猪α干扰素在杆状病毒中表达及其对PRRSV的抑制作用

猪α干扰素具有抗病毒作用,临床上具有广阔的应用前景.为获得重组猪α干扰素,本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪α干扰素基因插入供体质粒pFastBac~(TM) Ⅰ多克隆位点,置于pH启动子控制下,在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化.将重组转移栽体质粒转化DH10感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒.重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blotting证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得表达.镍亲和层析柱纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳相对分子质量为19 000.通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制猪水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测其抗病毒活性为9.67×10~4 U/mL.昆虫培养上清及细胞裂解液经2~8稀释在Mare-145细胞上能够抑制猪蓝耳病病毒增殖.从而为进一步作为抗病毒药物应用于猪疫病的防治研究奠定了基础.     

高致病性PRRSV（HuN株）NSP2基因的扩增与分析

从2006年高热病病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒（HuN株），利用RT-PCR扩增其NSP2基因，通过与标准毒株VR-2332进行比较，发现共有30个氨基酸缺失，其中29个为连续缺失，缺少氨基酸分别位于481、532～560位。将分离株与同时期分离自不同地区高热病毒株的基因序列（EF112445、EF112446、EF112447）相比较，发现全部都具有相同的缺失，这说明引起猪高热病的病原变异不大；与较早期分离的AY150312、AY262352毒株进行比较，发现缺失部位不同。该研究补充和丰富了PRRSV毒株的基因组信息数据，为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。     

高致病性PRRS VORF3基因在昆虫细胞中的表达与免疫原性研究

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3的结构、功能和免疫学特性,本研究根据GenBank登录的高致病性PRRSV变异株(HP-PRRSV) HuN4株ORF3基因序列,经序列分析去除其N端的一部分疏水性区域(1aa～49aa),设计合成引物。将扩增的基因连接于pFastBac HTb杆状病毒载体中,构建重组质粒pF-ORF3,转化至感受态DH10Bac中,获得重组杆粒rBac-ORF3。再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rAc-ORF3。用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)分析表明GP3在昆虫细胞Sf9中获得正确表达,而且具有良好的反应活性。用纯化的GP3免疫小鼠,制备抗GP3多克隆抗血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其效价。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达了重组GP3,经GP3免疫的小鼠体内产生了较高滴度的特异性抗体,证明表达的GP3具有特异的免疫原性。     

表达PRRSV E基因重组质粒在小鼠诱导的体液免疫应答

利用 PCR技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) BJ- 4株的 E基因进行修饰和改造 ,在 E基因上游加入 Kozak序列 ,扩增并克隆 E基因。将 E基因 c DNA亚克隆至真核表达载体 pc DNA3.1( )中 ,构建了真核重组表达质粒 pc DNA- E。用pc DNA- E免疫小鼠 ,经免疫荧光抗体试验检测结果表明 ,重组质粒 pc DNA- E经 3次免疫后 ,所有小鼠血清抗体均为阳性 ,说明pc DNA- E在小鼠体内可诱导特异性的体液免疫应答反应。     

PRRSV核衣壳蛋白基因在杆状病毒中的表达

根据已发表的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 ( PRRSV) CH-1 a分离株核衣壳 ( N)蛋白基因核苷酸序列和杆状病毒转移载体 p Blue-Bac-His B多角体蛋白阅读框架 ,设计合成了 1对特异性引物 P7S1 /P7R1。应用PCR对重组质粒 p UC1 8-ORF7扩增 ,获得了 CH-1 a株 N基因的片段。经 Hind 和 Bgl 双酶切 ,将其定向克隆到同样双酶切的 p Blue-Bac-His B的 PH启动子下游 ,获得转移载体 p Blue-Bac-His B-ORF7。将转移载体p Blue-Bac His B-ORF7与苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒 ( Ac MNPV,简称杆状病毒 )线性化 DNA ( Bac-N-Blue TMDNA)共转染 Sf9细胞 ,经过蓝斑筛选和蚀斑纯化 ,获得重组病毒 r Bac7。经用引物 P7S1 /P7R1和杆状病毒多角体蛋白基因通用引物 PCR鉴定 ,证明目的基因已插入到杆状病毒中。将重组病毒接种于对数生长期的 Sf9细胞 ,分别于感染后 2 4、4 8、72、96、1 2 0 h收集感染细胞 ,经 SDS-PAGE和 Western blot分析 ,结果表明 ,细胞接种重组病毒 2 4 h即开始表达重组蛋白 ,至 96h达到峰值 ,占整个细胞蛋白的 8.4 % ,此后开始下降。表达产物为融合蛋白 ,大小约 2 0 0 0 0。将重组病毒感染的 Sf9细胞用抗 PRRSV N蛋白的单克隆抗体SDOW-1 7进行间接免疫荧光试验 ,结果在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿     

