光化学法建立豚鼠耳蜗微循环障碍模型的初步报告

为建立较好的耳蝇微循环障碍模型，采用豚鼠股静脉内注射四碘四氯荧光素二钠，以波长为５５０±２０ｎｍ绿色光束照射耳蜗的方法，诱导豚鼠耳蜗血管内发生光化学反应，损伤血管内皮细胞，血小板被受损的内皮细胞激活，粘附、聚集于内皮细胞表面或暴露的基膜上形成微血栓，导致耳蜗微循环障碍，耳蜗血流量（ＣＢＦ）骤降，复合动作电位（ＣＡＰ）振幅下降乃至消失。随着时间的延长，耳蜗血管纹、Ｃｏｒｔｉ器、螺旋神经节细胞等结构先后出现不同程度的缺血性病变，与某些病理条件下的耳蜗微循环障碍有很大的相似性。这种方法，可以为研究内耳微循环障碍或缺血性损伤机制，以及筛选治疗药物建立较为理想的动物模型。     

光化学法诱导豚鼠耳蜗微循环障碍模型

目的 通过光化学法建立豚鼠耳蜗微循环障碍模型以及观察血管纹、耳蜗毛细胞形态学变化.方法 ①将豚鼠随机分成5个组.实验组分成3个组,颈外静脉注入四氯四碘荧光素二钠(rose bengal,RB),用波长为(540±40)nm、光强为(500～600)mW/cm2绿光照射打开的听泡,各组选用不同光照时间诱导耳蜗微循环变化.对照组分2个组,对照Ⅰ组仅颈外静脉注入RB而不行光照;对照Ⅱ组不注入RB而仅行光照耳蜗.②分别对5个组动物行听性脑干反应及形态学检测.结果 ①每个实验组两次ABRⅢ波反应阈差异均有统计学意义(P＜0.05);②形态学观察实验组均出现耳蜗微循环障碍的变化,螺旋器以外毛细胞破坏为主.结论 采用光化学法可致耳蜗微循环障碍及毛细胞破坏,方法简便,易于实施,重复率高.     

豚鼠耳蜗顶部区域微循环障碍的实验研究

目的 研究豚鼠耳蜗顶部区域微循环障碍的听力损伤特点,建立以低上尖损伤为主的听力损伤模型,方法光化学法诱导豚鼠耳蜗顶部区域微循环障碍,常规火棉交切片观察耳蜗形态学变化,再用Madsen2250诱发电位系统记录各频率声刺激诱发的CAP和CM。结果 各频率CAP－N1潜伏期延长值、CAP阈移、CAP－N1和CM振幅下降示基听力损伤以低频较重,其血栓形成的 耳蜗顶回及第三回血管纹和螺旋韧带为主,结论 耳蜗顶部区域的局部微循环障碍可以导致低频范围为主的听力损伤。     

人工耳蜗植入术后神经反应遥测技术的参数设置

澳大利亚Cochlear公司的Nucleus24型多层人工耳蜗系统首次提供了直接测量电诱发听神经复合动作电位（electrically evoked compound action potential,ECAP)的技术手段－－神经反应遥测（neural response telemetry,NRT)技术。本文对20例Nucleus24型多层人工耳蜗植入患者进行NRT反应波形采集，选取反应波形较清晰的电极作为测试电极。每次只改变一个测试参数，观察波形的变化，总结出不同测试参数的改变对波形赞成的影响。其中对波形影响较大的有电流强度（current level,CL)，刺激脉宽（stimulation pulse width)、延迟时间（delay)、增益（gain)、掩蔽刺激间期（masker advance)等。对波形采集时间影响垢刺激速率和叠加次数。在此基础上设计出优化的参数调整顺序，用于快速采集反应波形，提高临床工作效率。     

豚鼠耳蜗底回近末端局部微循环障碍的研究

目的 :探讨豚鼠耳蜗底回接近末端局部微循环障碍的听力损伤特点 ,建立以高频损伤为主的听力损伤模型。方法 :采用光化学法诱导豚鼠耳蜗底回接近末端 1/ 2段微循环障碍 ;常规火棉胶切片观察耳蜗形态学变化 ;Madsen2 2 5 0诱发电位系统记录各频率的耳蜗神经复合动作电位 (CAP)。结果 :各频率的 CAP N1 潜伏期、CAP阈移、CAP N1 振幅变化 ,提示其听力损伤以高频较重 ,组织病理学变化表明耳蜗形态学改变主要局限于耳蜗底回接近末端 1/ 2段。结论 :耳蜗底回接近末端局部微循环障碍可以导致高频范围为主的听力损伤。     

