3种牡蛎原虫的流行情况调查及多重PCR检测方法

应用聚合酶链式反应(PCR)方法对福建、广东和海南等地沿海的养殖牡蛎进行包拉米虫、派琴虫和单孢子虫检测.结果表明,这些地区的牡蛎均不同程度地感染这些原虫,经鉴定病原为牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫.根据基因库中奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫的基因序列设计多对特异性引物,检测包拉米虫的引物采用世界动物卫生组织推荐引物,通过对多重PCR反应条件的优化,建立可同时检测这3种原虫的多重PCR方法.运用该方法对样品中的牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫进行扩增,结果得到与试验设计相符的303、480和749 bp 3条特异性扩增条带,对其他贝类病原核酸的扩增均为阴性.多重PCR方法最低能检测到10 pg牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫DNA,表明该方法适用于这3种原虫的快速检测和鉴别诊断.     

贝类派琴虫半套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中派琴虫(Perkinsus sp.)的基因组序列,设计了3条特异性引物Perkinsus303-1、Perkinsus303-2和Perkinsus209-1,建立了检测贝类派琴虫的半套式PCR方法。该方法对派琴虫检测得到209 bp的特异性扩增带,检测灵敏度达到0.01 fg的派琴虫质粒DNA。用该半套式PCR对临床样品进行检测,结果表明广西牡蛎、连云港的菲律宾蛤仔和温州溢蛏存在派琴虫感染,说明建立的半套式PCR方法可以用于贝类派琴虫的临床快速检测。     

牛源环孢子虫套式PCR检测方法的建立及初步应用

 【目的】 建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。【方法】根据牛源环孢子虫18S rDNA序列，设计1对保守引物和1对特异性引物，建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法。通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件，进行特异性和敏感性试验。并对168份临床样品进行了检测。【结果】该套式PCR能特异性地扩增出牛源环孢子虫基因组DNA中相应片段，与艾美耳球虫、隐孢子虫、贾第虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应；最低能检测到2.85×10-2 fg的阳性参照DNA；对临床样品检测结果表明PCR技术检查阳性者显微镜检查都为阳性。【结论】建立的套式PCR方法具有高度的特异性和敏感性，有较好的临床应用价值。     

香蕉细菌性枯萎病菌荧光 LAMP 检测体系的建立

【目的】基于香蕉细菌性枯萎病病原(Ralstonia solanacearum)2号生理小种的特异保守引物和LAMP技术建立一种实时荧光定性检测方法,解决常规PCR定性检测特异性低、灵敏度低、耗时长等问题,实现在1 h内能进行准确高效的定性检测,为加强该病害防控检测和检疫工作提供技术支持。【方法】确定被测基因靶序列,利用Primer软件设计两对内外引物。由两对引物、具有链置换特性的DNA聚合酶、模板DNA、甜菜碱、Mg_2SO_4、反应缓冲液、荧光染料等组成LAMP反应体系,采用不必在反应完开管盖检测的实时荧光LAMP方法,针对该方法对于样品DNA定性检测的灵敏度、特异性及可重复性进行试验。【结果】设计的引物能顺利扩增目标基因,实时荧光LAMP检测体系对于香蕉细菌性枯萎病病原生理2号小种有良好的灵敏度、特异性,该方法可重复性强,灵敏度比普通PCR高10倍以上。【结论】香蕉细菌性枯萎病菌荧光LAMP检测体系检测特异性强、灵敏度高、耗时短、不易污染,效果较好。     

家蚕核型多角体病毒LAMP可视化检测技术的建立

[目的]建立针对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的环介导等温扩增(LAMP)可视化检测技术,为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持.[方法]以BmNPV多角体蛋白基因po如为扩增靶标,分别设计5组内/外引物和5条环引物,根据扩增效率筛选最佳引物组合;优化LAMP反应条件,并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验;使用羟基萘酚蓝(HNB)染色对结果进行比色观察,对简化样品处理的条件进行摸索.[结果]使用环引物后LAMP对BmNPV基因组DNA的最低检测浓度为7fg/μL,检测灵敏度得到有效提高,且反应时间缩短.建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性,对样本的检出率高于常规PCR,其最低检测限是常规PCR的100倍.在反应前加入HNB,结果易判断且能减少交叉污染.感染家蚕血淋巴进行100℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应,既简化了操作步骤,又降低了检测成本.[结论]针对BmNPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点,适合用于生产现场的BmNPV感染早期诊断.     

