表达HPV6b L1-E7嵌合蛋白的减毒沙门菌诱导小鼠免疫应答

目的　探讨表达人乳头状瘤病毒 6b型 (HPV6b)L1 E7嵌合蛋白的减毒沙门菌诱导小鼠粘膜及系统免疫反应的可行性。方法　对重组减毒沙门菌S .BRD5 0 9 pTETnir15 6bL1E7体外厌氧诱导其表达 ,Westernblot方法鉴定表达的L1 E7蛋白。此重组沙门菌经滴鼻和口服联合粘膜免疫BALB c小鼠 ,采用ELISA方法及足垫肿胀试验分别检测免疫小鼠血清及阴道冲洗液中特异性抗体和DTH反应。结果　Westernblot分析显示 ,重组沙门菌在预计相对分子质量 (Mr) 5 6× 10 3 处有特异染色带 ,提示此重组沙门菌能表达特异的HPV6bL1 E7蛋白。ELISA检测结果表明实验组小鼠阴道冲洗液中HPV6bL1特异性sIgA显著升高 ,和对照组比较两者差异有显著性 (P <0 .0 1) ,但小鼠血清中HPV6bL1IgG抗体无明显变化 ,实验组和对照组两者差异无显著性。DTH结果显示 :与对照组比较 ,实验组小鼠接受HPV6bL1 E7抗原刺激后产生明显阳性反应 ,提示重组沙门菌免疫小鼠产生了针对HPV6bL1 E7抗原的特异性细胞免疫反应。结论　构建的重组减毒沙门菌S .BRD5 0 9 pTETnir15 6bL1E7可激发有效的粘膜免疫及细胞免疫反应 ,为进一步研制新型HPV粘膜疫苗奠定了实验基础。     

HPV11型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察

目的构建人乳头瘤病毒11型L2E7原核表达系统pET9aHPV11L2E7，并纯化蛋白进行小鼠免疫效果研究。方法从尖锐湿疣组织中扩增人乳头瘤病毒11型12、E7基因片段，构建DET9aHPV11L2E7原核表达重组质粒并测序，在大肠埃希菌宿主菌BL21（DE3＋）中经IPTG诱导表达融合蛋白L2E7（553个氨基酸），经SDS—PAGE电泳和Western Blot进行鉴定。CM离子交换介质纯化蛋白免疫BALB／c小鼠，进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果成功构建了pET9 aHPV11L2E7原核表达系统，纯化获得的HPV11L2E7蛋白免疫BALB／c小鼠后能检测到针对HPV11E7特异性的细胞免疫，血清中能检测到高效价抗HPV11L2E7抗体。结论纯化的HPV11L2E7融合蛋白能够引发特异性细胞和体液免疫反应，能作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

HPV16型E6重组蛋白的表达及其兔多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E6原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法通过PCR法从Siha细胞株中获取HPV16 E6基因后克隆至pET21a(+)载体,构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;将重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至E.coli BL21(DE3)中,通过异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达HPV16 E6-His标签融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后通过Western blot法鉴定;将纯化的HPV16型E6重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体, ELISA检测免疫后血清多克隆抗体效价,并用Western blot法和免疫荧光技术分析HPV16 E6兔多克隆抗体的特异性。结果成功构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;在重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,经亲和层析法获得纯化的HPV16型E6重组蛋白,用于免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体,抗体效价为1∶40 000,并用Western blot法和免疫荧光技术确认了多克隆抗体的特异性。结论 HPV16 E6原核表达成功并制备了HPV16 E6兔多克隆抗体。     

