半滑舌鳎IRF-7基因的全长cDNA克隆及表达分析

本研究克隆了半滑舌鳎干扰素调节因子7(CsIRF-7)cDNA的全长序列,并对该基因进行了结构特征分析,同时还完成了该基因在半滑舌鳎各组织中表达水平的定量分析.结果表明,CsIRF-7基因cDNA全长为1 957 bp,其中包含48 bp的5'-UTR、1 302 bp的ORF和607 bp的3'-UTR.CsIRF-7 cDNA编码一个由433个氨基酸残基组成的多肽.氨基酸序列比对结果表明,CsIRF-7多肽与脊椎动物IRF-7相似,存在高度保守的3个结构域:DNA结合域(DNA binding domain,DBD)、干扰素相关区(IRF associated domain,IAD)和丝氨酸富含区(Serine-rich domain,SRD).全长氨基酸序列同源性分析发现,CsIRF-7与硬骨鱼类的IRF-7同源性较高,与4种硬骨鱼类的同一性和相似性分别介于48.5％～73.6％和65.4％～83.8％之间;其中与牙鲆的同一性和相似性最高,分别为73.6％和83.8％;而与哺乳类和鸟类IRF-7的同源性较低,其同一性和相似性分别仅为30.3％～32.2％和46.5％～52.5％.系统进化分析表明,CsIRF-7与硬骨鱼类的IRF-7聚为一类,并与其他脊稚动物的IRF-7和IRF-3共同组成了脊椎动物IRF-3亚家族.实时荧光定量PCR检测结果显示,CsIRF-7基因在半滑舌鳎的肝、肾、脾、血细胞、鳃、肠和心脏等7种检测的组织中均有表达,在肠中表达量最高,而在肝、鳃和血细胞中表达量相对较少.     

半滑舌鳎HIRA基因部分cDNA序列克隆及表达分析

为研究HIRA基因在半滑舌鳎胚胎发育中的作用及其组织差异表达,以半滑舌鳎为研究对象,采用同源克隆策略从其精巢中分离了长度为764bp的HIRA部分cDNA序列,该片段编码254个氨基酸,具有5个wD结构域。对氨基酸进行比较发现,半滑舌鳎HIRA与比较物种的氨基酸序列具有很高的同源性,与红鳍东方纯亲缘关系最近。实时定量PCR分析发现,HIRA mRNA在多细胞期到原肠胚期的表达量较高,表明HIRA对胚胎发育起重要作用;HIRA在不同组织中表达差异显著,其中在性腺中表达最高,推测HIRA在维持性腺的功能方面有一定作用。     

半滑舌鳎促滤泡激素受体基因克隆及其在雌鱼生殖周期中的表达

通过简并引物扩增及RACE技术,首次克隆了半滑舌鳎促滤泡激素受体(FSHR)基因cDNA全长序列。该基因全长3105bp,编码704个氨基酸,含有典型的跨膜螺旋结构区域(TMhelix),属于糖蛋白激素受体(GHR)家族。该基因编码区共有19个Ser,4个Thr和5个Tyr磷酸化位点;3个潜在的N基端糖基化位点,分别是62NISS,226NGIK和356NSTS;441T为潜在的PKC位点。基酸序列比对结果表明,半滑舌鳎FSHR含有GpHR家族的特殊信号序列,如82CCAF,481ERW,594FTD和667NPFLY,含有10个LRRs(LRR1-10)。组织表达分析表明,FSHR表达广泛,除在性腺中大量表达外,其他非性腺组织也有表达,尤其以脾、肾、头肾表达最较高。采用125Ⅰ标记放射免疫分析法(RIA)测定雌鱼血清中E2含量的季节变化,发现4月时E2含量最低,10月时含量最高。卵巢中FSHR mRNA在10月表达量最高,1月最低。     