环介导等温扩增技术的引物设计与筛选研究

[目的]研究引物设计与非特异扩增之间的关系.[方法]以单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的特异性基因hlyA与沙门氏菌（Salmonella）的特异基因invA为例设计引物,进行环介导等温扩增.[结果]就环介导等温扩增的任何2条引物而言,如果2条引物3’端的3～4碱基在同一条引物上都有2个互补序列,在常用的LAMP反应体系与反应条件下,必然有非特异性扩增,LAMP引物设计与筛选应避免这种情况出现.[结论]按照该试验的原则设计引物,可降低非特异性扩增.     

鲨鱼弧菌LAMP检测方法的建立

采用环介导等温扩增技术(LAMP)成功构建了一种鲨鱼弧菌的检测方法。根据鲨鱼弧菌的rpoA基因序列设计4条引物(内引物F3和B3,外引物FIP和BIP),并对LAMP扩增反应的各物质浓度和反应条件进行优化,确定最佳反应温度为65°C,最佳反应时间为55 min。该法对鲨鱼弧菌纯菌培养物的检测浓度约为2.4×102CFU/mL,结果比PCR法具有相似或更高的灵敏度,而且操作简单,反应后体系变浑浊,肉眼可辨;加入SRYB Gold荧光染料,阳性反应为绿色,阴性对照为浅橘色,更便于观察,有望发展成为快速检测鲨鱼弧菌的一种有效方法。     

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立

基于猪圆环病毒2型(porcine circocirus type 2,PCV-2)的ORF2基因建立了一种便捷、灵敏而又特异的可视化环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法通过针对PCV-2 6个位点的4条特异性引物,在Bst DNA聚合酶的作用下对PCV-2靶序列进行等温核酸扩增。经过对LAMP反应体系和反应条件的优化,所建立方法在61℃反应1 h能够成功的检测出PCV-2基因组DNA,且操作简单,不需要PCR仪等复杂仪器,结果可经电泳检测及肉眼观察;敏感性和特异性试验表明,所建立的方法能特异地检测PCV-2并且其敏感度可以达到0.5 pg的DNA分子;所建立LAMP方法的阳性检出率与国标PCR的阳性检出率符合度为100%。该研究为PCV-2的现场快速检测提供更加简便、快捷的方法,可以满足基层检疫的需要。     

虾肝肠胞虫环介导等温扩增法(LAMP)的建立

为建立一种快速检测虾肝肠胞虫(EHP)的环介导等温扩增法(LAMP),根据Gen Bank中登录的EHP-SSU基因序列设计6条特异性引物,成功建立了EHP-LAMP检测方法。该方法检出限为3.71个质粒拷贝/μL,并且与虾其他常见病毒病的病原(WSSV、IHHNV、CMNV)均无交叉反应。采用LAMP方法和常规PCR方法对30份具有典型EHP感染症状的对虾样品进行检测,结果显示:LAMP和PCR方法的阳性检出率均为100%。结果表明,建立的EHP-LAMP方法具有高灵敏度、高特异性、高准确度的优点,为对虾肝肠胞虫的快速早期诊断奠定基础。     

