构建重组人pET-32a-瘦素高效的表达载体☆

背景:瘦素的功能是作为脂肪细胞体脂量的信号来认识的,作为体内的能量平衡信号反馈到下丘脑,与其中各部位神经元的受体结合后参与调节进食、饮水、能量代谢.目的:构建原核重组表达载体pET-32a-瘦素并检测其在大肠杆菌BL21中的高效表达.方法:取人脂肪组织,RT-PCR法制备瘦素目的基因,采用DNA重组技术将其克隆至pMD18T与pET-32a原核表达载体,双酶切及测序鉴定,转化大肠杆菌BL21株诱导其表达,SDS-PAGE电泳分离鉴定,表达产物变性复性后,间接酶联免疫吸附法检测抗原反应原性.结果与结论:实验成功扩增出520 bp 的瘦素目的基因并构建了原核重组表达载体 pET-32a-瘦素;测序结果与GenBank收录序列相一致;目的蛋白pET-32a-瘦素呈极高效表达,占总蛋白的50%以上;变性复性后抗原反应原性较复性前明显提高(P<0.01).结果证实,实验成功构建原核重组高效表达的载体pET-32a-瘦素,并提高其抗原反应原性.     

腺苷脱氨酶三种原核表达载体的构建及蛋白表达

目的利用分子克隆技术表达腺苷脱氨酶蛋白。方法从人白细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,再以其为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增腺苷脱氨酶基因,然后将目的基因连接到3种原核质粒pET-28b、pET-32a(+)和pHSIE中,再将测序完全正确的克隆质粒用CaCl2法转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达,并筛选最优表达条件,经Western-blot和SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。结果 3种质粒载体携带的目的基因DNA测序结果证实其很好地连接入载体质粒,表达的ADA蛋白经Western-blot和SDSPAGE鉴定符合,最优表达条件为诱导剂IPTG浓度0.4mmol/L,表达温度为16℃,表达时间为24h。结论该实验成功构建了腺苷脱氨酶的3个原核载体(BL21+pET-28b+ADA,BL21+pET-32a+ADA,BL21+pHSIE+ADA),且3个载体均成功高效表达了腺苷脱氨酶蛋白。     

人EGFR胞外段原核表达及免疫原性研究

目的：研究人EGFR胞外段在原核本质的表达，纯化条件以及对小鼠的免疫原性。方法：以既往构建包含人EGFR胞外段基因的表达质粒为基础，采用基因工程方法构建pET原核表达载体。在大肠杆菌中表达目的蛋白，表达蛋白在变性条件下，通过Ni^2 柱亲和层析纯化以包涵体形式存在的His-Tag融合蛋白，SDS－PAGE检测其纯度。去余His-Tag的纯化蛋白在梯度尿素中透析复性。以复性蛋白免疫小鼠获得抗血清，western blotting及流式细胞仪器检测特异抗体的存在。结论：通过限制酶切分析及测序鉴定表明获得了人EGFR胞外段基因的pET原核表达载体，SDS－PAGE分析表明在IPTG诱导下可以表达90Kd目的蛋白其纯度大于95％，所产生抗体可以识别复性蛋白及表达于A549细胞上的EGFR。提示在大肠杆菌中表达的人EGFR胞外段重组蛋白具有免疫原性，可以进一步用于EGFR免疫研究。     

基于人脂肪组织获取基因构建pET28a-leptin（瘦素）重组子

背景：新近的一些研究认为,采用体外重组瘦素替代疗法对遗传性肥胖、难愈性创面和内源性瘦素缺乏应是行之有效的方法。目的：取人脂肪组织获取瘦素基因,构建pET28a-leptin重组子。设计、时间及地点：单一样本观察,实验于2004—06/00712在江西省医学科学研究所抗肿瘤室完成。材料：取自22岁汉族女性行重睑手术时皮下脂肪组织,冻存于液氮中备用,供者知情同意。方法：取人脂肪组织,反转录一聚合酶链反应得到瘦素基因后,通过DNA重组技术克隆至pMDl8T载体与pET28a原核表达载体,EcoRI＋XhoI双酶切及测序鉴定。主要观察指标：①cDNA扩增结果。②重组质粒鉴定。③DNA测序结果。结果：扩增得到520bp目的基因;所构建重组瘦素原核表达载体pET28a-leptin经双酶切电泳见520bp目的条带,DNA测序与相应基因序列同源性达100％。结论：通过DNA重组至pET28a原核表达载体,经EcoRI＋XhoI双酶切及测序鉴定成功构建pET28a．1eptin重组子。     

