小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

小鼠CD25分子胞外段的真核表达载体的构建

目的构建小鼠CD25分子胞外段的真核表达载体,并在CHO细胞中进行表达。方法从前期构建的原核表达载体PET-32a-CD25胞外段上酶切下CD25胞外段;将其亚克隆入真核表达载体peDNA3．1,并进行酶切及测序鉴定;用Lipofeetamine2000将pcDNA3．1-CD25胞外段转染中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary,crio）进行表达,并用ELISA法对表达产物进行测定。结果酶切、测序验证成功构建真核表达载体pcDNA3．1-CD25e,并在CHO细胞中有效表达CD25e蛋白。结论成功构建小鼠CD25胞外段的真核表达载体,可在CH10细胞中表达,并具有良好的免疫反应性,为后续实验提供了前期基础。     

小鼠CD160胞外段真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠CD160胞外段的真核表达载体,并稳定转染CHO细胞进行真核表达.方法 从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增CD160胞外段,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-N1两种质粒中,构建重组质粒psCD160和pEGFP-sCD160.重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,用脂质体转染CHO细胞,并用RT-PCR和Western blot检测CD160胞外段的表达,流式细胞术检测重组psCD160与其配体的结合能力.结果 获得长度约为520 bp的小鼠CD160胞外段基因,经测序证实其序列正确.用脂质体将含有CD160胞外段基因的重组质粒载体转染CHO细胞后.RT-PCR和Western blot分析证实转染的CHO细胞可表达重组的psCD160基因,并且表达的可溶性CD160可与其配体结合.结论 成功构建小鼠CD160胞外段基因的真核表达载体,并转染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究CD160胞外段的功能效应奠定实验基础.     

小鼠BTLA胞外段腺相关病毒载体的构建和表达

目的 构建小鼠B/T淋巴细胞弱化因子(BTLA)胞外段的腺相关病毒载体,并感染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)进行真核表达.方法 从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR 扩增BTLA 胞外段,然后将其克隆到腺相关病毒载体的骨架质粒中,构建重组骨架质粒psBTLA.重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,与pHELP质粒以及pRC质粒3质粒共转染293T细胞,收获含病毒的上清后用氯仿-PEG8000的方法进行纯化浓缩,再用浓缩后的病毒液感染CHO细胞,并用SDS-PAGE和Western blot检测BTLA胞外段的表达.结果 获得长度为502 bp的小鼠BTLA胞外段基因,经测序证实其序列正确.含有BTLA胞外段基因的腺相关病毒载体感染CHO细胞后,SDS-PAGE和Western blot分析证实感染的CHO细胞可表达出约21 kD的BTLA胞外段蛋白.结论 成功构建小鼠BTLA胞外段基因的腺相关病毒载体,并感染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究BTLA胞外段的功能效应奠定实验基础.     

小鼠CD25分子胞外段的原核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建小鼠CD25分子胞外段的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法从BALB/c小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法获得CD25分子胞外段序列;将其亚克隆入原核表达载体PET-32a,构建好PET-32a-CD25胞外段,并进行酶切及测序鉴定;将PET-32a-CD25胞外段转染大肠杆菌BL21进行表达,并对表达产物进行纯化和鉴定。结果RT-PCR扩增出708 bp的CD25胞外段的基因片段;pET32a-CD25胞外段/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为47×103,重组蛋白用镍树脂纯化后经Western blot检测显示具有良好的免疫反应性,并且可以在体外有效刺激自体T细胞疫苗免疫小鼠脾细胞的增殖并高分泌IL-4。结论CD25胞外段蛋白在原核细胞中成功表达,纯化后的蛋白保持良好的免疫反应性。     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

人CD40基因的克隆及其胞外段的原核有效表达

目的克隆人CD40基因并原核高效表达其胞外段。方法采用RT-PCR法,从高表达人CD40抗原的XG-2细胞中扩增CD40全长基因,并将其插入pMD18-T载体中进行测序验证。用特异引物扩增CD40抗原分子的胞外段基因（可溶性CD40、sCD40基因片段）,再亚克隆至原核表达载体pGEX-5x-3,将测序正确的重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测目的蛋白。结果 RT-PCR能从XG-2细胞总RNA中扩增出特异的目的基因,测序结果显示与GenBank中登录的完全一致,构建的原核表达重组载体pGEX-5x-3/hCD40ECD在表达宿主菌BL21（DE3）中经IPTG诱导能获得有效表达,Western blot证实了目的蛋白条带的特异性。结论获得了人CD40分子的基因及其胞外段原核表达产物,为进一步研究CD40分子的功能和sCD40的应用奠定了良好的基础。     