食品中金黄色葡萄球菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用

【目的】金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌,主要经食品传播,引起食物中毒、组织及器官的化脓性炎症,建立快速、准确的检测方法对预防和控制金黄色葡萄球菌的传染具有重要意义。【方法】DNA环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一种新颖的快速、高灵敏核酸扩增技术,本研究利用该技术建立金黄色葡萄球菌LAMP检测方法。基于金黄色葡萄球菌高度保守的Sa442基因序列,设计4条特异性LAMP扩增引物,两条外引物F3和B3及两条内引物FIP和BIP,在BstDNAPolymerase作用下,65℃恒温水浴中,对26个种类共45株细菌进行扩增,所试的20株金黄色葡萄球菌均为LAMP阳性,说明所设计的LAMP引物具有高度特异性。【结果】本LAMP方法对纯培养的金黄色葡萄球菌检测灵敏度为25CFU/mL,对污染食品中金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为42CFU/g,40—60min内即可完成检测。检验检疫实践证明,利用本LAMP方法对958份肉类、蛋奶及其制品、人工污染样品等进行检测,检出115份LAMP阳性,与国标法(GB)检测结果一致。【结论】本LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

膜吸附法结合可视化环介导等温扩增技术检测柑橘黄龙病菌

[背景]柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种('Candidatus Liberibacter asiaticus',CLas)侵染引起的一种柑橘病害.对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等.前3种方法都需要依靠准确的...     

植物青枯菌LAMP检测方法的建立

【目的】由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum,简称青枯菌）引起的青枯病（bacterial wilt of plants）是世界范围内危害最为严重的土传细菌病害之一,严重制约了多种经济作物的生产。建立高效、精准的早期诊断技术,是实现青枯病有效防控的基础。论文旨在建立一种能够特异检测青枯菌的环介导等温扩增方法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,实现青枯菌的田间快速检测。【方法】通过比对分析青枯菌的lpxC基因序列,并利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0得到4条LAMP特异性引物,F3（5′- CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3′）、B3（5′-ACCGCAACACGGGATCA-3′）、FIP（5′-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT -3′）、BIP（5′-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3′）。通过单因素变化试验对LAMP反应体系中的各参数进行优化,设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃,设置镁离子浓度为2、4、6、8、10、12 mmol·L^-1,设置内外引物浓度比为2﹕1、4﹕1、6﹕1、8﹕1、10﹕1、12﹕1,确定最优反应体系。以分离自不同寄主的24个青枯菌株为参试对象,5个非青枯菌株（Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia pickettii、Enterobacter sp.、Acidovorax citrulli、Burkhoderia cepacia）为对照,验证LAMP检测方法的特异性。将青枯菌GMI1000菌株的基因组DNA进行10倍梯度系列稀释,以原液和10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍的稀释液为模板同步进行LAMP和普通PCR检测,比较两者的检测灵敏度。将马铃薯青枯病菌株Po41、姜青枯病菌株Z-Aq-1分别与马铃薯块茎和生姜根茎组织悬浮液混合,以LAMP检测方法对混合物进行检测,并以同样方法对表现典型萎蔫症状的人工接种番茄植株和健康植株以及田间马铃薯罹病块茎样品进行检测。反应结果直接通过观察产生的白色焦磷酸镁沉淀情况进行判定,或通过加入1 μL SYBR GreenⅠ荧光染料进行观察,阳性样品为绿色,阴性样品为橙色。【结果】建立了特异性检测青枯菌的LAMP方法,优化后确立了检测体系中FIP/BIP与F3/B3的浓度比为8﹕1（1.6﹕0.2 μmol·L^-1）,镁离子浓度为6 mmol·L^-1,反应温度为63℃。特异性检测结果显示,仅参试青枯菌反应管中的反应液呈现绿色,表明建立的检测体系具有高度特异性。以青枯菌GMI1000菌株的DNA原液及不同梯度的稀释液为模板进行的LAMP和普通PCR检测结果显示,LAMP的检测灵敏度为1.42 pg,比普通PCR高10倍。能够快速准确地从植物组织悬浮液、罹病番茄植物组织及田间罹病样品中检测到青枯菌。【结论】建立的青枯菌LAMP检测方法,高效特异,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果,适合基层和现场检测。     