人乳头瘤病毒16型L1-E7c嵌合基因的构建表达及免疫学效应的研究

目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-ETc嵌合基因并表达融合蛋白,以期获得防治HPV16感染及相关肿瘤的疫苗.方法 以HPV16型的中国人野毒株为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16 L1-E7c嵌合基因,并转入原核表达载体pET28a( ),获得pET28a( )-L1-E7c表达质粒.以Western blot方法鉴定融合蛋白与HPV16 L1和E7抗体的特异性结合.应用蛋白纯化仪纯化HPV16 L1-E7c融合蛋白,经过复性后,电镜观察病毒样颗粒(cVLP)的形态结构.纯化的蛋白免疫动物,测定疫苗抗肿瘤的细胞免疫及抗体产生情况.结果 经过序列分析和酶切鉴定表明成功构建了HPV16L1-E7c嵌合基因,并在大肠杆菌中可高效表达L1-E7c融合蛋白.此融合蛋白具有HPV16 L1和E7的抗原性,纯化的蛋白复性后可形成嵌合病毒样颗粒(cVLP),纯化的蛋白免疫动物后,产生特异性细胞和体液免疫反应,具有抗肿瘤活性.结论 构建的嵌合基因HPV16L1-E7c可有效表达HPV16 L1-E7c重组蛋白并形成cVLP.此蛋白在动物实验中具有疫苗的免疫保护作用,为HPV16疫苗的研究奠定了实验基础.     

以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析

目的 构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础.方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd -pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd -pVAX1-BLS-L7/L12).以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价.结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生.通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主.结论 所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主.可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗.     

人乳头状瘤病毒16型结构蛋白L1和L2在大肠埃希菌 …

目的　研究人乳头状瘤病毒(HPV)主要结构蛋白L1(HPV16L1)和次要结构蛋白L2(HPV16L2)在原核系统的表达。方法　采用pET30a载体分别构建pET30aL1和pET30aL2质粒,并分别转入大肠埃希菌BL21菌株,经IPTG(异丙基硫代βD半乳糖苷)诱导,表达融合蛋白6×HisL1和6×HisL2,用SDSPAGE和Westernblot方法进行检测。结果　6×HisL1和6×HisL2融合蛋白在BL21菌中高效表达,约2～3mgml,其相对分子质量分别约为60000和97000;6×HisL1降解较6×HisL2多。结论　HPV16结构蛋白L1和L2能在原核表达系统高效表达;6×HisL2稳定性高于6×HisL1融合蛋白。     

共刺激分子B7-2与HPV16L1联合基因免疫小鼠的免疫应答

目的：研究共刺激分子B7-2和HPV16L1重组质粒免疫小鼠的体液免疫反应。方法：用pcDNA-L1和PLXDmB7-2质粒共同肌注免疫C57BL/6小鼠，ELISA方法检测其血清抗体，红细胞凝集抑制实验和HPV16病毒样颗粒结合抑制实验检测其抗体中和活性。结论：HPV16L1和B7-2基因联合免疫小鼠的血清抗体滴度增高。结论：共刺激分子B7-2联合免疫可以增加目的抗原的抗体产生，可能是HPV16有效防治性疫苗研制更有希望的策略。     

滴鼻接种HPV16 L1-E7 DNA初始引发及HPV16 L1 VLP强化免疫可增强小鼠黏膜和细胞免疫

目的探讨HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发及HPV16L1病毒样颗粒(VLP)强化接种小鼠诱发免疫反应的效应,为进一步用于HPV16相关恶性肿瘤的防治提供实验依据。方法以HPV16 L1-E7嵌合蛋白、HPV16 L1 VLP以及HPV16 L1-E7 DNA单独或联合滴鼻免疫雌性BALB/c小鼠,连续使用3周。免疫后采血及收集阴道分泌物,检测特异性抗体。在末次免疫2周后,取小鼠脾细胞,用HPV 16 L1-E7蛋白刺激,检测T细胞增殖反应及IFN-γ水平。结果HPV16 L1-E7嵌合蛋白滴鼻接种可诱导小鼠产生血清HPV16 L1特异性IgG,强化免疫后抗体水平明显增高(P<0.01);阴道局部产生HPV16 L1特异性IgA;在HPV16 L1-E7抗原刺激下,脾细胞上清液中IFN-γ水平升高。HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发和HPV16 L1蛋白加强免疫可增高阴道分泌液中HPV16 L1特异性IgA水平,增高脾淋巴细胞中特异性T细胞产生IFN-γ的水平。结论嵌合病毒样颗粒HPV16 L1-E7和HPV16 L1-E7 DNA疫苗初始引发及HPV16 L1蛋白强化滴鼻接种适用于预防HPV原发性黏膜感染和治疗HPV16相关肿瘤。     

口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.     

