组织块法培养成年兔肌腱细胞

背景:体外分离培养肌腱细胞,熟悉其生物学特性是研究肌腱愈合机制、改善肌腱愈合内环境的前提和基础。目的:采用组织块法体外培养成年兔肌腱细胞,观察其细胞形态、生长增殖情况以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。方法:无菌条件下取成年新西兰白兔双侧后肢趾屈肌腱,手术显微镜下剥离、去除肌腱外膜组织,剪成组织小块,0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶Ⅰ消化10～15min,离心去上清,将组织小块转移到培养瓶中,贴壁后加入1mL培养液,待细胞游出贴壁生长时,再加培养液继续培养,每3d换液1次,当细胞长到80%～90%融合时按1:3传代。结果与结论:一般10d左右细胞会从组织块游出贴壁生长,此时细胞多呈星形或不规则形,随着时间延长细胞逐渐增多,呈梭形的成纤维细胞样。传代细胞刚接种时圆形,4～6h开始贴壁并伸展为梭形,排列逐渐规则成群。从传代细胞的生长曲线可看出,前4d细胞生长较慢,为潜伏期,第5天后进入快速增殖期,7d以后进入平台期。免疫荧光法证实Ⅰ型胶原染色阳性,而Ⅲ型胶原染色呈阴性。结果表明采用组织块法可在体外成功培养成年兔肌腱细胞。     

小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育

背景:到目前为止已建立了数百个小鼠胚胎干细胞系,一般情况下实验室培养的胚胎干细胞有3个细胞来源,即胚泡内的内细胞群、胚胎生殖嵴的原始生殖细胞和应用克降技术制造人体胚胎并提取干细胞.目的:尝试用自制的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-12/2007-09在辽宁医学院完成.材料:妊娠14.5 d的孕鼠40只,由辽宁医学院实验动物中心提供.方法:无菌条件下剪开孕鼠子宫壁,取出胚胎,去除头、尾、内脏和四肢后采用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理3.5 h后接种于6孔板中,细胞贴壁后即为成纤维细胞饲养层.收集3.5 d的小鼠囊胚,在显微镜下将囊胚置于上述6孔板的中央,五六_人后取隆起生长的内细胞团块,分离后再培养.主要观察指标:成纤维细胞饲养层的制备情况,胚胎干细胞的生长状态、碱性磷酸酶染色结果及分化趋势.结果:光镜下小鼠胚胎成纤维细胞呈不规则形,生长较快,传代比例为1:4,经丝裂霉素C处理后细胞贴壁较慢,失去分裂增殖能力.小鼠囊胚孵出透明带的时间为24～72 h,从胞膜中孵出约为1 d,3～5 d后可形成胚胎干细胞集落,7 d后集落呈"鸟巢"状.组织化学染色后可见细胞内有大量的蓝紫色颗粒沉积,连续培养20 d,期间不换培养液,可见胚胎干细胞团分化为亮度较小、界限清楚的单核细胞.结论:小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

人牙髓细胞体外培养的实验研究

目的 建立人牙髓细胞体外培养模型并研究特异性波形丝蛋白在培养细胞中的表达.方法 采用组织块法体外培养人牙髓细胞,取新鲜拔除的无龋、无感染的智齿或正畸牙的牙髓.结果 经7～8d,在组织块周围有细胞游出,14d后细胞铺满瓶底,可以进行传代.一般可传5～8代.持续生长40d左右.SABC免疫组织化学检测培养细胞波形丝蛋白的表达阳性.结论 通过组织块法可以成功培养人牙髓细胞,为牙髓细胞的进一步研究奠定了生物学基础.     

人类膀胱移行上皮细胞的体外培养与鉴定

背景:移行上皮细胞的分离方法有酶消化法、组织块法及刮削法3种。目的:探讨培养人类膀胱移行上皮细胞和其传代的最佳方法。方法:培养人类膀胱移行上皮细胞,观察细胞在MEM-F12和KSFM培养基中的生长增殖以及形态变化。免疫荧光染色观察上皮细胞特异性蛋白标记AE1及仅在尿路上皮组织中特异表达的尿空斑蛋白Uroplakin III,以鉴定膀胱移行上皮细胞。分别利用4步胰蛋白酶消化法和组织块再植法对细胞进行传代培养。结果与结论:①细胞在MEM-F12培养基中较KSFM培养基中爬出及融合均快,生长状态良好。②细胞免疫荧光鉴定证实为移行上皮细胞。③胰蛋白酶消化传代细胞,传代第18~24h贴壁,贴壁后无法继续生长,60~72h后细胞开始凋亡;组织块再种传代细胞生长稳定迅速,24~48h细胞开始爬出,第10~16天达到80%融合,传至第4代后开始出现衰退。说明以DMEM-F12培养基进行组织块培养法和组织块再种法是人类膀胱移行上皮细胞原代培养和传代培养经济有效的方法。     