游泳锻炼对川芎嗪改善耳蜗微循环的影响

目的观察游泳锻炼对川芎嗪改善慢性低氧豚鼠耳蜗微循环的影响。方法将33只豚鼠随机分成舱外正常对照组(A)与慢性低氧模型组(B)。4周后慢性低氧模型组又随机分为对照组(B1)、川芎嗪治疗组(B2)、单独游泳组(B)和川芎嗪治疗 游泳锻炼组(B4)。豚鼠喂养到规定的时间后均用激光多普勒统计耳蜗血流量，螺旋韧带铺片光镜观察豚鼠血管纹毛细血管的形态及血管内红细胞计数，并对其结果进行统计学比较。结果B2和B4两组分别与B1组比较。耳蜗血流量和血管内红细胞计数有显著差异，且前两者耳蜗血管纹毛细血管丰富，血细胞分布均匀，未见明显的缺血及淤血区；B3组与B1组、B4组与B2组比较，有好转，但无显著性差异。结论游泳锻炼可能促进慢性低氧环境下豚鼠耳蜗毛细血管的肿胀及红细胞淤滞现象的改善，可以增强川芎嗪改善内耳微循环的作用。     

链霉素耳中毒豚鼠耳蜗iNOS与AChE的表达及其相关性的实验研究

目的探讨链霉素（streptomycin,SM）耳中毒过程中豚鼠耳蜗诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）与乙酰胆碱酯酶（acetylcholine esterase,AChE）的表达及二者之间的相关性。方法16只豚鼠随机分为正常对照组和SM组,每组8只,分别每日腹腔注射生理盐水2.5ml/kg和SM150mg/kg,连续10日。应用免疫组织化学染色及图像分析技术检测耳蜗iNOS和AChE的表达并进行灰度值分析,结合听性脑干反应（auditory brainstem response,ABR）测试监测耳毒性损伤的发生。结果用药10d后,SM组ABR阈值明显高于正常对照组,两组差异有统计学意义（P〈0.01）。免疫组化结果表明,SM组iNOS及AChE在柯蒂器、血管纹、螺旋神经节、神经纤维的表达显著高于正常对照组,且二者表达呈正相关。结论SM耳中毒时ABR阈值升高,iNOS及AChE表达增强,而且具有一定的相关性。     

缺氧豚鼠耳蜗总和电位和形态学实验观察

应用同一玻璃微电极在豚鼠中阶记录复合动作电位（ＣＡＰ）、总和电位（ＳＰ）和蜗内电位（ＥＰ），连续动态观察在缺氧、给氧过程中的变化，结合内、外毛细胞及突触形态学观察，发现缺氧时ＳＰ和ＥＰ幅度下降，极性发生改变。而ＳＰ极性及大小同时随ＣＡＰ阈值因氧供变化而变化。组织学检查结果内毛细胞琥珀酸脱氢酶无变化，外毛细胞琥珀酸脱氢酶活性下降，而突触内乙酰胆碱酯酶无变化。结果提示：在中阶记录的ＳＰ极性和振幅受ＥＰ的被动影响，同时有外毛细胞主动机制对内毛细胞的调控。从缺氧到给氧过程，ＳＰ由负变正是外毛细胞对内毛细胞调控的失与得的过程。     

多巴胺对豚鼠耳蜗谷氨酸受体NMDA NR_1和NMDA NR_(2A)的调节作用

目的观察豚鼠耳蜗谷氨酸受体NMDANR1和NMDANR2A与多巴胺调节作用的相关性,探讨多巴胺在内毛细胞下突触复合体中的作用机制。方法选用杂色豚鼠40只,随机分组,每组10只．分别以右耳行全耳蜗灌流人工外淋巴液和不同浓度的多巴胺,并以人工外淋巴液灌流组的对侧耳蜗作为正常对照组,则共为5组（每组10耳）：①正常对照组;②人工外淋巴液组;③10mmol／L多巴胺组;④30mmol／L多巴胺组;⑤50mmol／L多巴胺组。在灌流前、灌流0、1、2h同时记录各组动物耳蜗电图,应用半定量RT—PCR的方法,观察各组间谷氨酸受体NMDANR1和NMDANR2A的mRNA表达量是否有差异。结果多巴胺对豚鼠4000Hz耳蜗复合动作电位产生抑制作用,使其阈值升高,且这种抑制作用呈现明显的量效依赖关系。与正常对照组和人工外淋巴液组比较,其余三组谷氨酸受体NMDANR1的mRNA表达量明显减少（P〈0．05）,NMDANR1的表达量与灌流多巴胺的浓度呈现明显的浓度剂量依赖关系;谷氨酸受体NMDANR2A的mRNA表达量在各组间差异均无统计学意义（P〉0．05）,随着灌流多巴胺浓度的增加,NMDANR2A的表达量没有明显变化。结论多巴胺可通过减少谷氨酸受体NMDANR1的量来实现对听觉通路抑制的作用,而谷氨酸受体NMDANR2A不参与多巴胺的抑制作用。     

