新疆细粒棘球绦虫DNA限制性酶切片段长度多态性的初步分析

应用光敏生物素标记细粒棘球绦虫特异性DNA探针pEG18,对新疆5个不同地区绵羊、1例肝包虫病人、阿勒泰地区牛细粒棘球绦虫原头节以及羊源、牛源细粒棘球绦虫成虫DNA进行限制性酶切谱和Southern杂交分析。牛源、羊源样本经EcoRI酶切后产生的杂交图型基本上是一致的。BamHI酶切后产生的杂交结果,在新疆5个不同地区绵羊感染的细粒棘球绦虫没有发现差别,而人源和牛源细粒棘球绦虫DNA产生的杂交图型与绵羊源细粒棘球绦虫DNA产生的杂交图型大体上是一致的,但又存在着各自的差异。与绵羊样本相比,人源细粒棘球绦虫产生的杂交图型约在8.3kb处明显可见一条杂交带,而牛源细粒棘球绦虫约在3.5kb处有一条清晰的杂交带。这些差异的意义有待进一步研究。用光敏生物素代替同位素标记DNA探针,简便易行,稳定可靠,可取得满意的结果,在边远的地区是一种值得推广的方法。     

细粒棘球绦虫DNA探针PHD5特异性的研究

从构建的细粒棘球绦虫基因库中〔１〕我们筛选到一个细粒棘球绦虫特异的ＤＮＡ片段ｐＨＤ５，该片段长约３．６ｋｂ，亚克隆于ｐｈａｇｅｍｉｄ载体ｐＢＳＳＫ〔２〕，Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交分析表明它不与多房棘球绦虫ＤＮＡ杂交〔３〕。本文对此探针是否与其他绦...     

青南高原细粒棘球绦虫mtDNA基因多态性分析

目的与方法为了全面掌握青南高原细粒棘球绦虫的种内变异,我们首次应用mtDNA的coxI基因,nadI基因和atp6基因检测了55个细粒棘球绦虫分离株（37个人体分离株,18个动物分离株）的基因多态性。结果研究结果显示,所检测的55个细粒棘球绦虫分离株与GenBank中检索到的普通羊株（G1型）基因同源性达到90%以上,均为普通羊株（G1型）。将mtDNA相加（共1 327bp）后得到了13个基因型,均被GenBank收录。结论1）55个细粒棘球绦虫分离株均为普通羊株（G1型）;2）结果所得的13个基因型中,既有世界上广泛分布的,也有本研究首次报道的,充分说明青南地区细粒棘球绦虫具有广泛性和普遍性的流行病学特征,青南高原特殊地理环境和气候条件导致细粒棘球绦虫的特殊的核苷酸变异。     

青海不同株细粒棘球绦虫成虫的超微结构研究

运用透射电镜和扫描电镜分别观察了青岛海高原牦牛和藏羊源原头蚴感染犬后细粒棘球绦虫成虫的超微结构。结果表明两源细粒棘球绦虫成虫的表面结构和皮层结构相似。这些形态结构特点与文献报道明显不同，提示青海高原存在不同株的细粒棘球绦虫。     

分泌抗细粒棘球绦虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

为了对包虫病的免疫诊断和免疫预防提供有价值的单克隆抗体,通过对骨髓瘤细胞SP2/0与用细粒棘球蚴囊液免疫的BALB/c小鼠脾细胞融合试验及多次筛选、克隆,建立了分泌单克降抗体的细胞株NIA_2。用ELISA及免疫电镜等方法检测证实该细胞株有特异性。其培养上清分泌抗体滴度为1:2560,注入同系小鼠腹腔,诱生肿瘤和滴度为1:163840的腹水。免疫球蛋白鉴定表明是IgG_1,未见对囊虫的阳性反应。该杂交瘤细胞株经组织培养传代10个月,分泌抗细粒棘球绦虫抗体性能稳定。     