兔阴道平滑肌细胞体外分离与培养

背景:阴道平滑肌细胞原代培养主要有两种方法:酶消化法和组织块贴壁法。前者培养所需时间短,产量高,但所需组织量较大,且试验中污染机会大,最佳消化时间不易把握;后者虽方法简便、有效,但培养所需时间较长。目的:观察组织块 酶消化法原代培养兔阴道平滑肌细胞时间,并与组织块法比较。设计、时间及地点:体外观察实验,于2005-02/2006-02在南昌大学第一附属医院烧伤研究所及动物实验室完成。材料:四五个月龄雌性新西兰大白兔,体质量2.0～2.5kg。方法:①组织块法原代培养阴道平滑肌细胞:将修剪好的1mm×1mm×1mm组织块均匀地接种于培养皿中,然后放入37℃恒温培养箱中静置培养3.0～4.0h,待组织块贴壁牢固后,再补加含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液,使组织块浸于培养液中,37℃恒温静置培养3.0～4.0d,待细胞游出后换液,大约每3天换液一次。②组织块 酶消化法原代培养阴道平滑肌细胞:将组织块用0.1%胶原酶Ⅳ在37℃培养箱中消化0.5～1.0h,至组织块边缘变毛时中止消化,然后将消化好的组织块接种于培养皿上,其余步骤同组织块法。③传代培养:第1次传代时机应根据细胞生长具体情况而定,在细胞达50%～60%融合时即进行传代培养。第2次以后传代,在细胞生长达80%融合时进行传代培养。主要观察指标:①原代培养所需时间。②第3代阴道平滑肌细胞表面结构和超微结构。结果:组织块 酶消化法原代培养细胞萌出时间较组织块法早1.0～2.0d,细胞融合时间较组织块法早3.0～4.0d,细胞可稳定传5～6代。倒置显微镜下观察两种方法所培养细胞呈梭形或多角形,融合时部分区域细胞出现平滑肌细胞特征性生长表现"峰-谷"状结构。透射电镜下观察,第3代阴道平滑肌细胞核呈锯齿状,胞浆内含平滑肌细胞特征性结构肌丝和密体,含有大量高尔基体,粗面内质网扩张,游离核糖体丰富,提示获得合成表型阴道平滑肌细胞比例大。结论:组织块 酶消化法原代培养周期较短,需要注意的是在取材、分离整个操作过程中需保持阴道组织块湿润;胶原酶消化组织块时间不应过长,以组织块周边呈现毛须状为度;此外应在静置状态下培养。     

组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的特征

目的:采用组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,并应用光镜、电镜和免疫组织化学方法观察细胞各生长时期的形态变化。方法:实验于2004-02/08在中国医科大学基础医学院药理实验室完成。选择健康清洁级Wistar大鼠30只,体质量150～180g,无菌条件下取全段主动脉中膜组织修剪成1mm×1mm大小的组织块直接贴壁于一次性塑料培养皿中,组织块间距0.5cm,保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀,发现漂起的组织块及时清理,于37℃孵箱内放置1.5h左右使组织块与壁贴附后,缓慢加入改良Eagle培养液培养3～5d,待有细胞从组织块周围游出后换液。当细胞长满培养皿时即可传代。采用倒置相差显微镜和透射电镜及抗α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学方法观察主动脉平滑肌细胞的形态。绘制主动脉平滑肌细胞生长曲线,观察各生长时期的变化,并评估其培养方法的优点。结果:30只大鼠全部进入结果分析。①技术方法优点:贴块方便,直接一次性贴壁使污染机会少,随组织块生长随时清理漂起的组织块,可减少对其他组织块的毒性作用,并增加已游离出的细胞生长空间。②原代培养血管平滑肌细胞:光镜观察形态多样,大小略有差异,胞体较小,胞质折光性强。③传代血管平滑肌细胞:光镜下观察呈现特征性“峰”、“谷”状生长。电镜下观察:细胞形态不规则,胞浆内有肌丝,纵向平行排列,有密区,具备平滑肌细胞特征。免疫组织化学染色后可见细胞浆中大量平行条状棕黄染色、胞核不着色,所有细胞均染色,呈阳性。④主动脉平滑肌细胞生长曲线:血管平滑肌细胞生长曲线近似“S”形,传代后第1天细胞数有所减少,经过2d潜伏适应期后进入对数生长期,持续两三天进入平台期。结论:组织块贴壁法培养技术具有操作简便,污染机会少,有足够细胞生长空间的优点,经光镜和电镜观察培养出新的主动脉血管平滑肌细胞具有平滑肌细胞特征,免疫组织化学染色也显示所有细胞均呈阳性。传代培养后第2天进入对数生长期,持续两三天进入平台期,可产生纯度高及数量多的平滑肌细胞。     