水通道蛋白1、2、5在膜迷路积水豚鼠耳蜗中的分布及表达研究

目的观察水通道蛋白(aquaporin,AQ)1、2、5(AQP1、AQP2、AQP5)三种蛋白在膜迷路积水豚鼠耳蜗的表达及分布情况,探讨其在内淋巴积液中可能的发生机制。方法选择健康红目豚鼠60只,随机分为空白组(30只)和模型组(30只),模型组给予醋酸去氨加压素6μg·kg-1·d-1腹腔注射10 d,空白组以1 ml生理盐水腹腔注射10 d;常规饲养7天后取出耳蜗,通过免疫组化、Western-blot方法观察AQP1、AQP2、AQP5蛋白在豚鼠耳蜗的分布及表达。结果免疫组化示空白组、模型组豚鼠耳蜗组织中AQP1表达的光密度值分别为0.134±0.021、0.273±0.053;AQP2表达分别为0.089±0.013、0.261±0.100;AQP5表达分别为0.264±0.065、0.151±0.098;与空白组比较,模型组AQP1、AQP2蛋白表达明显上调(P<0.01),AQP5蛋白表达明显下调(P<0.05)。Western-blot示空白组、模型组豚鼠耳蜗组织中AQP1表达分别为0.214±0.034、0.313±0.032;AQP2表达分别为0.283±0.050、0.544±0.042;AQP5表达分别为0.291±0.041、0.199±0.033;与空白组比较,模型组AQP1、AQP2蛋白表达上调(P<0.01),AQP5蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论AQP1、AQP2、AQP5蛋白均可能参与了豚鼠耳蜗膜迷路积水的发生。     

蛋白磷酸酶1在D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗中的表达

目的 观察D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗中蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)的定位表达及作用.方法 40只昆明小鼠随机分为对照组和D-半乳糖组,每组20只.D-半乳糖组颈背部皮下注射D-半乳糖(800mg·kg-1·d-1),对照组每日皮下注射等量生理盐水,连续给药8w;停药后检测血浆总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平;免疫荧光法定位PP1在耳蜗的表达,re-al-time PCR法检测耳蜗中PP1 mRNA水平,Western blot法检测小鼠蛋白磷酸酶1核目标亚基(protein phos-phates 1 nuclear targeting subunit,PNUTS)、PP1及caspase-3的表达.结果 与对照组比较,D-半乳糖组小鼠总SOD活力降低而MDA水平升高(均为P<0.01);PP1主要定位表达于小鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞及血管纹细胞的胞核和胞浆中,且给予D-半乳糖后,小鼠耳蜗中PP1 mRNA及其蛋白表达水平显著升高,而PNUTS表达减少,caspase-3表达增加(均为P<0.05).结论 PP1在D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节及血管纹细胞中表达,且参与了其耳蜗老化过程.     

卡那霉素和速尿联合用药后的毛细胞死亡*

目的观察卡那霉素和速尿联合用药后豚鼠耳蜗毛细胞的死亡时程和方式.方法选用健康成年白色红目豚鼠,雌雄不限,随机分成健康对照组和药物致聋后6 h、9 h组(实验组),每组5只.实验组在选取的时间点完成听性脑干反应(ABR)检测后行耳蜗基底膜铺片、PI荧光染色,共聚焦显微镜下观察毛细胞.对照组不做处理.结果实验组半数豚鼠致聋(ABR阈值>95 dB SPL),致聋豚鼠耳蜗可见外毛细胞核固缩和核肿胀,与给药6 h组相比,给药9 h组外毛细胞核肿胀数目增多.检测给药6 h组和9 h组豚鼠末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记物(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL),没有观察到阳性着色细胞.正常对照组所有豚鼠ABR正常,其耳蜗各回毛细胞没有出现毛细胞核固缩或者核肿胀.结论卡那霉素和速尿联合用药后数小时即可导致豚鼠耳蜗毛细胞死亡,毛细胞损害为两种类型,即坏死和凋亡.     

变应原诱发大鼠分泌性中耳炎动物模型的建立

目的 建立卵清蛋白诱导的大鼠分泌性中耳炎动物模型,观察其病理改变,为探讨其发病机制奠定基础.方法 20只健康的雄性SD大鼠,随机分为对照组(8只16耳,A组);OME组Ⅰ(8只16耳,B组)和OME组Ⅱ(4只8耳,C组).OME组Ⅰ和OME组Ⅱ采用卵清蛋白腹腔致敏后分别经鼓膜穿刺和经听泡钻孔注射,耳内激发2次制成分泌性中耳炎模型;对照组以生理盐水替代卵清蛋白进行腹腔致敏和耳内激发.在末次耳内激发后2天处死动物,采用HE染色观察各组大鼠中耳黏膜病理变化及炎症细胞的改变,免疫组化染色检测中耳黏膜和骨髓腔中IL-4、IL-5的表达.结果 A组1只、B组2只麻醉意外死亡.OME,模型组Ⅰ和组Ⅱ大鼠听泡内均出现少量琥珀色积液,咽鼓管鼓室段纤毛上皮肿胀,排列紊乱.部分纤毛脱落,中耳黏膜增厚,黏膜下层、骨髓腔中有较多嗜酸粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞浸润,咽鼓管周围组织中肥大细胞增多、脱颗粒.对照组未见明显异常改变.两个OME模型组大鼠中耳粘膜和骨髓腔中IL-4、IL-5表达均明显高于对照组(P＞0.05),但此两组间IL-4、IL-5阳性细胞数量差异无统计学意义.结论 通过Ⅰ型变态反应能够成功诱发大鼠急性OME.经鼓膜或和经听泡钻孔注射两种方法 的造模结果 无差异.