抗人Endoglin胞外段单链抗体噬菌体表面呈现文库的构建/筛选及鉴定

目的构建抗人Endoglin胞外段的特异性单链抗体（single chain variable fragment，scFv）噬菌体表面呈现文库。方法用重组人Endoglin（recombinanthuman Endoglin，rhEndoglin）胞外段蛋白免疫Balb／c小鼠，提取脾脏组织mRNA，经RT-PCR分别扩增出VH（heavy chainvariable region）、VL（light chain variable region）基因，经Linker连接成scFv基因，再把scFv基因重组到噬菌粒载体pCANTAB5E，转化到大肠杆菌TG1，经辅助噬菌体M13K07拯救后建成噬菌体呈现文库。用rhEndoglin对文库进行5轮吸附-洗脱-富集panning淘筛，选择ELISA结果最强的克隆提取质粒并测序。结果经过筛选，随机挑取94个克隆进行ELISA检测，37个克隆呈阳性。序列分析表明，该scFvDNA全长738bp。其中VH基因366bp，编码122个氨基酸残基，VL基因327bp，编码109个氨基酸残基，它们之间通过（Gly4Ser）。组成的15肽连接。结论成功构建了抗人Endoglin胞外段scFv噬菌体表面呈现文库，并筛选获得一个能与Endoglin特异结合的重组噬菌体克隆。     

OX40基因原核表达及优化

目的 构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体,进行诱导表达并优化表达条件.方法 PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a(+),重组pET32a-OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的小量诱导表达,并优化表达条件.结果 出现新增蛋白条带,融合蛋白主要存在于包涵体中;Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合.结论 构建了小鼠OX40基因的原核表达载体,获得OX40胞外段融合蛋白的最佳表达条件,为后续单抗制备等工作奠定了基础.     

乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段的双表达核酸疫苗。方法:将HBcAg和FL胞外段的基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入真核双表达载体pIRES,获得含双基因片段的表达质粒;再取该表达质粒中的内部核糖体切入位点(IRES)序列和基因片段克隆入pJW4303载体中,获得相应的双表达核酸疫苗,经筛选鉴定后,以293T细胞瞬时表达检测两基因的表达水平。结果:构建成功以pIRES、pJW4303为载体的4种HBcAg和FL胞外段的双表达核酸疫苗,体外表达证实HBcAg和FL胞外段均能高效表达,基因位于IRES上游时表达水平较高。结论:用IRES元件实现了HBcAg和FL胞外段双表达核酸疫苗的构建,pJW4303为载体的核酸疫苗两基因表达水平优于pIRES为载体的核酸疫苗。     

mOX40-hIgG1Fc真核表达载体的构建

目的构建mOX40-hIgG1Fc的真核表达载体。方法从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA，应用RT—PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因，将其插入pcDNA3.1，构建pcDNA3．1-hIgG1Fc重组质粒。进而从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段，再利用pcDNA3．1-hIgG1Fc重组载体构建pcDNA3．1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体，并经PCR、限制性酶谱分析和测序分析进行证实。结果构建的pcDNA3．1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体，经PCR、限制性酶谱分析和测序分析，证实获得的hIgGl1Fc段及mOX40胞外段基因均与国际生物信息资源库GenBank登录的相应基因序列完全一致。结论成功构建PCD—NA3．1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体，为OX40分子的进一步研究奠定良好的基础。     