半滑舌鳎Dorsalin-1-like基因的克隆与表达

摘要:  Dorsalin-1 是骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)家族成员,  在调控脊椎动物神经系统的发
育中具有重要作用。目前,  国内外有关脊椎动物 Dorsalin-1 的研究报道十分有限。本研究克隆了半滑舌鳎
(Cynoglossus semilaevis) Dorsalin-1-like基因的cDNA序列,  并分析了Dorsalin-1-like mRNA在半滑舌鳎成鱼的组织
表达差异及其在早期发育阶段的表达水平变化。 研究结果表明,  半滑舌鳎Dorsalin-1-like基因cDNA全长为1 961 bp,
包括了 153 bp 的 5′非翻译区(5′UTR)、 编码 419 个氨基酸的 1 260 bp 的开放读码框(ORF),  以及 548 bp  的 3′非翻译
区(3′UTR)。 同源性分析和分子进化聚类分析结果显示,  半滑舌鳎 Dorsalin-1-like 鲀 与红鳍东方 (Taleifugu rubripes)、
尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)等的同源性最高,  并与之共同聚为鱼类 Dorsalin-1 分支。此外, Dorsalin-1-like
mRNA 在半滑舌鳎成鱼的 13 个组织中具有广泛的分布,  并在心脏组织中表达量最高,  在肝、脊髓等组织中次之。
在半滑舌鳎早期发育阶段(卵期、仔鱼、稚鱼、幼鱼)中, Dorsalin-1-like 在卵期中的胚胎期表达量最高,  其次为前期
仔鱼期。上述实验结果表明, Dorsalin-1 在调控卵期和仔鱼期的早期发育中具有重要作用,  并可能通过调节神经系
统的发育进而参与心脏、骨骼等组织的发育调控。本研究旨在揭示 Dorsalin-1-like 基因在调控半滑舌鳎早期神经
系统发育的重要作用,  并为筛选半滑舌鳎骨骼发育的调控因子奠定理论基础。

     

P450c17s基因mRNA在雄性半滑舌鳎繁殖周期中的表达

利用已克隆得到的半滑舌鳎P450c17-I和P450c17-Ⅱ基因cDNA全长序列,通过半定量RT-PCR技术,结合雄鱼性腺发育期、各发育期血清中睾酮(T)含量,研究了这两个基因在雄性半滑舌鳎各组织内的空间表达及在雄鱼繁殖周期中的季节性表达。结果表明,半滑舌鳎P450c17-I组织分布具有广泛性,在精巢、胃、肠、心、脾和脑内都有表达,而P450c17-II组织分布具有特异性,仅在精巢和头肾内有表达。在精巢不同发育期内,P450c17-I表达与性腺发育呈正相关,而P450c17-II表达模式则相反。推测这可能是由于在整个繁殖期,P450c17-I基因在转录水平或转录后调控半滑舌鳎性类固醇激素的生成,而P450c17-II主要可能与孕激素诱导排精及精原细胞DNA复制有关。     

