鲤鱼（Cyprinus carpio）生长激素基因的亚克隆及其序列分析

本文对ＰＣＲ扩增的６６８ｂｐ的ＤＮＡ片段进行了亚克隆,然后以Ｓａｎｇｅｒ双脱氧中止法为原理,利用美国ＡＢＩ公司３７０Ａ自动核酸序列分析仪,确定了６６８ｂｐ的核苷酸序列。序列分析表明鲤鱼生长激素基因的开放读框含有６３０ｂｐ,并推测其中包括２２个氨基酸的信号肽和１８８个氨基酸的成熟多肽。鲤鱼生长激素基因的酶切图谱和序列分析的结果都证明我们已获得了全长的鲤鱼生长激素基因。     

中国人肥胖基因克隆及其原核表达载体的构建

为了探讨人肥胖（obesity,OB）基因的生理和病理意义,利用逆转录-聚合酶链式．反应（RT-PCR）方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总RNA中扩增出肥胖基因编码区序列（cDNA）．定向亚克隆pUC19质粒,克隆的OBcDNA不含信号肽序列并加入了新的起始密码子ATG,序列分析表明,与日本报道的人OBcDNA相比,多出一个谷氨酸密码子CAG．将OBcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220,构建了重组OB基因表达质粒pBV220-OB．SDS-PAGE证实pBV220-OB在大肠杆菌中可表达分子量为16.7KD的特异蛋白带．     

鲤鱼生长激素在毕赤酵母中的表达

 将编码鲤鱼 (Cyprinuscarpio )生长激素 (GH)成熟肽的cDNA克隆到毕赤酵母 (P .pastoris)胞内表达载体pHIL D2中 ,构建重组表达质粒pHIL D2 GH .转化组氨酸缺陷型酵母GS115,获得表达鲤鱼GH的酵母工程菌 .经甲醇诱导 ,SDS PAGE和Western印迹检测表明 ,鲤鱼GH在酵母中得到表达 ,表达产物在胞内以可溶状态存在 ,具有鲤鱼GH的免疫活性 .用诱导后的酵母投喂罗非鱼 ,实验结果证实所构建的工程菌具有明显的促生长作用     

大鼠OB基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用ＲＴＰＣＲ技术扩增大鼠ＯＢｃＤＮＡ编码区序列。ＰＣＲ产物酶切后定向克隆至ｐＵＣ１９质粒。经核苷酸序列测定表明与文献报道的大鼠ＯＢｃＤＮＡ编码区序列一致。继之构建了ｐＢＶ２２０ｒＯＢ表达质粒并获得了ＯＢ基因在大肠杆菌中的特异表达。大鼠ＯＢ基因产物的获得为研究肥胖与某些非传染性疾病（如糖尿病、高血压病）间的关系提供了条件     

发菜藻蓝蛋白基因克隆及原核表达

发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻,具有重要的经济和生态价值。运用双向电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS鉴定和数据库检索,获得藻蓝蛋白部分氨基酸序列并设计简并性引物,克隆藻蓝蛋白基因并研究其表达。结果表明,发菜藻蓝蛋白α和β亚基两个基因的编码序列及两者之间的间隔序列全长为1097bp,编码β亚基和α亚基的基因序列全长分别为519bp和489bp,β亚基基因序列位于α亚基基因序列上游,两者之间通过89bp的基因片段连接,GenBank登录号为GU549478,并对推译的α和β亚基三维结构进行了预测。将藻蓝蛋白的α和β亚基基因在大肠杆菌中表达,获得了符合预期的外源重组蛋白。研究结果为进一步研究发菜藻蓝蛋白的分子结构及生物学功能奠定了基础。     

家蚕蚕丝蛋白轻链基因克隆及原核表达研究

克隆家蚕丝素蛋白轻链基因并构建原核表达系统。以家蚕总RNA反转录cDNA为模板,利用特异性引物FiblF和FiblR扩增编码丝素蛋白轻链基因(Fibl)765bp片段,以pET-28a(+)构建pET-28a(+)-Fibl表达载体,将重组表达载体转化BL21(DE3)感受态细胞构建产丝素蛋白轻链(Fibl)蛋白工程菌。构建了原核表达载体pET-28a(+)-Fibl,经测序验证基因序列正确,经聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot初步判断出表达产物为35.3KD的丝素蛋白轻链蛋白。成功构建产丝素蛋白轻链蛋白的工程菌BL21-pET-28a(+)-Fibl,为丝素蛋白的原核表达研究奠定了基础。     

