奥美拉唑逆转人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP耐药性的研究

目的:探讨液泡ATPase[vacuolar (H+)-ATPase, V-ATPase]非特异性抑制剂奥美拉唑(omeprazole ,OME)逆转人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的耐药性及可能的作用机制.方法:以非细胞毒性浓度4 μg/mL的OME预处理A549/DDP细胞24 h,再用2 μg/mL顺铂(cisplatin, DDP)处理 A549/DDP细胞.MTT法检测细胞的增殖抑制率,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)法间接检测细胞内pH值的变化,FCM法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和PTEN的表达,RT-PCR法检测V-ATPase 、Bcl-2和PTEN mRNA的表达.结果:OME具有逆转A549/DDP细胞耐药性的作用,逆转倍数为1.45 (P<0.01);OME预处理后A549/DDP细胞内pH值明显降低,Bcl-2蛋白表达下降,PTEN蛋白表达增加(P<0.01).V-ATPase在亲本A549及A549/DDP细胞中相对表达量分别为0.88±0.00和0.99±0.00 (P<0.01);A549/DDP细胞中V-ATPase在有无OME预处理的情况下的相对表达量分别为1.09±0.00和1.05±0.02,差异无统计学意义.Bcl-2 mRNA相对表达量下降(P<0.01),PTEN mRNA相对表达量增加(P<0.01).结论:V-ATPase在A549/DDP细胞中高表达,OME能部分逆转A549/DDP耐药性,其作用机制可能与上调PTEN和下调Bcl-2 表达有关.     

人肺腺癌A549/DDP耐药细胞减弱顺铂诱导的细胞凋亡

目的：探讨人肺腺癌Ａ５４９／ＤＤＰ耐药细胞的多药抗药机理。方法;应用形态学观察、琼脂糖凝胶电泳、原位ＤＮＡ断裂点的末端标记法观察细胞亡的状况,用免疫组化法检测ｂｃｌ－２基因的表达。结果：癌细胞在顺铂作用下产生了典型的凋亡形态学改革。３μｇ／ｍｌ,５μｇ／ｍｌ,７μｇ／ｍｌ顺铂作用４８小时,Ａ５４９细胞ＤＮＡ裂解片断呈现典型的阶梯状排列条喧,而在５μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ顺铂作用４８小时,Ａ５４９／     

细胞因子诱导的杀伤细胞逆转耐顺铂肺腺癌细胞系A549/DDP耐药性的研究

  目的  观察细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK)对耐顺铂(DDP)人肺腺癌细胞系A549/DDP的耐药逆转作用及其逆转A549/DDP耐药的可能机制。  方法  A549/DDP与CIK细胞采用Transwell非接触共培养。四氮甲唑兰比色法(MTT法)验证A549/DDP的DDP耐药性及检测共培养前后A549/DDP对DDP耐药性的变化。RT-PCR法筛选A549与A549/DDP有差异表达的基因作为检测耐药性变化的观察指标, 并检测共培养前后A549/DDP中基因表达水平的变化; Western blot检测A549及共培养前后A549/DDP中基因蛋白水平的变化。  结果  A549/DDP的耐药系数为14.5, 具有较强的DDP耐药性。RT-PCR筛选出A549与A549/DDP表达有差异的耐药相关基因为谷胱甘肽转移酶(glutathione-S-transferase, GST-π)基因、人类铜离子转运蛋白(human copper transporter1, hCTR1)基因, A549/DDP中GST-π表达量明显增加, hCTR1表达量明显降低。与CIK细胞共培养后, A549/DDP对DDP的耐药性明显下降, 共培养20h后耐药逆转倍数约为4.93倍, 细胞内GST-π基因及蛋白水平的表达明显降低(P < 0.05)。  结论  CIK细胞对A549/DDP有逆转DDP耐药的作用, 其机制可能与下调GST-π基因及蛋白水平的表达有关。      