大蒜X病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

采用逆转录环介导等温扩增技术（RT\|LAMP）,建立一种便捷、灵敏的大蒜X病毒（Garlic virus X, GarVX）的快速检测方法。根据GarVX ORF4序列的保守区设计6条特异性引物,分别识别该保守区的8个位点,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行扩增反应。通过条件优化,在65℃恒温条件下温浴60 min可成功检测GarVX。特异性检测结果表明,该方法可特异性检出GarVX,对大蒜A病毒（Garlic virus A, GarVA）、大蒜D病毒（Garlic virus D, GarVD）、大蒜E病毒（Garlic virus E, GarVE）等的检测均为阴性,且检测灵敏度高,最低检出限为5 pg·μL-1,是RT\|PCR方法的10倍。试验结果表明,RT\|LAMP检测方法可快速、特异、灵敏地检测GarVX,并适合现场快速检测。     

环介导等温扩增技术检测油棕猝倒病菌的研究

油棕猝倒病菌是我国进境植物检疫性有害生物。试验应用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术建立了一种快速敏感的油棕猝倒病菌检测方法。根据ITS区基因上的8个位点,共设计了6条引物,并对反应条件和反应体系进行优化。特异性试验结果表明,引物对油棕猝倒病菌的检测具有良好的特异性;灵敏度试验结果表明引物最低检出限为0。12 ng·μL-1比普通PCR高100倍;检测结果经SYBR Green Ⅰ染色后,肉眼即可观察结果。该方法能够快速、灵敏、特异地检测油棕猝倒病菌,只需一台水浴锅就可以开展检测,非常适合基层现场检测。     

转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

 【目的】建立转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法。【方法】以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S）为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,针对CaMV35S基因的6个区域设计4种特异引物,利用1种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对转基因作物鉴定工作。同时对7种转基因作物进行LAMP检测。【结果】该LAMP方法通过特异性检测含有CaMV35S启动子的转基因作物,其检测结果的特异性与常规PCR方法结果一致,灵敏度是常规PCR的10倍。【结论】转基因作物LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因作物的快速检测,有较好的应用价值。     

基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究

【目的】建立基于荧光显色的可视化禽传染性支气管炎病毒（IBV）环介导等温扩增（LAMP）检测体系,为IBV的快速临床检测提供有力的技术支持。【方法】根据NCBI中收录的IBV 5a+5b基因的8个区域设计了3对LAMP引物,通过对反应体系各组分和条件的优化,建立IBV LAMP检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行验证。分别用SYBR Green I和一定浓度比的钙黄绿素/锰离子混合物作为显色剂,对IBV LAMP检测结果进行可视化判定。应用该检测体系和PCR方法对临床送检的60份样品同时进行检测,比较2种方法的阳性检出率。【结果】成功建立了IBV LAMP检测方法,该方法能够在等温（63 ℃）条件下1 h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低可以检出1拷贝/μL的阳性重组质粒,比普通PCR方法敏感100倍,而对其他病毒检测结果均为阴性。应用SYBR Green I和钙黄绿素/锰离子显色时,阴阳性样品均有强烈的颜色对比,其中0.05 mmol/L钙黄绿素与0.6 mmol/L锰离子混合液可以用于LAMP扩增产物的判断,其结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。在对60份临床样本的检测中,LAMP和PCR方法检测出的阳性样本数量分别为49份和42份。【结论】建立了基于荧光显色的IBV LAMP检测方法,该方法具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力。     

减蛋综合征病毒环介导等温扩增检测方法的建立

根据GenBank登录的减蛋综合征病毒(EDSV)六邻体基因的保守区,设计了3对环介导等温基因扩增(LAMP)引物,优化反应体系,并对其灵敏性、特异性进行验证.结果表明:LAMP优化后的反应体系为外引物浓度0.1μm01·L-1,内引物浓度0.8 μmol·L-1,环引物浓度0.4μmol·L-1,Mg2+浓度8.0 ...