PRRSV云南株的分离与鉴定

从云南某猪场采取病料经RT-PCR检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)阳性,将其处理后接种到猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞上。接种后3 d,猪肺巨噬细胞开始出现细胞病变(CPE);Marc-145细胞盲传3代后,细胞也出现了CPE。对出现CPE的细胞培养物,用RT-PCR法、间接免疫荧光试验进行检测,结果均为PRRSV阳性;细胞培养物经PEG初步浓缩后,接种到PRRSV阴性,PRV、CSFV抗体阳性的仔猪,15 d后猪只出现体温升高并伴有食欲减退,精神不振等症状。采血并用同上的RT-PCR法检测,结果为阳性;采血用同上的RT-PCR法检测,结果亦为阳性;用电镜对纯化后的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,其直径约为50 nm;间接免疫荧光实验可见黄色荧光;TCID50测定其毒价为10-4.75/0.1 mL。该病毒对氯仿、紫外线、酸碱度变化(pH5.0或pH7.5)和热敏感;结果表明,已成功分离获得一株PRRSV云南地方流行毒株,命名为YN-1。     

共表达PRRSV GP5和N蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

利用杆状病毒双表达系统构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP—PRRSV）N蛋白和GP5蛋白的重组杆状病毒Bac—N—GP5,对重组病毒进行间接免疫荧光、Westernblot分析以及动物免疫试验。结果表明：重组杆状病毒中表达了重组N和GP5蛋白,重组杆状病毒免疫小鼠后产生了抗PRRSVGP5蛋白和N蛋白的特异性抗体。本试验成功构建共表达PRRSVN蛋白和GP5蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用该重组杆状病毒作为基因工程亚单位疫苗奠定基础。     

PRRSV重组M蛋白表达及胶体金试纸的制备

为建立PRRSV抗体的检测方法,通过扩增PRRSV ORF6基因,将其克隆至pET-28a（＋）中,IP TG诱导重组质粒转化菌表达,经SDS-P AGE和Western blot鉴定,表明重组质粒能够表达目的蛋白;经亲和层析纯化表达蛋白,以SP A标记胶体金,用纯化M融合蛋白和羊抗猪抗体为检测线和质控线研制胶体金试纸,检测猪血清样品,比较与IDEXX ELISA试剂盒检测结果的符合率。结果表明,表达蛋白具有良好的反应性,制备的胶体金试纸与IDEXX ELISA试剂盒检测符合率为89％,该方法为P RRSV抗体的检测提供了快速简便的方法。     

PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础.     

PRRSV广东变异株分离及NSP2部分序列分析

2006年以来,高致病性猪繁殖与呼吸综合征在我国造成了巨大的经济损失.位于NSP2基因上的30个氨基酸的缺失已成为区分我国2006年以来的PRRSV高致病性毒株和2005年以前的经典流行毒株的特异性标记.本试验在广东省分离到一个新型的PRRSV毒株BL2,其NSP2基因540位～563位(相对于VR2332 ORFIa...     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

本研究以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HPPRRSV)重组NSP2蛋白为包被抗原,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。通过RT-PCR技术,从PRRSV SCMS08株中,成功扩增出NSP2的主要抗原区域。将其克隆到pET-32a(+),成功构建原核表达载体,并转化宿主菌(E.coli)Rosetta 2(DE3)。以镍柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot检测表明所表达蛋白能够被抗组氨酸标签单克隆抗体和PRRSV阳性血清识别。以此蛋白包被酶标板,初步建立了PRRSV NSP2-ELISA诊断方法。优化的NSP2-ELISA的最佳抗原包被浓度为1.7μg·mL-1,血清的最佳稀释度为1∶40。用该方法检测185份血清样品,与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果符合率为90.8%。建立的间接ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征的常规诊断及流行病学调查。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(JX0601)NSP2基因主要抗原区域的原核表达与纯化

本研究采用PCR方法从高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（JX0601）质粒扩增得到NSP2基因的主要抗原决定区域dNSP2,克隆目的基因连接到pGEM—TEasy,再将其亚克隆到pET-32a上,构建表达载体pET—dNSP2,然后转化大肠埃希菌BL-21（DE3）,分别用不同浓度的IPTG诱导表达,经SDS—PAGE电泳分析,所表达融合蛋白的分子质量约为38．3ku,用His Bind Purification Kit试剂盒纯化蛋白,Western blot结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。本试验为进一步研究PRRSV诊断试剂盒奠定了基础。     

2013-2014年我国东北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和NSP2基因遗传变异分析

为了解2013-2014年我国东北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,研究对东北地区3个省份29个地区采集的123份样品进行了检测,并对20份阳性样品的GP5和部分NSP2基因进行了RT-PCR扩增、测序、遗传进化及序列比对分析。结果表明:我国东北地区PRRSV阳性率为16%,与国内外已发表的10株PRRSV参考株相比,GP5基因的核苷酸同源性为84.4%~100%。GP5氨基酸序列分析表明,大多数毒株在氨基酸高变区、中和表位和诱导表位发生了变异,主要变异为:C24→Y24,F25→L25,V27→A27,L28→I28,N34→G34/S34/D34。LN283株GP5和NSP2基因遗传进化树的不同结果表明,LN283株可能涉及PRRSV基因重组。HLJ13株NSP2基因PCR扩增产物有2条相差90 bp的目的条带,且NSP2基因遗传进化树显示两条序列分别属于CH-1a亚群和HuN4亚群,推断HLJ13株可能为经典和高致病性混合感染株。GP5和NSP2遗传进化及氨基酸序列分析结果表明,所有病毒株均属于北美洲型,且以HP-PRRSV为主,经典株与变异株共存。本研究结果可为我国东北地区PRRSV遗传进化研究及疫病防控提供参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株NSP2基因的序列分析

