近，同为Ⅳ基因型。结论 DEN2－FJ11株基因组与FJ10株及其它登革2型病毒株类似。位于病毒编码区的8个氨基酸差异及3′端非编码区134位的核苷酸可能与病毒的乳鼠神经毒力有关。     

白纹伊蚊干燥卵保存登革2型病毒的实验研究

感染登革2型病毒的白纹伊蚊卵在(25±1)℃、光照14h/天,75%±5%RH的相对干燥环境中保存42天,分别采用C6/36细胞培养分离病毒和RT-PCR方法,检测卵孵化的F1代蚊虫感染率。第1个生殖营养周环F1代蚊虫未检测和分离到病毒,PCR检测第2生殖营养周环蚊虫批阳性率为26.7%,最低感染率为1∶112.5;第3生殖营养周环蚊虫批阳性率为27.8%,最低感染率为1∶108。统计学检验结果表明第2和第3生殖营养周环卵孵化的F1代蚊虫感染率没有达到显著性水平(P>0.05)。结果表明感染白纹伊蚊卵在75%±5%RH的相对干燥环境中保存42天后,能在孵化的子代蚊虫中检测和分离到病毒,证实伊蚊卵在干燥环境中能够保存卵内病毒。