半滑舌鳎TLR5S 三种剪切型基因的克隆与表达分析

Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)是TLRs家族成员之一,可分为跨膜型TLR5M和鱼类特有的可溶型TLR5S,它们可以识别致病菌表面的鞭毛蛋白并协同作用激活免疫反应。为了研究半滑舌鳎受到病原感染后TLR5S参与免疫反应的作用,本研究使用RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)TLR5S全长c DNA序列。TLR5S c DNA有3种剪切型:Cs.TLR5S x1,Cs.TLR5S x2和Cs.TLR5S x3。这3种剪切型的相同区域为308 bp 5′非编码区(5′UTR)和1701 bp开放阅读框(ORF),不同的3′UTR分别为138 bp、364 bp和637 bp。Cs.TLR5S共编码567个氨基酸,预测编码蛋白质分子量为64.03 k D,等电点为8.49。氨基酸多重序列比对结果显示,Cs.TLR5S氨基酸序列与其他脊椎动物TLR5S氨基酸序列具有较高的相似性,其中与牙鲆相似度高达61%,表明Cs.TLR5S在进化上的具有一定的保守性。Real-time PCR结果表明该基因在半滑舌鳎的不同组织均有表达,其中在肝的表达量最高,在脾的表达量最低。此外,检测Cs.TLR5S 3′端的不同剪切型在肝、脾、头肾、小肠中的表达,结果显示Cs.TLR5S x3只在肝中高表达,而Cs.TLR5S x1则在肝和小肠中都有中等程度表达。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染半滑舌鳎实验表明,注射菌液6 h后,Cs.TLR5S基因在肾、小肠、肝和脾4个组织中的表达量都有显著上升;注射鳗弧菌48 h后,以上4种组织中表达量均呈现降低的变化。上述实验结果说明,Cs.TLR5S基因可能参与了半滑舌鳎抗弧菌感染的免疫反应。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) c-Jun基因的克隆及免疫应答分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AP-1家族转录因子c-Jun基因(Jun proto-oncogene)及其在免疫应答中的作用尚无报道.本研究根据半滑舌鳎转录组数据库中预测的c-Jun序列,通过RACE技术和PCR扩增方法获得了半滑舌鳎c-Jun基因cDNA全长2093 bp,CDS区域共981 bp,编码326个氨基酸,5'UTR区域377 bp,3'UTR区域735 bp.SMART分析显示,C-JUN蛋白具有2个结构域:AP-1家族典型结构域Jun,以及高度保守的亮氨酸拉链结构域(BRLZ).经蛋白多序列同源比对、系统进化树分析,发现半滑舌鳎c-Jun与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)c-Jun亲缘关系最近.实时荧光定量PCR分析显示,c-Jun基因在半滑舌鳎不同组织中普遍表达,在卵巢中表达量最高.鳗弧菌(Vibrio anguillarum)人工感染半滑舌鳎后,c-Jun基因在肝脏、脾脏、头肾、小肠、鳃、血液中表达量都出现不同程度上调,其中,鳃中变化最明显:感染12h后表达量达到0h时的13.20倍.使用LPS、PGN、PolyI:C和WGP病原模拟物刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞,结果显示,WGP诱导c-Jun基因上调表达,而LPS与PolyI:C均下调基因表达.以上实验结果表明,c-Jun基因在半滑舌鳎的免疫防御中发挥重要作用.     

半滑舌鳎两种leptin基因的体外重组表达和生物活性分析

根据半滑舌鳎lepa和lepb编码氨基酸序列合成开放阅读框ORF肽段。利用原核表达载体pEQ30成功构建了半滑舌鳎lepa/pQE30和lepb/pQE30重组质粒,分别转化至大肠杆菌M15后,经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。获得的重组蛋白大小均为16 ku,37°C下用0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h后目的蛋白表达量最高,主要以包涵体形式存在。检测半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白浓度分别为0.3和0.25 mg/mL。Western blot免疫印迹和质谱分析表明,获得的LepA和LepB重组蛋白均具有免疫活性且序列正确。Ni2+-NTA亲和层析柱纯化可获得高纯度的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。离体孵育实验表明,获得的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白能显著抑制半滑舌鳎下丘脑lepa、lepb和gnrh3 mRNA的表达水平,表明获得的重组蛋白具有明显的生物活性。研究结果可为探究leptin在半滑舌鳎生长发育中的调控机制提供重要参考。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)体表色素细胞观察及POMC表达特性分析