CIK分泌的细胞因子对逆转耐顺铂肺腺癌细胞系A549/DDP耐药性的研究

  目的   探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK) 分泌的细胞因子在逆转耐顺铂(DDP) 人肺腺癌细胞系A549/DDP顺铂耐药性中的可能作用。   方法  采用transwell非接触共培养CIK与A549/DDP细胞, 收集不同时间点的共培养上清, 酶联免疫试剂方法(ELISA) 检测IFN-γ、TNF-α、IL-2的分泌情况, 四氮甲唑兰比色法(MTT法) 检测DDP耐药性的变化, 实时定量PCR检测GST-π基因表达水平的变化。   结果  分析发现A549/DDP细胞的耐药逆转与IFN-γ的分泌水平显著相关, 与TNF-α、IL-2的分泌量无显著相关。给予anti-IFN-γ中和抗体后, 共培养20h A549/DDP的DDP耐药性显著上升(P < 0.05), GST-π基因水平的表达量较未加中和抗体组也显著增加(P < 0.05)。而加入anti-TNF-α、anti-IL-2中和抗体组, A549/DDP细胞的DDP耐药性及GST-π基因水平的表达量较未加入中和抗体组无明显变化(P > 0.05)。   结论  CIK通过分泌IFN-γ下调A549/DDP细胞中GST-γ的表达来实现其逆转DDP耐药的作用。      

克隆肺腺癌亲代细胞A549与耐顺铂细胞A549^DDP耐药相关基因的差异表达片段

目的：克隆肺腺癌耐药相关基因。方法以mRNA差异显示法技术检测耐顺铂肺腺癌细胞A549^DDP及其亲代细胞A549基因表达的差异。差异表达基因片段段被克隆并经Northern blot证实。结果获得4个基因表达的差异cDNA片段,经测序,同源性分析,其中2个片段（A1、D1）在GeneBank中未发现同源序列,一个片段（A2）与白介素－1β转化酶（Interleukin 1 β怀脲,ICE）89％同源性,一个片段（D2）与MM45s rRNA(Mouse musculus 45s pre-rRNA)基因100％同源。A1、A2cDNA片段仅表达于A549细胞,D1、D2cDNA片段仅表达于A549^DDP细胞。结论应用mRNA差异显示技术获得4个肺腺癌A549与A549^DDP间的基因差异3表达片段。2个新的差异表达片段以及与ICE、、MM45sRNA高度同源的基因片段是否与耐药相关尚需进一步研究。     

核酶对人肺腺癌细胞多药耐药的逆转

目的 探讨针对多药耐药基因（ｍｄｒｌ）的核酶对肺腺癌细胞多药耐药的逆转作用。方法以ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ ８８０位点为靶位点,通过脂质介导,将抗ｍｄｒｌ核酶表达质粒（ｐＨ β Ａｐｒ－ｌ ｎｅｏ／ｍｄｒｌ－Ｒｂ）导入肺腺癌耐药细胞株Ａ５４９／Ｒ。分别采用ＲＴ－ＰＣＲ、流式细胞仪检测术、罗丹明聚集及ＭＴＴ方法,观察细胞的ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ、Ｐ糖蛋白（Ｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ,Ｐｇｐ）表达和对阿霉素敏     

顺维甲酸体外诱导肺腺癌细胞A549凋亡的研究

目的:探讨9-顺维甲酸(9-cis-RA)对人肺腺癌细胞A549的诱导凋亡作用。方法:体外培养肺腺癌细胞株A549,用MTT法观察9-cis-RA对细胞的生长抑制作用,采用电镜、流式细胞仪等方法检测9-cis-RA对细胞的诱导凋亡作用。结果:9-cis-RA对A549细胞有生长抑制效应,抑制率随着9-cis-RA浓度、作用时间的增加而增加。9-cis-RA明显诱导A549细胞的凋亡,可观察到凋亡小体和凋亡峰,药物作用48h后,9-cis-RA浓度为5、10μmol/L的细胞凋亡率分别为7.2%和13.3%,细胞凋亡率呈现量效关系。结论:9-cis-RA可能通过诱导肺癌细胞凋亡抑制肺癌细胞增殖,发挥其抗癌作用。     