鲤鱼sGnRH基因克隆及其在成熟个体的表达分析

采用RACE方法,从鲤鱼脑组织克隆了两个差异的sGnRH(salmon GnRH[Trp^7Leu^8]GnRH)cDNAs,即cDNA1和cDNA2,其长度分别为393和478bp。两个cDNAs都包括一个285bp开放阅读框,编码的sGnRH前体为94个氨基酸残基,由一个信号肽、sGnRH十肽和一个由蛋白水解位点(Gly-Lys-Arg)连接的促性腺激素释放激素相关肽共3部分组成。用内含子捕获得到相应的两个差异sGnRH基因,即sGnRH genel和gene2,其基本结构都包括4个外显子和3个内含子,3个内含子的核苷酸相似性分别为71．1％、76．1％和88．0％。鲤鱼sGnRH cDNAs及基因的基本结构和编码特点与已报道的不同形式GnRH cDNAs和GnRH基因相似,由此推测所有类型的GnRH可能来自一个共同的祖分子。Southern杂交进一步证实鲤鱼基因组存在两个不同的sGnRH基因座位。相对定量RT-PCR检测发现,两个sGnRH基因除在精巢的表达存在差异外,在脑区、垂体和成熟卵巢共表达。其中两个sGnRH基因在端脑和下丘脑的表达水平明显高于后脑区。根据sGnRH mRNAs在多个脑区、性腺和垂体的共存推测,sGnRH可能对鲤鱼下丘脑-垂体-性腺轴的调节有至关重要作用,同时可能起神经调节剂或自分泌和旁分泌调节因子的作用。     

鲤鱼(Cyprinus carpio)体细胞系的建立及其生物学特性分析(简报)

动物细胞的培养技术是1907年哈里逊在淋巴块中对蛙的神经板培养成功开始的,其后近一个世纪以来,陆续成功地培养了哺乳动物、昆虫等各种动物细胞,并广泛用于生物科学的各个分支。鱼类的细胞培养的系统研究和建系实践大约起始于60年代,被公认的真骨鱼类的第一个永久性的细胞系——虹鳟性腺细胞系(RTG-2)是由Wolf建立的。随后各种鱼类细胞系相继建立,涉及的组织来源有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、性腺、肝脏、胚胎、囊胚、原肠胚、鳍条等,同时也进行了细胞体外培养条件、保存条件以及生物学特性的研究,为渔业生产和科学研究做出了重要贡献。研究者可利用来自不同种的培养细胞进行细胞杂交(融合)、核移植、DNA介导的基因转移以及一些物理图谱的建立等。细胞系在细胞生物学、遗传学的研究及培育动植物新品种等方面起着重要作用。本文首先对鲤鱼的尾鳍和吻端上皮细胞进行培养,建成鲤鱼体细胞系并对其生物学特性进行了分析。在此试验中我们侧重寻找适合做克隆供体的细胞达到最佳状态的条件, 以优化供体细胞的质量(另文报道)。此研究正在进行中。     

家蝇Thymosin(THY)基因的克隆及原核表达

采用EST测序技术从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫c DNA质粒文库中筛选到胸腺肽(Thymosin,THY)基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,设计引物,通过PCR扩增,测序鉴定,获得THY基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建p ET-28a(+)-THY重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。研究结果表明,THY基因ORF全长384 bp,编码127个氨基酸,理论分子量14.3 k D,等电点为5.22,具有THY家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒p ET-28a(+)-THY,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测发现纯化的目的蛋白大小正确。     

猪生长激素cDNA的分子克隆

用改进的氯化锂沉淀沉法和寡聚(dT)一纤维素亲和层析法由猪垂体制得总mRNA。以此总mRNA为模板,合成cDNA。钝端连接重组到质粒pUC19的SmaI位点,转化E.coli JM107,筛选出阳性克隆。用限制性内切酶酶切签定及5’端部分核苷酸序列分析证明:克隆了全长猪生长激素cDNA,其长度约为896bp。     

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatinC端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatinC端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET／mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatinC端片段的cDNA长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatinC端片段氨基酸的同源性为61％。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28％,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatinC端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中高效表达。小鼠canstatinC端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。     

两种鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因的电子克隆及分析

为研究胰凝乳蛋白酶原在鱼类中的生理功能和作用机制,利用生物信息学的方法,成功获得了鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原的cDNA序列(ccCHTR1和ccCHTR2)并对其进行序列分析。结果显示,ccCHTR1 cDNA含有792 bp的开放阅读框,编码263个氨基酸;ccCHTR2 cDNA含有798 bp的开放阅读框,编码265个氨基酸。二者氨基端均含有18个氨基酸组成的信号肽,同时,在成熟肽的第15和16个氨基酸(R-I)之间存在一个切割位点。氨基酸比对结果显示,ccCHTR1和ccCHTR2具备胰凝乳蛋白酶原的保守结构特征,同时二者有72.8%的同源性,且都与斑马鱼有最高的同源性,分别是93.3%和73.5%。进化分析显示,二者分别与斑马鱼和鳕鱼亲缘关系最近,与哺乳动物的亲缘关系较远。     

Structure, organization and expression of common carp (Cyprinus carpio L.) SLP-76 gene