为认识养殖半滑舌鳎无眼侧黑化的细胞学特性,利用显微观察方法研究了其皮肤黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞的形态特征,比较了3种色素细胞在有眼侧皮肤、无眼侧正常和黑化皮肤中的数量分布特征。为进一步揭示无眼侧黑化的分子机制,克隆了半滑舌鳎POMC基因的cDNA序列。结果显示,黑色素细胞较大,含黑色和棕色的色素颗粒,有树突状分枝不明显和延伸成放射状两种形态;黄色素细胞较小,含黄色素颗粒;虹彩细胞最小,含鸟粪素颗粒。半滑舌鳎POMC基因的cDNA序列长910 bp,包括一个114 bp的5?非翻译区和一个154 bp的3?非翻译区,开放阅读框长度为642 bp,共编码213个氨基酸,包含ACTH、α-MSH、β-MSH、γ-LPH、β-内啡肽5个多肽序列,但缺失γ-MSH和大部分连接区。半滑舌鳎POMC基因的氨基酸序列与其他鱼类的同源性为30%?64%。定量PCR分析显示,POMC mRNA主要在垂体中表达,其次是脑、性腺和无眼侧黑化皮肤。正常与黑化皮肤中的差异表达结果显示,无眼侧黑化皮肤中POMC mRNA表达量最高,并与有眼侧皮肤和无眼侧正常皮肤中的POMC mRNA表达量差异显著,揭示了POMC的表达与无眼侧黑化性状密切相关。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)黑色素富集激素基因的克隆和表达

为研究黑色素富集激素基因(MCH)表达调控与半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)无眼侧黑化性状的关系,通过分子克隆获得了半滑舌鳎pMCH2,通过NCBI获得了pMCH1 cDNA序列,分析了pMCH mRNA的组织表达特性,探索了脑垂体和皮肤中的pMCH mRNA表达与无眼侧黑化程度的关系.结果显示,pMCHl cDNA序列长476 bp,编码134个氨基酸,与鲽形目、鲤形目和鲈形目鱼类的pMCH1氨基酸聚为1个进化分支.pMCH2 cDNA序列全长为626 bp,编码147个氨基酸,与鲽形目和鲍形目鱼类的pMCH2氨基酸聚为1个进化分支.2种MCH mRNA在垂体中表达量最高,同时,MCH1 mRNA在除肌肉外的其他组织中均可检测到表达;MCH2 mRNA在脑、有眼侧皮肤、无眼侧正常皮肤、性腺和鳃组织中也可检测到较高表达.MCH mRNA表达与无眼侧黑化程度的关系分析显示,脑垂体和皮肤中MCH1 mRNA表现出相似的表达变化趋势,都是10％黑化组的表达量最高,而后随黑化程度加大显著降低.对于MCH2而言,无眼侧正常鱼和无眼侧50％黑化鱼的脑垂体中都具有较高的MCH2 mRNA表达水平,但在无眼侧10％黑化组和无眼侧80％黑化组,其表达水平显著降低.皮肤中MCH2表现出随黑化程度加大而显著升高的趋势.本研究结果可为认识MCH基因与半滑舌鳎无眼侧黑化性状的表达调控关系提供基础资料.     

半滑舌鳎繁殖生物学及繁育技术研究

论述了近几年我国半滑舌鳎繁殖生物学及人工繁育技术研究的现状和进展,从生理、生态、繁殖发育生物学及苗种培育技术等方面较详细介绍了半滑舌鳎亲鱼性腺发育规律及调控产卵技术、染色体核型、早期形态及生长发育特征、摄食习性、人工孵化及工厂化育苗技术等基础理论和生产实践的研究成果,并对存在问题、今后研究方向和开发前景进行了分析。     