Amorphigenin联合顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞的协同抗肿瘤作用

背景与目的 Amorphigenin是从紫穗槐属植物的种子中分离提取的鱼藤酮类化合物,研究发现amorphigenin对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用。本研究拟探讨amorphigenin对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的抗肿瘤作用及其可能的分子机制。方法采用CCK-8法测定A549/DDP细胞的增殖;克隆形成实验测定A549/DDP细胞的克隆形成;流式细胞术检测细胞的凋亡率;Western blot技术检测caspase-3、PARP和LRP蛋白的表达。结果Amorphigenin可抑制A549/DDP细胞的增殖48 h[半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentra-tion, IC50）]为（2.19±0.92）μmol/L、抑制克隆形成及诱导细胞凋亡。此外,Amorphigenin与顺铂联合可协同地抑制A549/DDP细胞生长和促进凋亡;降低耐药蛋白LRP蛋白的表达。结论 Amorphigenin可抑制A549/DDP细胞增殖和促进细胞凋亡;amorphigenin可能是通过抑制耐药蛋白LRP蛋白表达,进而与顺铂对A549/DDP细胞产生协同抑制作用。     

耐顺铂人肺腺癌细胞系A549^DDP耐药机理进一步探讨

应用递增浓度的方法建立了一株顺铂（ＣＤＤＰ）耐药细胞系Ａ５４９ＤＤＰ。用溴化乙啶荧光分光光度法测定细胞内Ｐｔ－ＤＮＡ链间交联物（ＩＣＬ）；用无焰原子吸收光谱法测定细胞浆内及细胞核内铂含量；用流式细胞法及荧光显微镜测定铂的外排速度。结果显示：耐药细胞Ａ５４９ＤＤＰ较亲代敏感细胞Ａ５４９对ＣＤＤＰ耐受性增加８．９倍，与亲代敏感细胞Ａ５４９相比，Ａ５４９ＤＤＰ胞浆内及核内ＣＤＤＰ积聚分别为亲代细胞的１６．９％与２４．３％，铂含量与ＣＤＤＰ浓度正相关；Ａ５４９ＤＤＰ外排ＣＤＤＰ的功能较Ａ５４９明显增强，ＩＣＬ形成量低８４．１％，而修复功能增强２倍。结果提示：Ａ５４９ＤＤＰ细胞内ＣＤＤＰ积聚减少和修复功能增强是ＣＤＤＰ的主要耐药机理。     

姜黄素对耐顺铂人肺腺癌细胞Survivin表达及其化疗敏感性的影响

目的:探讨姜黄素(Cur)对耐顺铂(DDP)人肺腺癌细胞A549/DDP Survivin表达及其化疗敏感性的影响。方法:以非毒性剂量(10μmol/L)的姜黄素作用于A549/DDP细胞,采用RT-PCR和免疫组化SABC法分别检测Survivin mRNA和蛋白的表达,MTT法检测A549/DDP细胞对DDP的半效抑制浓度IC50、耐药指数和细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:Cur能使A549/DDP细胞Survivin mRNA相对表达水平由(79.17±5.96)%下调至(57.8±9.8)%,P=0.014;而蛋白表达强度也由1.174±0.059降至1.009±0.072,P=0.023。A549/DDP细胞对DDP IC50及耐药指数分别由(206.77±9.19)μmol/L和10.90降低至(160.80±3.91)μmol/L和7.42,P值分别为0.041和0.035;细胞凋亡率由7.1%增至17.7%,Cur和DDP联合应用后凋亡率达40.61%,P=0.012。结论:Cur下调A549/DDP细胞Survivin表达,可能与部分解除Survivin导致的细胞凋亡抑制有关。     