金属硫蛋白非融合性原核表达载体的构建

目的：构建表达金属硫蛋白（metallothionein，MT）的非融合性原核表达载体。方法：以大肠杆菌BL21中的PET-GST—MT质粒为模板，PCR扩增目的片段，双酶切，胶回收纯化，连接至pGEM—T载体扩增，双酶切，亚克隆至pBV220载体．转入大肠杆菌DH-5α中。结果：PCR产物大小符合要求．重组质粒PBV220-MT双酶切鉴定与其一致，测序结果正确。结论：成功构建MT原核表达载体，为下一步从DH-5α-pBV220-MT工程菌中表达并纯化非融合性MT打下基础     

链球菌溶血素O抗原的原核表达及条件优化

目的 构建链球菌溶血素O抗原(SLO)的重组表达质粒,并优化其在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法 以A群链球菌DNA为模板,采用PCR法扩增SLO基因,将扩增的基因连接pET-32a(+)表达载体构建pET-32a(+)-SLO重组质粒,重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,转化后的表达菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和自诱导的方式分别诱导及纯化,最终确定最佳的表达条件。结果 PCR扩增的基因大小与SLO基因大小一致,测序完全正确。不同浓度的IPTG诱导均为包涵体表达,且表达量均较低;自诱导的方式,不仅表达量明显提高,且实现了部分可溶性表达。结论 成功构建了SLO的原核表达质粒,优化筛选出能高效可溶性表达的诱导条件,纯化获得了SLO重组融合蛋白质,为进一步的基础及临床研究应用奠定基础。     

梅毒螺旋体TpN15重组抗原的克隆与表达

目的：用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN15重组抗原,为进一步研制梅毒螺旋体疫苗和ELISA诊断试剂盒奠定基础。方法：采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN15基因,进行T-A克隆及测序,然后亚克隆到原核表达载体中,以亲和层析法纯化重组蛋白。结果：成功地构建了pET32-TpN15重组表达载体,TpN15重组蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达。结论：梅毒螺旋体TpN15基因在大肠杆菌中的成功表达为临床检测梅毒感染的新方法和梅毒螺旋体疫苗的研制奠定了基础。     

SPACR原核表达载体的构建和表达

目的构建Sialoprotein associated with cones and rods（SPACR）原核表达载体并高效表达。方法根据基因文库中SPACR基因的cDNA序列设计引物,采用PCR方法扩增SPACR cDNA片段,并克隆进原核表达载体pGEX-6P-1中,转化于大肠杆菌BL21,测序鉴定后,用IPTG诱导表达出目的蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖柱柱层析纯化,收获表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果 PCR后扩增得到的目的片段,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pGEX-6P-1-SPACR构建正确,表达蛋白分子量约为分别为21.2、22.6、36.2及20.8kDa。结论在大肠杆菌中获得了SPACR片段的高效表达,为研究其蛋白功能奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因的克隆与表达

目的对金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因(APE)进行克隆、鉴定与表达,为新型抗菌药物的设计提供参考依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增APE基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建表达APE的重组质粒,将重组质粒先转化大肠杆菌TG1内并提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后再转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果构建了表达载体pET-32a(+)-APE,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导时获得表达,表达的蛋白质相对分子质量为45.2×10~3。结论 APE基因成功克隆到表达质粒内并获得了表达。     

血小板胶原受体糖蛋白Ⅵ体外表达及功能研究

为了深入研究血小板胶原受体糖蛋白Ⅵ(glycoproteinⅥ，GPⅥ)功能及筛选特异性抑制剂，利用基因重组技术体外表达GPⅥ胞外区片段。采用PCR方法扩增GPⅥ胞外区片段eDNA，构建表达载体pET-20b( )-GPⅥ，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，经IPTG诱导表达。表达产物经Ni—NTA Resin纯化、复性：使用Western blot方法鉴定重组蛋白性质；采用胶原结合试验测定重组蛋白的胶原结合能力。结果表明，经测序证明PCR扩增产物与GPⅥ胞外区eDNA序列完全一致；酶切分析证明成功构建了表达载体pET-20b( )-GPⅥ；原核细胞经诱导表达后出现新的相对分子量32kD蛋白条带，诱导产物以包涵体形式存在；Western blot分析表明重组蛋白可与抗Penta—His抗体和抗GPⅥ多抗特异性结合；胶原结合试验表明重组蛋白拥有较好的生物学功能。结论：正确构建了GPⅥ表达载体并成功表达重组蛋白，纯化、复性后的重组蛋白具有良好的抗原性和生物学活性。     