半滑舌鳎生长激素及其受体基因的原核表达

根据已克隆的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长激素(GH)基因和生长激素受体Ⅰ(GHR-Ⅰ)基因的cDNA序列信息设计引物,用于扩增半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因序列。随后,分别利用表达载体pET-32a和pGEX-6P-1成功构建了包含半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因ORF全序列及不同ORF片段的6个重组质粒,并将获得的重组质粒在表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示:重组GH的pET-32a-CSGH质粒在40 kD处有特异性的蛋白条带,重组GHR-Ⅰ胞内区的pGEX-6P-1-CSGHR1-2质粒在70 kD处发现诱导的蛋白条带,其表达量分别占细胞蛋白总量的37.6%和20.2%;而构建的pGEX-6P-1-CSGH重组质粒和含有GHR-Ⅰ基因跨膜区的重组质粒(pET-32a-CSGHR1-1、pET-32a-CSGHR1-2和pGEX-6P-1-CSGHR1-1)均未获得表达产物。由此可见,半滑舌鳎GHR-Ⅰ基因的跨膜区可能影响其在大肠杆菌中的表达。研究结果为实现半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ制剂的开发及应用于养殖生产实践奠定基础。     

半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段的克隆与表达分析

同源克隆了半滑舌鳎Dmrt3基因的部分cDNA片段,片段长度为228 bp,NJ系统发育树显示,半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段与红鳍东方鲀、青鳉以及斑马鱼的Dmrt3基因cDNA片段同源性最高,首先聚为一支。实时定量分析了Dmrt3基因在半滑舌鳎雌性和雄性个体的各组织中的表达情况,以及在高温处理和甲基睾酮处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织中的表达。Dmrt3基因在雌性和雄性的脑、垂体、性腺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏7个组织中都有表达,但是表达量有差异,在精巢中的相对表达量高,Dmrt3基因在精巢的表达与其它组织中的表达差异极显著(P<0.01),而在卵巢中的表达很微弱,结果预示Dmrt3基因可能在雄性的性腺发育过程中起着重要的作用。高温处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织之间Dmrt3的表达无显著差异(P>0.05),但都极显著低于对照组的雄鱼(P<0.01)。高温处理组的伪雄鱼与对照组雌鱼性腺中Dmrt3的表达表达无显著差异(P>0.05)。甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼性腺中Dmrt3的表达都显著高于对照组雄性(P<0.01)。从孵化后43 d到5月龄,Dmrt3的相对表达量很低,7月龄时表达量显著升高,9月龄时达到最高峰,12月龄时表达量下降,这也预示Dmrt3基因在半滑舌鳎性腺的发育过程中起重要作用,可能是促进生殖细胞发育的重要转录因子。     

半滑舌鳎颗粒酶B基因的克隆和表达分析

颗粒酶(granzyme, Gzm) B是免疫炎症反应必不可少的介质,可激活半胱天冬酶3,进而诱导靶细胞的凋亡。本研究通过PCR扩增和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)颗粒酶B基因(CsGzmBl)的全长cDNA序列,并对其序列特征和表达水平进行了分析。结果显示,CsGzmBl cDNA全长为923 bp,开放阅读框长度为780 bp,编码259个氨基酸(前19个氨基酸残基为信号肽序列),5′非编码区为49 bp,3′非编码区为94 bp。CsGzmBl的基因组结构比较保守,由5个外显子和4个内含子组成。CsGzmBl蛋白包含2个N端糖基化位点、1个催化三联体“His63Asp112Ser207”、1个“PHSRPYMA”结构域及6个保守的半胱氨酸。荧光定量PCR结果显示,CsGzmBl在半滑舌鳎健康成鱼不同组织中均有表达,其中,在脾脏中表达量最高,头肾、中肾、肝脏和鳃中表达量次之,在肌肉中表达量最低。与对照组0 h相比,CsGzmBl在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后的不同时间点的脾脏、肠、肝脏、皮肤、鳃和肾脏中的表达水平均有不同程度的上调。研究表明,CsGzmBl基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌感染过程中发挥重要作用。     