BALB/c小鼠MHCI类基因的克隆与逆转录病毒载体的构建

目的　构建BALB/c小鼠MHCI类分子的逆转录病毒表达载体。方法　用RT -PCR从BALB/c小鼠脾细胞基因组中扩增BALB/c小鼠MHCI类分子H -2Dd的编码基因 ,克隆于载体pGEM -T中。经EcoRI和XhoI双酶切后 ,亚克隆于逆转录病毒载体pMSCV ,构建pMSCV -H2Dd重组逆转录病毒表达质粒 ,并进行酶切和序列测定鉴定。结果　用EcoRI和XhoI双酶切鉴定证实 ,H -2Dd基因正确插入载体pMSCV。H -2Dd的编码基因经序列测定证实 ,与文献报道完全一致 ,阅读框架与设计相符。结论　成功构建BALB/c小鼠MHCI类分子编码基因的逆转录病毒载体 ,为进一步研究MHC分子在移植免疫中的作用奠定了基础     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。     

Toll样受体2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆与序列分析

目的：为研究TLR2胞外域在肽聚糖诱导的信号转导中的功能，构建TLR2胞外域及其氨基端和羧基端片段真核表达载体。方法：提取HL－60细胞总RNA，以RT－PCR方法获取了TLR2胞外域cDNA片段，将其与pGEM-T Easy载体连接，转化E.coli JM109,建立了TLR2胞外域的cDNA克隆；籍此，又相继克隆了胞外域的氨基端和羧基端片段，然后将这三个片段克隆到真核表达载体pcDNA3中。结果：序列分析表明，与GenBank中的人TLR2全长cDNA序列比较，仅4个碱基不同，同源性为0．998。结论：成功获得了HL－60细胞TLR2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆。     

sCD40LIg重组腺病毒载体的构建鉴定和体外表达

目的构建含有分泌型人胞外区CD40L融合蛋白(sCD40LIg)基因的重组腺病毒载体,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础.方法分别以质粒pAdCTLA4Ig和pGEM-T-easy-sCD40L为模板,通过PCR扩增获得人源IgGFc和sCD40L基因全部序列.分别回收用连接酶连接,以连接产物为模板PCR,获得sCD40LIg基因全部序列,插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的启动子下游BglⅡ及XhoⅠ位点之间,获得重组质粒pAdTrack-sCD40LIg.将正确重组体pAdTrack-sCD40LIg转化含腺病毒骨架质粒的pAdEasy-1-BJ5183细菌行同源重组.提取重组成功质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因,Western blot分析蛋白表达等方法鉴定重组的腺病毒.结果成功构建了含有sCD40LIg基因的重组腺病毒并在体外表达.结论该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达及在移植排斥的基因治疗中的作用提供了一定的基础.     

携带KGF基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带角化细胞生长因子(Kemtinocyte growth factor,KGF)的腺病毒载体并观察其在细胞中的表达.方法:通过PCR从pcDNA3-KGFpIRES2-EGFP-KGF质粒中扩增出目的片段KGF,定向克隆至穿梭质粒载体pShuttle-CMV中,构建pShuttl-KGF.经酶切及测序鉴定后...     

pIRES2-AcGFP1-sTRAIL真核表达载体的构建及鉴定

目的利用基因工程技术合成sTRAIL（水溶性TRAIL）基因,并以AcGFP为报告基因,构建针对sTRAIL基因的pIRES2-AcGFP1-sTRAIL重组质粒。方法从人胎盘组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增sTRAIL,并加入XhoI和BamHI酶切位点,通过双酶切将其连接于表达载体pIRES2-AcGFP1,通过PCR、酶切及测序鉴定重组质粒构建的正确性,最后用pIRES2-AcGFP1-sTRAIL重组质粒转染Hela细胞利用倒置荧光显微镜直接观察表达情况。结果酶切、PCR及测序结果证实pIRES2-AcGFP1-sTRAIL构建序列正确。结论利用基因工程技术成功构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-sTRAIL,为后续抗肿瘤研究奠定了基础。     

大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体的构建与鉴定

目的以真核表达载体单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)质粒型载体(pHSV)作为表达载体,构建大鼠MeCP2基因反义表达载体.方法用PCR方法扩增出大鼠MeCP2 cDNA部分片段,将其反向插入表达载体pHSV,并以PCR、酶切电泳以及DNA测序等方法对重组质粒进行鉴定.结果经过PCR、酶切电泳以及DNA测序,鉴定出连接方向和插入序列正确的反义表达载体.结论成功构建了大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体,为进一步研究该基因的功能打下了基础.