重组金属硫蛋白2A质粒的构建与表达

目的构建重组金属硫蛋白2A(MT-2A)原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究MT-2A奠定基础。方法从人骨骼肌细胞cDNA文库中PCR扩增MT-2A基因DNA序列,构建重组表达质粒MT2A-pET32a,PCR与DNA测序法鉴定插入序列;重组细菌用IPTG诱导表达,His-bind亲和层析柱纯化MT-2A蛋白,Western blotting鉴定蛋白特性。结果扩增获得的MT-2A基因片段长186bp,DNA测序证实MT2A-pET32a重组质粒构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约为29×103,Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒MT2A-pET32a,在大肠埃希菌内诱导表达并纯化获得MT-2A。     

梅毒螺旋体硫氧还原蛋白TP0100的原核表达和鉴定

目的构建梅毒硫氧还原蛋白TP0100基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达重组蛋白,并评价其在梅毒血清学诊断中的价值。方法构建pET-28b-TP0100重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21（DE3）后诱导表达。经镍柱纯化,重组蛋白通过质谱和Western blot进行鉴定。以重组蛋白为抗原建立酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法,并检测临床收集的梅毒血清。结果成功构建表达载体pET-28b-TP0100,测序结果表明质粒中的插入序列与GenBank中TP0100的基因序列相同。重组蛋白表达约占菌体总蛋白的40%,相对分子质量约为23×103。质谱和Western blot分别证实重组蛋白的酶解片段来自于TP0100蛋白,重组蛋白能与梅毒TPPA阳性血清发生特异性反应。ELISA检测20份梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）阳性血清和20份TPPA阴性血清,与TPPA方法的符合率分别为95%（19/20）和100%（20/20）。结论重组硫氧还原蛋白TP0100能够与梅毒患者阳性血清发生特异性反应,是一个潜在的梅毒血清学诊断抗原。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

大鼠脑源性神经营养因子的克隆及原核重组表达载体的构建

目的:构建重组表达载体pGEX-脑源性神经营养因子(BDNF),探讨其原核表达BDNF的可行性。方法:大鼠BDNF进行密码子优化,人工合成BDNF的全基因序列,经回收、纯化、酶切后连接到pGEX原核表达载体中,将重组质粒pGEX-BDNF转化大肠杆菌BL21细胞中,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,利用ELISA方法鉴定其表达的活性。结果:PCR鉴定及测序显示BDNF序列完全正确,BDNF基因的克隆和表达载体构建成功,IPTG诱导表达目的蛋白经ELISA检测,其表达的目的蛋白具有一定的活性。结论:经密码子优化后经人工合成得到BDNF基因片段并成功构建pGEX-BDNF重组表达载体,具有一定的生物活性。     

肺炎链球菌重组PrtA蛋白克隆与表达的相关研究

目的 构建携带PrtA基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组PrtA融合蛋白.方法 根据GenBank中肺炎链球菌表面蛋白细胞壁相关丝氨酸蛋白酶A(PrtA)蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,扩增目的 片段,建立了RT-PCR检测方法.应用RT-RCR方法 扩增得到PrtA蛋白基因,并克隆到pMD18-T载体上,筛选、鉴定阳性重组子pMD18-T-PrtA,然后克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,经双酶切、PCR鉴定,获得重组表达质粒pET-30a-PrtA.将含有pET-30a-PrtA的重组菌,经终浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导后,重组PrtA蛋白获得高效表达.通过Western blot检测结果,检测表达的重组PrtA蛋白的反应原性.结果 所获PrtA基因与GenBank的基因序列同源性为99%;重组质粒经IPTG诱导,不同浓度的IPTG均能诱导重组蛋白表达,且IPTG终浓度为0.6 mmol/L时,目的 蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的18%.通过抗-His标签单克隆抗体在IPTG诱导6 h的重组菌蛋白中检测到一条大小约为40×103的特异性清晰条带,与预期结果 相符,表明表达的蛋白为肺炎链球菌重组PrtA蛋白.结论 成功地克隆和表达了肺炎链球菌表面蛋白细胞壁PrtA,为进一步研究以PrtA蛋白作为免疫原预防和治疗由肺炎链球菌引起的疾病奠定基础.     