半滑舌鳎促滤泡激素基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

从半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther脑垂体中提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎促滤泡激素（FSH）基因全长cDNA序列。半滑舌鳎FSHcDNA全长为541bp,开放阅读框为393bp,编码130个氨基酸（GenBank序列登录号：JQ277933）。发现一个N-糖基化位点：24～27NTT。与其他脊椎动物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明,半滑舌鳎FSH与鲽形目和鲈形目鱼类FSH同源性为42％～49％,与鲤形目和高等脊椎动物FSH同源性为27％～319/5。用MEGA4．0软件构建了NJ树,获得的进化树表明,半滑舌鳎FSH与其他鱼类FSH聚类,亲缘关系较近。实时荧光定量组织表达分析表明,FSHmRNA除在垂体中大量表达外,其他组织也有表达,尤以脑、性腺表达量较高。半滑舌鳎FSHmRNA在垂体以外组织中的广泛表达,暗示FSH可能具有广泛的生理功能。     

半滑舌鳎RasGRP3基因的克隆和免疫应答分析

RasGRP3(Ras Guanyl nucleotide Releasing Protein 3)是一种鸟苷酸交换蛋白,差异表达的Ras GRP3蛋白在疾病发生和固有免疫中发挥着重要作用。为了探究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Ras GRP3基因组成、组织表达及免疫应答特征,根据本实验室半滑舌鳎转录组数据获得的部分Ras GRP3序列,采用RACE(Rapid-Amplification of c DNA Ends)技术,克隆了Ras GRP3基因的全长,将测序结果进行氨基酸序列比对和同源性分析:半滑舌鳎Ras GRP3基因全长2756 bp,ORF(Open Reading Frame)长度为2244 bp,编码747个氨基酸;推导的半滑舌鳎Ras GRP3氨基酸序列与其他鱼类的Ras GRP3氨基酸序列相似性较高,是同源基因。采用q RT-PCR(Quantitative Real-Time PCR)方法对Ras GRP3基因在健康半滑舌鳎13种组织、鳗弧菌(Vibro anguillarum)感染后不同时间点的6种免疫组织及LPS、PGN、WGP和poly I:C 4种病原模拟物处理的半滑舌鳎外周血淋巴细胞不同时间点中的表达特征进行分析:Ras GRP3基因在健康半滑舌鳎13种组织中均有表达,其中在性腺中表达量最高,其次是肝、脑和脾,在血液中表达量最低;Ras GRP3基因在鳗弧菌感染后半滑舌鳎6种免疫组织中都表现出不同的表达趋势,其中肝和鳃中上调趋势明显,6 h比0 h上调表达倍数分别为3倍和30倍,在肠、脾、头肾和血液中6 h都出现了下调表达;Ras GRP3在4种病原模拟物处理的半滑舌鳎外周血淋巴细胞中整体上调表达,在PGN和poly I:C这2种病原模拟物刺激后表达趋势出现明显上调,在PGN刺激后24 h比0 h上调表达倍数为13倍,在poly I:C刺激后6 h比0 h上调表达8倍。结果表明,Ras GRP3基因参与了半滑舌鳎的免疫应答过程,可能在免疫调控中发挥着重要的作用。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)新型膜孕激素受体基因(mPRL)在卵母细胞成熟过程中的表达特征