HPV16 L1-E7c嵌合基因的重组杆状病毒在昆虫细胞中表达及免疫小鼠的效应研究

目前,关于人乳头瘤病毒疫苗的研究主要集中在嵌合型病毒样颗粒(cVLP)上。本研究制备了昆虫细胞表达的HPV16L1E7cCVLP,并将该蛋白疫苗接种动物,探讨其诱发体液免疫应答和细胞因子的效应。1材料和方法酶切pUC19L1E7c获得L1E7c基因,与杆状病毒转移载体pFastBac1连接,转化DH10Bac菌。PCR扩增L1E7c鉴定重组质粒。BacmidDNA与Cellfectin混合,转染SF9细胞,培养3～6d。进行15%SDS PAGE电泳和WesternBlot,兔抗HPV16L1和E7抗体由美国Galloway教授惠赠。HPV16L1-E7cVLP纯化后做为疫苗。选择6～8周龄BALB/c小鼠,每组6只。第1组…     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清.方法 采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21 b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物.经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白.免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功.表达蛋白相对分子质量(Mr)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清.     

Th17细胞在霍乱毒素黏膜免疫佐剂效应中的作用

霍乱毒素(CT)是霍乱弧菌分泌的不耐热肠毒素,具有很强的免疫原活性和佐剂活性,是当今研究最多且最深入的黏膜免疫佐剂之一.目前有关CT黏膜佐剂作用的机制尚不完全清楚,近来研究发现CT发挥黏膜免疫佐剂作用与其诱导Th17细胞分化密切相关.现就Th17细胞在CT发挥黏膜佐剂效应的机制作一综述.     

优化密码对牛乳头瘤病毒L1基因粘膜免疫的增强作用

为探讨优化密码对牛乳头瘤病毒 1型主要晚期基因 (BPV1L1)免疫原性的影响 ,分别将含野生型和优化密码的人源化BPV1L1基因的真核表达质粒转入减毒沙门菌S BRD5 0 9后 ,通过滴鼻、阴道免疫、静脉注射、腹腔注射等途径免疫小鼠 ,经VLPELISA方法测定抗L1构象性抗体产生 ,MTT法观察诱导的特异性细胞免疫反应。抗体检测结果显示 ,经粘膜免疫途径 ,与含有野生型L1基因的表达质粒pcDNA3WBPVL1相比 ,含优化密码L1基因的pcDNA3HBPVL1诱导产生的SIgA、IgG明显升高 ,而细胞免疫反应无明显差异。表明优化密码能促进乳头瘤病毒晚期基因L1诱导的体液免疫反应 ,减毒沙门菌是PVL1DNA疫苗粘膜免疫的有效载体。     

人乳头瘤病毒11型L1/E7嵌合DNA疫苗的构建及其诱导的免疫效应

目的 构建人乳头瘤病毒11型L1/E7嵌合DNA疫苗pcDNA3 L1-E7并研究其在小鼠中诱导的免疫效应.方法 用分子克隆技术构建重组真核表达质粒peDNA3 L1-E7.重组质粒DNA股四头肌注射免疫小鼠,用ELISA方法 检测L1、E7特异性抗体和脾细胞分泌的IL-2、γ-INF;MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应.结果 成功构建pcDNA3 L1-E7.免疫小鼠后,重组质粒可诱导机体产生特异性脾淋巴细胞增殖及IL-2、γ-INF分泌增加,并诱导机体产生HPV 11-E7 IgG和HPV 11-L1 IgG抗体.结论 嵌合DNA疫苗pcDNA3 L1-E7能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应.     