人β2-微球蛋白基因的克隆与原核中的表达

本研究获取主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类分子的轻链部分,即β2-微球蛋白（β2m）以制备MHC Ⅰ类分子-肽四聚体.根据已报道的序列设计特异引物,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法从人白细胞中克隆β2m的基因,并构建β2m的原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达.结果显示：构建的编码成熟β2m的pET-β2m可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达β2m,表达量占菌体总蛋白的32%,β2m以包涵体的形式表达,经洗涤、变性后,以Sephacryl S-200HR（S-200）柱层析纯化,纯度可达95%以上,纯化产物采用稀释法复性.Western blot分析表明,该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性.结论：获得了高效表达人β2m的大肠杆菌工程菌株,建立了简便有效的β2m包涵体纯化、复性方法,为制备MHC Ⅰ类分子-肽四聚体奠定了基础.     

刚地弓形虫RH株主要表面抗原1的基因克隆及原核表达

目的 从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增出其主要表面抗原1(SAG1)全长的基因编码序列，构建重组原核表达载体并在大肠埃希菌中进行表达，为进一步研制弓形虫病免疫诊断试剂盒打下基础。方法 根据弓形虫RH株主要表面抗原SAG1的cDNA序列设计一对引物，利用聚合酶链反应(PCR)技术从RH株弓形虫基因组中扩增出SAGl的全长基因，将其克隆到载体pGEX-4T-3中，并通过基因测序加以证实；重新设计引物将其亚克隆至原核表达载体pET-32c中，在大肠埃希菌中经IPTG诱导表达。结果 从刚地弓形虫RH株基因组中成功扩增到1030bp的全长SAG1基因，该基因在原核系统中经诱导表达出一分子量约37000大小的融合蛋白，表达产物以包涵体的形式存在。结论 SAG1是弓形虫主要的表面抗原，原核表达的sAG1融合蛋白在弓形虫病的免疫诊断中具有明显的潜在应用价值。     

烟曲霉硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的原核表达及抗原性分析

摘要：目的：克隆烟曲霉硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TR）基因并构建原核表达载体,获得烟曲霉TR重组蛋白,并鉴定其抗原性。 方法：用RT-PCR方法从烟曲霉总RNA中扩增出TR cDNA片段,克隆至pMD18-T载体,并转化E.coli JM109。经序列分析证实后,提取重组克隆质粒双酶切获得目的基因,与表达载体pET28a(+)连接,转化E.coli BL21（DE3）,筛选重组表达质粒。用异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导重组融合蛋白表达,用SDS-PAGE及免疫印迹法分析重组蛋白质,并用亲和层析柱进行纯化。 结果：构建了含TR全长基因的重组表达质粒,IPTG诱导后可高效表达。免疫印迹结果表明该重组蛋白质可被侵袭性曲霉病患者血清识别。 结论：成功构建了重组表达质粒pET28a(+)/TR,并在大肠埃希菌中获得了高效表达,重组蛋白质具有良好的抗原性,为进一步研究奠定了基础。     

mica基因的克隆及其在原核系统中的表达

本研究构建mica基因原核表达系统并纯化MICA蛋白。利用外周血标本提取RNA,经RT-PCR获取mica基因cDNA。将mica cDNA经TOPO克隆连接构建克隆载体,然后将克隆重组载体和原核表达载体pET-28a经双酶切后进行连接构建重组表达载体,进而转染宿主菌E.coliBL21DE3进行表达。利用亲和层析的Ni-NTASpin纯化重组的MICA蛋白。结果表明:带有重组质粒pET-28a-mica的宿主菌经IPTG诱导表达后,以可溶性形式大量表达重组的MICA蛋白,经Ni-NTA Spin纯化后得到重组的MICA蛋白。结论:本研究构建了mica基因原核表达系统并纯化了MICA蛋白,为探讨MICA与移植免疫的关系奠定了基础。     

HIV-1跨膜蛋白gp41重组抗原的表达及其免疫反应性

目的 为开发和建立敏感、特异的抗HIV-1抗体的检测方法研制重组gp41抗原.方法 根据HIV-1的基因序列,设计并合成了1对PCR扩增引物,应用PCR技术从HIV-1 外膜基因组中扩增出HIV-1的gp41截短体,将扩增的基因片段插入质粒pET-28a中构建成重组表达质粒pET-gp41.诱导表达并纯化gp41重组抗原,对gp41进行了初步应用分析.结果 gp41在大肠埃希菌BL21 (DE3)中获得高表达,表达量占菌体总蛋白量的26.08%.纯化后截短体gp41的纯度为97.94%.经间接ELISA和免疫印迹检测,纯化后的表达产物gp41具有很高的抗原特异性和免疫反应性.结论 研制的重组抗原gp41有较强的抗原性和潜在的应用价值.