重组人血管内皮抑素逆转人肺腺癌A549/DDP细胞耐药性研究

目的探讨重组人血管内皮抑素(rh-ES)对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用.方法采用人肺腺癌细胞株A549及耐药细胞株A549/DDP作为研究对象,以顺铂(DDP)与重组人血管内皮抑素两者联合及单独给药的方式分别作用于人肺腺癌细胞株A549及耐药细胞株A549/DDP,作用时间72 h,观察不同给药方式造成的同株细胞之间耐药性的不同及不同株细胞间耐药性的差别,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测重组人血管内皮抑素对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用.结果DDP对A549细胞半数抑制浓度(IC50)为(0.72±0.05)μg/ml,对A549/DDP的IC50为(11.54±0.64)μg/ml.rh-ES联合DDP对A549/DDP的IC50为(2.0±0.1)μg/ml.逆转倍数(RF)为5.77,相对逆转率(RRR)为88.2%.结论重组人血管内皮抑素能逆转A549/DDP对DDP的耐药性.     

Reversal effect of recombinant human Endostatin on cisplatin resistance in A549/DDP human lung adenocarcinoma cells in vitro

Objective:Recombinant human Endostatin (rh-Endostatin, YH-16) can reverse cisplatin resistance in A549/DDP cells. However, the possible ef ect of rh-Endostatin in reversing DDP-resistance in A549/DDP cells and the mechanism are needed to be investigated. Methods:Lung adenocarcinoma cellline A549 and its DDP-resistant cellline A549/DDP were treated with DDP and/or recombinant human Endostatin. Dif erence in drug resistance was analyzed between dif erent regi-mens and between dif erent celllines after a 72 h-treatment in vitro. And below the non-cytotoxic concentration of rh-End-ostatin, the possibility of rh-Endostatin in reversing DDP-resistance in A549/DDP was evaluated. The resistance protein which was detected in the study included P glycoprotein (P-gp) and topoisomerase II (Topo-II). Results:Rh-Endostatin below 400μg/mL showed no cytotoxicity in either A549 or A549/DDP after 72 h-treatment with it. The inhibited concentration of 50%(IC50) observed for DDP was (0.79 ± 0.05)μg/mL in A549 and (13.2 ± 1.1) in A549/DDP respectively. IC50 was reduced to 2.57 ± 0.05μg/mL in A549/DDP treated by rh-Endostatin below the non-cytotoxic concentrations in combination with DDP, with a reversal fold (RF) of 5.14 and a relative reversal rate of 85.6%. Apoptotic rates were 2.01%, 13.47%and 29.26%re-spectively for cells treated with rh-Endostain, DDP, and the combination. The rate of the A549/DDP control group was 0.99%. The expression level of P-gp or Topo-II was higher in A549/DDP cells than in A549 cells. Rh-Endostatin may partial y reverse DDP-resistance in A549/DDP cells in vitro, with a probable mechanism related to lowering expression of P-gp and Topo-II. Conclusion:Rh-Endostatin of non-cytotoxic dose partial y reversed cisplatin resistance in cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cellline A549/DDP. Rh-Endostatin reversed the resistance of A549/DDP cells to DDP, which may be related to decreased protein expression of P-gp and Topo-II in A549/DDP cells.     

Resistant mechanisms of cisplatin in human lung adenocarcinoma cell line A549DDP

To study the resistant mechanisms of cisplatin in human lung adenocarcinoma cell line A₅₄₉DDP. A₅₄₉DDP cells was established by stepwise increasing concentration of cisplatin (CDDP) in medium. Interstrand cross-linked DNA (ICL) was measured by ethidium bromide fluorescence assay. The intracellular and intranuclear accumulation of cisplatin was measured by atomic absorption spectrometry. The removal of GS-X was determined by FCM and fluorescence microscopy. Results: The A₅₄₉DDP cell line was 8.9-fold resistance relative to the parental A₅₄₉ cell line. The formation of ICL in A₅₄₉ was 6.28 times higher than that in A₅₄₉DDP cells. The intracellular and intranuclear accumulation of cisplatin in A₅₄₉ cells was 5.9 times and 4.1 times higher than that in A₅₄₉DDP cells, respectively. The ability of GS-X pump pumped GS-X complex (GS-Pt) in A₅₄₉DDP cells was higher than that in A₅₄₉. The repair rate in A₅₄₉DDP cells was 2 times higher than that in A₅₄₉. Conclusions: Decreased accumulation and increased export of cisplatin might be the main mechanism of cisplatin resistant A₅₄₉DDP cells while the enhanced repair capacity of DNA may play a role in CDDP resistance.     