型特异性、构象依赖性HPV16 L1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:研制具有型特异性和构象依赖性的人乳头瘤病毒16主衣壳L1蛋白(HPV16 L1)单克隆抗体(mAb).方法:利用昆虫-杆状病毒系统表达有生物活性的HPV16 L1蛋白.非变性条件下纯化HPV16 L1蛋白,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠.末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆.非变性Western blot鉴定mAb的型特异性和构象依赖性,细胞免疫组化确定抗体的型特异性.间接ELISA法测定杂交瘤分泌上清及腹水中抗体效价.mAb亚类试剂盒鉴定mAb亚类.结果:获得1株稳定分泌具有型特异性和构象依赖性的HPV16 L1抗体的杂交瘤细胞株,命名为2E3.2E3杂交瘤细胞株细胞培养上清中抗体效价为1:800;小鼠腹水中抗体效价为1:12 800.亚类鉴定结果为IgG1κ.Western blot及细胞免疫组化分析结果显示,2E3 mAb具有型特异性和构象依赖性,只与非变性的HPV16 L1蛋白发生反应,不与HPV18L1、HPV58L1、HPV11L1产生交叉反应.结论:成功制备了型特异性HPV16 L1 mAb,为进一步研究HPV16 L1的抗原表位奠定了基础.     

重组霍乱毒素B亚基与恶性疟原虫多表位融合蛋白的免疫原性研究

目的　评价霍乱毒素B亚基与恶性疟原虫多价抗原的融合蛋白的免疫原性。方法　在大肠杆菌中表达重组霍乱毒素与恶性疟原虫多价抗原的融合蛋白 ,通过免疫小鼠评价融合蛋白的免疫原性。结果　通过亲和层析纯化霍乱毒素B亚基与恶性疟原虫多价抗原的融合蛋白 ,不加任何佐剂 ,以 5 0 μg/只的剂量免疫C5 7BL/ 6J小鼠 ,3次免疫后 ,CTB抗体滴度达 1∶6 40 0 ,抗疟原虫抗体滴度 1∶16 0 0 ,其CTL活性为 2 0 7%。结论　霍乱毒素具有较好的佐剂作用 ,经融合蛋白免疫的小鼠能产生良好的体液和细胞免疫 ,为评价该抗原的免疫保护作用打下了基础     

含密码子优化型HPV16 L1基因重组腺病毒的构建及其免疫效果的研究

目的 构建含密码子优化型HPV16L1基因的重组腺病毒,对其经不同接种途径所诱导的系统性及黏膜免疫效果进行研究.方法 使用Admax系统包装重组腺病毒,纯化的腺病毒以不同方式免疫C57BL/6小鼠,间接ELISA及体外中和实验检测免疫小鼠血清及阴道分泌物中的特异性抗体.结果 重组腺病毒滴鼻接种可同时诱导特异性的系统性及黏膜免疫反应,重组腺病毒肌注免疫仅能诱导系统性免疫反应,而阴道黏膜接种不能有效诱导系统性及黏膜免疫反应.结论 成功构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,重组腺病毒肌注可诱导高滴度的血清中和抗体,滴鼻接种可同时诱导特异性的系统性及黏膜免疫反应.     

共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组非复制型痘苗病毒构建及鉴定

目的构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E6、E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插入;经WesternBlot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白。结论非复制型重组痘苗病毒NTVJE6E7CKL1L2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变候选疫苗。     

人乳头瘤病毒16型野毒株L1-E7融合基因重组腺病毒载体构建及在293细胞中表达嵌合病毒样颗粒的研究

目的制备人乳头瘤病毒HPV16L1-E7重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的重组腺病毒减毒活疫苗。方法以HPV16型的野毒株HPV16-114/K为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16L1-E7融合基因pUC19L1-E7,含L1的1～301氨基酸（AA）和E7的1～60AA的编码DNA序列;并转入腺病毒穿梭质粒pCA14L1-E7,与腺病毒质粒pBHG10共转染293细胞,筛选重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7。以PCR、ELISA和Westernblot方法鉴定重组病毒及其表达的L1-E7蛋白,密度梯度超速离心纯化HPV16嵌合L1-E7VLP,电镜观察VLP的形态结构。结果PCR-DNA序列分析表明成功构建了HPV16L1-E7重组质粒pUC19L1-E7;并获得HPV16重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7,在293细胞中可高效表达L1-E7蛋白,并形成嵌合病毒样颗粒（cVLP）。结论构建的重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7可有效表达HPV16L1-E7cVLP,可进一步用于动物实验,研究其在防治宫颈癌中的作用。