为了分析河北省流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2基因的变异情况,试验对2009年采自秦唐部分地区和廊坊地区的临床发病猪肺组织提取RNA,通过RT-PCR扩增样本中PRRSV的NSP2全序列,并对其进行生物信息学分析,应用DNAStar软件将其与VR-2332、CH-la、MLV、BJ-4、HB-1、HB-2、JXA1、HUB1、HEB1等毒株进行序列比对。结果表明:河北地方株NSP2基因全长2 850 bp,编码的氨基酸均缺失30个不连续的氨基酸;其与国内2006—2007年间分离的JXA1、HUB1、HEB1等高致病毒株亲缘关系较近,而与更早的分离株和疫苗MLV株亲缘关系较远。     

山东省规模化猪场PRRSV NSP2变异株的感染情况调查

为了解山东省规模化猪场猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV) NSP2变异株的感染情况,2010～2011年本研究从山东省未免猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)疫苗猪场、免疫进口PRRS弱毒苗猪场和免疫国产PRRS弱毒苗猪场选择20个临床表观健康的规模化猪场,采集830份血清,利用RT-PCR方法对其进行PRRSV NSP2变异株病原学检测.结果表明山东省规模化猪场普遍存在PRRSV NSP2变异株感染,而且临床表观健康的未免疫PRRS疫苗猪场、免疫进口PRRS弱毒苗猪场及免疫国产PRRS弱毒苗猪场中PRRSV NSP2变异株的检出率由高到低,同一猪群中存在PRRSV NSP2变异株野毒和疫苗毒.     

PRRSV XH-GD株NSP7缺失感染性克隆的构建

PRRSV的非结构蛋白NSP7是病毒的一种高度保守的非结构蛋白,NSP7可以进一步水解产生NSP7α,NSP7β。目前对于NSP7的研究相对较少,对其生物学功能尚不清楚。为了进一步了解PRRSV NSP7对于病毒的复制的作用,本试验通过反向遗传平台在PRRSV XH-GD全长病毒骨架中分别对NSP7α,NSP7β,NSP7编码区进行缺失,构建NSP7以及NSP7部分缺失株的全长cDNA的重组质粒,并对构建的重组质粒进行病毒拯救。结果表明,对NSP7α,NSP7β,NSP7缺失对病毒的拯救是致死性的,推测NSP7对于病毒的复制具有重要作用,本研究结果对于NSP7的相关功能研究提供一定的参考依据。     

3株PRRSV变异株理化特性研究及NSP2、ORF5基因序列分析

用Marc-145细胞从广东省3个发病猪群分离到3株病毒,经RT-PCR方法鉴定为PRRSV变异株(NSP21594～1680bp缺失)。3株分离株第1代均对Marc-145细胞适应性不强,第2代可致典型病变,第3代TCID50分别为103.67、104.20、104.75mL-1;在透射电镜下观察主要为40～70nm大小的圆形、椭圆形具有囊膜的病毒粒子;均对氯仿、酸、碱和热敏感。3株分离株NSP2基因与CH-1a、VR-2332等经典PRRSV相比均存在2个位点30个氨基酸缺失,与JXA1、HUN4、HPDEBV等变异株具有相同缺失特性且高度相似,相似性为98.1%～98.3%。ORF5基因均由200个氨基酸组成,与JX-A1、HUN4、HPDEBV等变异株高度相似,相似性为98.5%～99.0%,且第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R)。本研究进一步证实在广东省内出现以NSP2缺失30个氨基酸为特征PRRSV变异株的流行,也为科学监测和综合防控该毒株感染引起的PRRS奠定了基础。     

Generation of a cold-adapted PRRSV with a nucleotide substitution in the ORF5 and numerous mutations in the hypervariable region of NSP2

A cold-adapted porcine reproductive and respiratory syndrome virus (CA-VR2332) was generated from the modified live virus strain VR2332. CA-VR2332 showed impaired growth when cultured at 37°C with numerous mutations (^S731^F, ^E819^D, ^G975^E, and ^D1014^N) in the hypervariable region of the NSP2, in which the mutation ^S731^F might play a vital role in viral replication at 30°C. Conserved amino acid sequences of the GP5 protein suggests that CA-VR2332 is a promising candidate for producing an effective vaccine against PRRSV infection. Further studies on replication and immunogenicity in vivo are required to evaluate the properties of CA-VR2332.