黄芪多糖降低A549/DDP肺腺癌细胞顺铂耐药机制研究

目的:研究黄芪多糖对A549/DDP肺腺癌细胞顺铂耐药的影响及可能机制。方法:将A549/DDP顺铂耐药肺腺癌细胞分为CON组（未行黄芪多糖及顺铂处理）、APS组（仅用黄芪多糖处理）、DDP组（仅用顺铂处理）及A+D组（黄芪多糖联合顺铂处理）,比较四组细胞增殖、细胞周期及凋亡率和耐药基因表达的差异。结果:A+D组细胞d1-d7吸光度、S期、G2/M期和PI均显著低于CON组、APS组和DDP组细胞（均P<0.05）,G0/G1期和凋亡率均显著高于CON组、APS组和DDP组细胞（均P<0.05）;APS组和A+D组细胞MDR1和MRP基因mRNA表达无明显差异（均P>0.05）,且均显著低于CON组和DDP组（均P<0.05）。结论:黄芪多糖可显著改善A549/DDP肺腺癌细胞对顺铂耐药性,可能与黄芪多糖显著降低MDR1和MRP有关。     

吴茱萸碱逆转人肺癌细胞株Ａ５４９／ＤＤＰ耐药机理的实验研究

目的　观察吴茱萸碱逆转人肺腺癌耐药株Ａ５４９／ＤＤＰ细胞耐药性的效果并探讨其与阻断ＮＦ κＢ信号传导通路的相关性。方法　采用ＭＴＴ法检测单用吴茱萸碱、顺铂（ＤＤＰ）以及两药联用在不同时间对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的增殖影响,计算ＩＣ５０及耐药逆转倍数。流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。ＲＴ ＰＣＲ检测各组ＭＤＲ１、ＮＦ κＢ、Ｂｃｌ-２、ＭＭＰ-２和ＶＥＧＦ的ｍＲＮＡ表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测各组细胞的ｐＩκＢ-α、pＩＫＫα蛋白表达水平。结果　吴茱萸碱０.１２５ｍｇ／Ｌ、０.２５ｍｇ／Ｌ针对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ的耐药逆转倍数分别为３.６６８和１1.４８。ＲＴ ＰＣＲ显示在吴茱萸碱作用下检测基因的ｍＲＮＡ表达随着吴茱萸碱浓度的增加和时间的延长其表达逐渐下降。当吴茱萸碱与ＤＤＰ联用时,可明显提高Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对化疗药的敏感性,凋亡细胞显著增加（Ｐ＜０.０５）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法结果提示Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ｐＩκＢ-α的表达水平随着吴茱萸碱作用时间的延长逐渐下降,ｐＩＫＫα表达则无显著变化。结论　吴茱萸碱可以通过抑制ＩκＢ-α的磷酸化阻断ＮＦ-κＢ信号通路,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,增加耐药细胞对ＤＤＰ的敏感性。     

榄香烯联合高温和顺铂对人肺腺癌A549细胞的杀伤作用

目的观察榄香烯联合高温和顺铂对人肺腺癌A549细胞的协同杀伤作用。方法应用MTT法检测高温处理或常温处理细胞对顺铂和榄香烯的敏感性。采用4μg/mL顺铂和15μg/mL榄香烯或60μg/mL榄香烯联合42℃高温处理1.5小时或常温处理,使用MTT法检测细胞抑制率。透射电镜观察细胞形态学改变。结果高温作用后,顺铂对A549细胞的半数抑制浓度（IC50）,从常温时的22.44μg/mL降低至11.74μg/mL;榄香烯对A549细胞的IC50从35.43μg/mL降低至28.68μg/mL;42℃加热1.5小时联合4μg/mL顺铂和15μg/mL榄香烯具有明显的协同杀伤作用,A549细胞可见凋亡形态,可见凋亡小体,同时有大量细胞坏死。结论低浓度榄香烯可以明显提高高温联合顺铂对A549细胞的杀伤作用。     