SLP-76 is an important member of the SLP-76 family of adapters, and it plays a key role in TCR signaling and T cell function. Partial cDNA sequence of SLP-76 of common carp (Cyprinus carpio L.) was isolated from thymus cDNA library by the method of suppression subtractive hybridization (SSH). Subsequently, the full length cDNA of carp SLP-76 was obtained by means of 3' RACE and 5' RACE, respectively. The full length cDNA of carp SLP-76 was 2007 bp, consisting of a 5'-terminal untranslated region (UTR) of 285 bp, a 3'-terminal UTR of 240 bp, and an open reading frame of 1482 bp. Sequence comparison showed that the deduced amino acid sequence of carp SLP-76 had an overall similarity of 34-73% to that of other species homologues, and it was composed of an NH2-terminal domain, a central proline-rich domain, and a C-terminal SH2 domain. Amino acid sequence analysis indicated the existence of a Gads binding site R-X-X-K, a 10-aa-long sequence which binds to the SH3 domain of LCK in vitro, and three conserved tyrosine-containing sequence in the NH2-terminal domain. Then we used PCR to obtain a genomic DNA which covers the entire coding region of carp SLP-76. In the 9.2k-long genomic sequence, twenty one exons and twenty introns were identified. RT-PCR results showed that carp SLP-76 was expressed predominantly in hematopoietic tissues, and was upregulated in thymus tissue of four-month carp compared to one-year old carp. RT-PCR and virtual northern hybridization results showed that carp SLP-76 was also upregulated in thymus tissue of GH transgenic carp at the age of four-months. These results suggest that the expression level of SLP-76 gene may be related to thymocyte development in teleosts.     

香鱼甘油-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达

GPDH(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)是合成脂肪代谢中间产物甘油-3-磷酸的关键酶。通过设计简并引物从香鱼肝cDNA文库中克隆GPDH基因,该基因cDNA序列全长577个核苷酸,单一大的开放阅读框编码一个由351个氨基酸组成的分子量为37.9kD的蛋白。蛋白序列分析表明,香鱼GPDH(aGPDH)与亚洲胡瓜鱼的GPDH序列同源性最高。系统进化树分析表明,GPDH的物种进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致。实时荧光定量PCR结果显示,aGPDH基因在香鱼肝、脾、肾、脑、心和肌肉组织均有表达。香鱼咸淡水适应以后,肝、脾、脑、心和肌肉的aGPDH的mRNA表达水平下调。成功构建重组表达质粒pET-32a-GPDH。SDS-PAGE试验表明,目的蛋白可以在大肠杆菌中大量表达;并制备了抗血清,能与目的蛋白起强的特异性反应,但不与细菌自身蛋白起反应。本研究有助于进一步理解鱼类盐度适应过程中的脂肪代谢调控机制。     

牦牛OB基因的克隆及原核表达

肥胖基因(obese gene,OB gene)表达产物瘦蛋白(leption)具有调节体重、影响动物生长和繁殖率等一系列生物学功能。通过牦牛脂肪组织总RNA的提取,利用RT-PCR克隆出牦牛OB基因的成熟肽cDNA,构建OB基因的原核表达载体OB-pET32a(+),在大肠杆菌表达系统使融合蛋白表达,通过SDS-PAGE检测所表达的融合蛋白。结果表明,克隆的OB基因成熟肽片段为456 bp包含EcoR I和BamH I两个酶切位点,与普通牛、瘤牛该基因的相似性达98.6%。原核表达产物为包涵体形态,大小为31 kD,符合预期结果,为OB基因的高效表达系统的构建奠定基础。     

人Leptin基因的cDNA的克隆和表达

克隆人Leptin基因的cDNA并获取表达的Leptin蛋白,为进一步研究新的Leptin相关蛋白打下基础。以人基因组DNA为模板,用引物悬挂延伸PCR法,克隆与6个组氨酸（6×His）密码子相连的人Leptin基因的cDNA,并将其克隆到体外表达载体pIVEX23MCS上,通过体外快速翻译系统(Roche公司的RTS500环状模板试剂盒和RTS500 ProteoMaster仪器)在体外表达了带有6×His的Leptin融合蛋白。经SDSPAGE及Western blot方法鉴定,融合蛋白大小正确,有172个氨基酸,分子量为1946kD,具有特异的抗原性,且主要以可溶形式存在于反应液上清中。     

人Mn—SOD cDNA的克隆及高效表达

用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,以人肝细胞株（Ｌ０２）总ＲＮＡ为模板,扩增了人锰超氧化物歧化酶（ｈＭｎ－ＳＯＤ）的ｃＤＮＡ。重组到Ｔ７启动子控制下的表达载体ｐＥＴ－２４ａ（＋）中,构建表爱质粒ｐＥＴ－ＭｎＳＯＤ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及蛋白质印迹分析表明,经１ｍｍｏｌ／Ｌ异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后,可高效表达一分子量为２２ｋＤ的蛋白质,与抗人     

人TIMP—3cDNA的克隆,表达及其抗血管生成作用

从人新鲜的胎盘组织中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法获取了人组织金属蛋白酶抑制－３成熟蛋白的ｃＤＮＡ。序列分析表明,ＴＩＭＰ－３成熟蛋白含有１８８个氨基酸残基,其中１２个半胱氨酸残基在ＴＩＭＰ家族中高度保守。将人ＴＩＭＰ－３ｃＤＮＡ插入含７启动子的质粒ｐＥＴ－２４构建表达质粒ｐＥＴ－ＴＩＭＰ３,转化大肠杆菌ＢＬ２１,筛选表达菌株ＢＬＴＩＭＰ３。