细粒棘球绦虫EG95基因的克隆和序列分析

目的：获得细粒棘球蚴EG395基因序列资料，进行序列分析，为研究包虫病疫苗候选抗原基因奠定基础。方法：从包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴(protoscoleces)，提取RNA和DNA，用特异引物分别以基因组DNA和cDNA为模板扩增EG95基因；并将其克隆到T载体后进行序列测定和分析。结果：以基因组为模板获得一个基因。长度为1253bp，以cDNA为模板获得两个基因，长度分别为1121bp和833bp；同源性比较结果表明：来自新疆羊源EG95基因序列和澳大利亚羊源EG395-2基因同源性为98％，有13个碱基变异；从cDNA获得的EG95基因(EG95-like)和DNA来源的EG95相同，只是EG95序列的一部分；从cDNA获得的另一个EG95基因(mEG95)和澳大利亚源EG395-2同源性为99％，有2个碱基不同。分析表明EG95是一个基因家族，可能是虫体发育到六沟蚴阶段特定表达的基因。结论：EG95是一个基因家族，进一步研究该基因家族的结构和功能对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

DNA探针用于鉴别细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫的研究

用DNA探针pHD5、pEG18、pSM889 对我国细粒棘球蚴与多房棘球蚴通过限制性内切酶 BamHI与 EcoRI 酶解后用 Southern 转移杂交法进行了虫种鉴别。该方法敏感、特异,尤其对在光镜下无法区分的标本更具有鉴别的优越性。它能够用于包虫病流行病学基线调查及监测,为包虫病的防治提供准确的依据。     

四川与宁夏两地区泡球蚴基因组DNA酶切片段长度多态性的初步分析

本文应用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ完全消化四川、宁夏两地泡球蚴基因组ＤＮＡ，分析其酶切片段长度差异。经ＥｃｏＲⅠ酶切后四川泡球蚴的特有条带为７．９ｋｂ、６．８ｋｂ、５ｋｂ，宁夏泡球蚴的特有条带为８．９ｋｂ和７．１ｋｂ，表明两地泡球蚴重复ＤＮＡ核苷酸序列有明显差异。     

人源细粒棘球蚴染色体测定

为鉴定棘球地细胞系及棘球绦虫的遗传分类提供依据，本实验测定了人源细粒棘球拗染色体。从外科手术的包虫病人体内获取棘球蚴原头节和生发层细胞，按染色体的常规制备方法并加以改进，制备染色体标本。通过对141个分裂像的观察分析，结果表明细粒棘球蚴染色体组的染色体数在5～20条之间，14～18条占明显优势。每一核型有一对染色体呈大棒状，似呈中间或亚中着丝粒，其余染色体呈方点状，似呈端着丝粒。本实验建立了适合棘球蚴染色体制备的方法，在国内首次测定了人源细粒棘球蚴染色体。     

PCR与DNA杂交技术在细粒棘球蚴诊断方面的实验研究

目的探讨聚合酶链反应(PCR)技术在细粒棘球蚴检测和诊断中的应用,建立DIG标记DNA杂交诊断技术.方法根据细粒棘球蚴基因片段克隆与序列分析,设计了一对特异性引物,P1 5'-GGAATGGAGAGAAGTTAC-3' P2 5'-GCAACCTCCGGAACTTGC-3'.以棘球蚴的囊液、子囊及原头蚴为模板,经PCR扩增获得471 bp特异性区带.将扩增产物纯化后,用DIG标记DNA,将制备成的特异性核酸探针用于细粒棘球蚴检测.结果经对大肠杆菌、粪肠杆菌、结核分支杆菌、猪囊尾蚴、健康人白细胞进行PCR扩增和DIG标记DNA探针斑点杂交,只有细粒棘球蚴出现单一471 bp特异性区带. PCR的灵敏性为检出单个原头蚴及100～10 fg水平的DNA,而斑点杂交的敏感性为2 500 fg.异源性DNA即使提高点膜量,亦不出现阳性反应.结论配以DIG标记的PCR技术在细粒棘球蚴的检测中具有特异、敏感、快速、准确的特点.为包虫病的早期诊断和流行病学调查提供了科学依据.     