托瑞米芬协同顺铂对人肺癌细胞株A549的影响

目的：研究托瑞米芬（TOR）对人肺腺癌细胞系A549的毒性作用及其与顺铂（DDP）联用的协同效应,探讨肺癌综合治疗的方向。方法：用MTT显色法检测TOR及与DDP联用后对A549细胞的毒性作用,测定其吸光度（A）值。用流式细胞仪检测细胞DNA含量,Western blot法检测p21蛋白表达。结果：TOR能直接抑制A549细胞的生长,≥5μmol/L的TOR可明显增强DDP的细胞毒性作用。TOR可加强DDP对S期、G2期及M期细胞的作用,且DDP＋TOR后p21蛋白表达增加。结论：≥5μmol/L的TOR与DDP联用对A549细胞具有显著的协同抗肿瘤效应。     

人肺腺癌细胞株A549和A549/DDP的比较蛋白质组学研究

目的:比较人肺癌细胞株A549和顺铂(cisplatin,DDP)耐药细胞株A549/DDP中的蛋白表达差异.方法:DDP诱导A549细胞建立DDP耐药细胞株A549/DDP.应用蛋白质组学技术分离鉴定A549和A549/DDP细胞中差异表达的蛋白质,通过real-time PCR、蛋白质印迹法和免疫细胞化学法对部分差异蛋白进行验证;应用生物学信息检索分析差异蛋白的功能.结果:A549和A549/DDP细胞中有8个蛋白质点的表达差异＞5倍,分别为POTE、FH (fumarate hydratase)、PDE (phosphodiesterase)、AKR1C1 (aldo-keto reductase family 1,member C1)、DDH2 (dihydrodiol dehydrogenase 2)、S100A10、prefoldin subunit 2和核内转运蛋白,这些蛋白与细胞代谢、凋亡、增殖、解毒和信号转导等有关.Real-time PCR、蛋白质印迹法和免疫细胞化学法验证结果与蛋白质组学研究结果一致.结论:鉴定得到的A549和A549/DDP细胞中的差异蛋白为研究肺癌细胞DDP耐药提供新依据.     

人参单体Rh2诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡的体外研究

背景与目的肺癌已成为人类癌症主要死亡原因之一.从植物中开发抗肿瘤药物是国内外抗肿瘤新药开发的一个热点.本研究的目的是观察人参单体Rh2诱导人肺腺癌A549/DDP细胞系凋亡的作用,并探讨其可能的分子机制.方法体外培养的人肺腺癌A549/DDP细胞经不同浓度梯度的人参单体Rh2干预,分别应用MTT实验观察其对细胞增殖的影响,用流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数及相关基因表达的改变,以及用双抗体夹心ELISA法测定细胞上清液sApo-1/Fas浓度变化.结果①人参单体Rh2可抑制A549/DDP细胞的生长,并呈剂量、时间依赖作用.②人参单体Rh2处理A549/DDP细胞24 h,实验组凋亡指数显著高于对照组(P＜0.001),G0/G1期细胞比例显著高于对照组(P＜0.01),S期细胞比例显著低于对照组(P＜0.01),G2/M期细胞比例与对照组比较无显著性差异(P＞0.05).③实验组p53、Fas阳性表达率显著高于对照组(P＜0.01,P＜0.001),Bcl-2阳性表达率显著低于对照组(P＜0.001).④实验组A549/DDP细胞培养上清液于不同时间sApo-1/Fas含量均显著低于对照组(P＜0.05).结论人参单体Rh2具有诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡的作用,其分子机制可能是上调p53和Fas及下调Bcl-2的表达、通过Fas/FasL系统途径诱导细胞凋亡.