为进一步提高半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)人工育苗技术的水平,对半滑舌鳎新型膜孕激素受体(mPR-like,mPRL)基因的表达特征和作用机制进行了研究.应用实时定量PCR方法分析mPRL mRNA在卵子形成过程中的时序表达,发现半滑舌鳎mPRL mRNA相对表达量的最高值出现在性成熟阶段卵巢的Ⅴ时相卵母细胞.原位杂交分析mPRL mRNA在繁殖相关组织的细胞学定位,发现mPRL mRNA分布在半滑舌鳎性成熟阶段卵巢的卵母细胞膜上;在脑的神经元和垂体内分散的细胞中,mPRL mRNA阳性信号较强.制备半滑舌鳎mPRL的多克隆抗体,采用Westem blotting方法检测半滑舌鳎mPRL蛋白在不同组织的表达特征,发现mPRL蛋白的表达量在卵巢、脑、垂体中相对较高,在肝脏、头肾、肾脏中表达量相对较少.免疫组化结果显示,半滑舌鳎mPRL蛋白在卵巢、脑和垂体的细胞学定位与mPRL mRNA定位一致.应用实时定量PCR和Westem blotting方法检测促性腺激素调控下半滑舌鳎不同时相卵母细胞mPRL基因mRNA和蛋白的表达变化,结果显示,促性腺激素对半滑舌鳎卵母细胞中mPRL基因mRNA和蛋白表达都有一定的上调作用,特别是对Ⅴ时相卵母细胞中mPRL mRNA和蛋白的表达量提升明显;发现表达量与促性腺激素调控作用具有剂量依存关系.半滑舌鳎mPRL在繁殖相关组织的表达特征表明其通过脑-垂体-卵巢轴参与繁殖调控,同时也揭示了mPRL介导卵母细胞成熟机制.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) 2种视黄酸受体RARα和RARγ克隆及组织表达特性

利用RT-PCR和RACE方法获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) 2种视黄酸受体RARα和RARγ的cDNA全长序列,并采用定量PCR技术分析了其组织表达特性。半滑舌鳎RARα cDNA序列全长为1823 bp,编码443个氨基酸;RARγ cDNA序列全长为1959 bp,编码489个氨基酸。同源性分析显示,半滑舌鳎RARα和RARγ同源性高达60.8%,与牙鲆(Paralichthys olivaceus)同源性高达97.0%,具有较强的进化保守性。系统进化分析显示,半滑舌鳎RARα和RARγ分别归属于单独的分支,且与其他鱼类聚合成簇。组织表达分析显示,RARα mRNA在肾中表达量最高,而RARγ mRNA在脾中表达量最高,RARα和RARγ mRNA在其他组织中均有表达,表明半滑舌鳎2种RAR都可能参与多种生理过程调控。半滑舌鳎2种RAR mRNA在有眼侧皮肤、无眼侧黑化皮肤和无眼侧正常皮肤中的表达量依次升高,且发现RARα在正常有眼侧皮肤的表达高于RARγ,而RARγ在无眼侧正常皮肤中的表达显著高于RARα,无眼侧黑化皮肤中RARα表达高于RARγ。RAR基因在有眼侧和无眼侧皮肤组织中的差异表达可能和RA/RAR系统调节体色有关。     

转录因子Runx2和Osterix在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)早期发育阶段的时序性表达分析*

转录因子Runx2和Osterix在高等脊椎动物骨骼发育的调控过程中具有重要作用。本研究以Runx2和Osterix基因作为研究对象,利用实时荧光定量PCR技术分析了两个转录因子在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)成鱼的组织表达分布及其在早期发育阶段的表达水平变化。研究结果显示,Runx2和Osterix在半滑舌鳎成鱼的13个组织中具有较广泛的分布,并在脾组织中表达量最高,在背鳍、脑等组织中次之,在肝、肠、胃等组织中仅有微弱的表达。在半滑舌鳎早期发育阶段(卵期、仔鱼、稚鱼和幼鱼),Runx2和Osterix的时序性表达特征如下：1) 孵化前,Runx2在卵裂期与原肠期的表达水平最高,在胚胎期最低,而Osterix表达水平呈逐渐升高的趋势并在胚胎期达到最大值,表明两个基因功能作用的起始可能存在一定的时序性;2) Runx2和Osterix在1?5日龄仔鱼阶段的表达水平均呈现先升高后降低的趋势,而在10?90日龄稚、幼鱼阶段未呈现特定的变动规律,表达量在一定范围内呈波动变化;3) 相关性分析结果显示,两个基因的表达量在孵化后(1?90日龄)存在显著的相关性。研究结果表明,Runx2和Osterix基因可能共同参与半滑舌鳎早期发育阶段生长发育调控,但其与骨骼发生、发育的相关性有待进一步研究。