新疆细粒棘球蚴95基因的克隆及同源性分析

目的　分析新疆地区细粒棘球蚴 95 (EG95 )基因结构特点。　方法　从新疆地区细粒棘球蚴原头节中提取基因组 DNA,以细粒棘球蚴原头节 DNA为模板进行 PCR扩增 ,获得 EG95基因 ,将其克隆至 p UCm- T载体 ,利用 DNAman软件及 Gene Bank/BL AST功能测序并对其进行基因全序列分析。　结果　测序显示新疆株 EG95 (EG95 - XJ)基因片段为 1191bp。 BL AST比对分析表明 EG95 - XJ基因与新西兰株 EG95基因家族成员同源性达 86 %～ 97% ,所有的碱基差异均发生于内含子区域。　结论　中国新疆地区的 EG95基因为 EG95基因家族成员之一 ,但其序列与新西兰株 EG95基因之间存在一定的差异。     

酯酶同工酶鉴定细粒棘球蚴细胞系(13G-5)种属来源

目的　鉴定细粒棘球蚴细胞系细胞的种属来源。方法　应用SDS凝胶电泳测定细粒棘球蚴细胞系酯酶同工酶 (EST) ,并和E granulosus原头节、囊液及包虫病人血清作比较。结果　细粒棘球蚴细胞系、E granulosus原头节、囊液含有相同的酯酶同工酶谱 ,在同一位点出现相同的一条酶带。结论　实验结果表明从包虫病人培育的 13G - 5细胞确系来源于E granulosus细胞。     

小鼠细粒棘球蚴不育囊的超微结构观察

用透射电镜观察了小鼠细粒棘球蚴不育囊的超微结构。其囊壁由角皮层和生发膜构成,角度层含有纤维基质和不规则形颗粒,生发膜又可分皮层区和细胞区。在皮层区基部见到线粒体,微毛间见到“吞饮泡”样质膜凹陷;在细胞区主要有皮层细胞、肌细胞、含糖原细胞等,在有的含糖原细胞中还见到“核仁管系统。”     

细粒棘球蚴生发细胞体外培养的实验观察

目的 :为培育人源细粒棘球蚴细胞系 (株 ) ,以供用于免疫预防研究。方法 :用外科方法从临床确诊的细粒棘球蚴患者的肝脏中取出包囊 ,以生发层和原头节为培养材料 ,采用RPMI1640、199和改良 DMEM培养液 ,用鼠尾胶原蛋白包被和不包被的培养瓶 ,对其进行初培养 ,并进行对比观察。结果 :以胶原蛋白作为支撑材料 ,应用改良 DMEM培养液培养的人源细粒棘球蚴生发层和原头节效果优于其他 ,已成功地培育了人源细粒棘球蚴细胞系 ,并传至第 2 0代。原代培养时间需 2 8d- 4 5d,3代以内细胞为多形态性。结论 :建立了适合人源细粒棘球蚴细胞体外培养的方法。     

细粒棘球蚴生发细胞体外培养的实验观察

目的 :为培育人源细粒棘球蚴细胞系 (株 ) ,以供用于免疫预防研究。方法 :用外科方法从临床确诊的细粒棘球蚴患者的肝脏中取出包囊 ,以生发层和原头节为培养材料 ,采用RPMI1640、199和改良 DMEM培养液 ,用鼠尾胶原蛋白包被和不包被的培养瓶 ,对其进行初培养 ,并进行对比观察。结果 :以胶原蛋白作为支撑材料 ,应用改良 DMEM培养液培养的人源细粒棘球蚴生发层和原头节效果优于其他 ,已成功地培育了人源细粒棘球蚴细胞系 ,并传至第 2 0代。原代培养时间需 2 8d- 4 5d,3代以内细胞为多形态性。结论 :建立了适合人源细粒棘球蚴细胞体外培养的方法。     

新疆北部双峰驼细粒棘球蚴感染调查

目的：确定我国双峰驼中细粒球蚴的感染状况和寄生特征。方法：在屠宰场检查来自新疆北部各地骆驼体内的感染情况。测量棘球蚴囊的大小，检查内容物的性质并镜检有无原头节。结果：在３７５只骆驼中检出细粒棘球蚴感染者１８５只，感染率４９．３％。主要寄生在肝和肺，肝内较多，肝∶肺＝１∶０．６４。育囊携带率３４．８％，育囊率３９．２％， 囊指数７．５３。棘球蚴囊位于肝表面，单个存在，囊壁较薄，内无子囊。育囊平均直径在肝为５．６±２．５６ｃｍ，在肺为４．８±２．０３ｃｍ，钙化率高，单纯携带钙化病灶的骆驼占感染骆驼的６４．３％。结论：新疆北部双峰驼细粒棘球蚴的感染率很高。其寄生特征与本地区牛、羊中的细粒棘球蚴有明显区别，与非洲单峰驼亦有不同，应进一步深入研究。