231培养液培养成人大隐静脉平滑肌细胞

目的:应用231培养基培养成人大隐静脉平滑肌细胞探讨其有效方法。方法:实验于2004-11/2005-3在首都医科大学附属北京安贞医院北京心肺血管疾病研究所中心实验室完成。①平滑肌细胞分离:40例冠状动脉旁路移植术患者(年龄43～74岁)术中废弃的大隐静脉,经患者同意无菌取2.0～3.0cm。2.5g/L胰蛋白酶溶液吹打消化15min,去除内皮细胞,同时松动平滑肌细胞,便于细胞游离出组织块生长。将血管剪成2.0～3.0mm2的小块贴到培养瓶底,加入完全231培养液3mL,直立放入37℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的培养箱中,24h后将培养瓶放平使培养液浸没组织块继续培养。②平滑肌细胞传代:当细胞延组织块周围密集成片生长时,即可传代。③平滑肌细胞形态观察:应用倒置显微镜观察平滑肌细胞生长状况,记录生长曲线,观察各生长时期变化。④平滑肌细胞鉴定:应用透射电镜和免疫组织化学方法鉴定平滑肌细胞。结果:①大隐静脉平滑肌细胞形态观察结果:大隐静脉平滑肌细胞原代培养沿组织块长出时间为2～14d,经过7d潜伏期细胞进入对数生长期,细胞呈“峰谷”长势。原代细胞培养第(25±2.1)天传第1代,传代24h后进入对数生长期,细胞传10代以上仍保持良好的形态结构。培养成功率100%。培养过程中未见杂细胞或微生物污染。②大隐静脉平滑肌细胞鉴定结果:电镜下观察,胞浆内富含肌丝,纵向平行排列,胞内有密体,具有平滑肌细胞特征;抗α平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色后可见胞浆内染成褐色呈细丝网状,所有细胞均呈阳性染色。证实培养细胞为平滑肌细胞。结论:利用消化贴块方法分离人大隐静脉平滑肌细胞,应用231培养基进行培养,不仅培养成功率高,并且可产生高纯度及多数量的平滑肌细胞。技术具有操作简便,污染机会少,为心血管疾病研究和组织工程学研究及应用提供可靠的细胞模型。     

血管内皮细胞体外培养方法的实验研究

目的:研究人脐静脉内皮细胞分离培养和鉴定的方法.方法:胰蛋白酶消化脐静脉,脐静脉内皮细胞培养液,贴壁法,37℃,5%CO2细胞培养箱中原代培养,培养2周后免疫组织化学染色鉴定内皮细胞.结果:培养的内皮细胞的形态学观察到脐静脉内皮细胞一般2 h就能贴壁,24 h后,变成梭形.形成数量不等的细胞群.48～72h后生长最快,约5～7 d细胞融合成单层,呈典型的镶嵌状铺路石样.内皮细胞鉴定示90%以上vWF胞浆内阳性显色.结论:脐静脉来源的内皮细胞数量,可以满足实验研究需要.     

人脐带Wharton's jelly源间充质干细胞培养中碱性成纤维细胞生长因子的作用

背景;培养脐带源间充质干细胞过程中,细胞形态常易变得宽大不规则,传代不易贴壁,死亡率高,找到一个维持细胞稳定的方法是有必要的.目的:拟采用组织块培养法从人脐带Wharton'sjelly中分离培养问充质干细胞,观察碱性成纤维细胞生长因子对其生物学特性的影响.方法:采用组织块法分离培养和扩增脐带组织间充质于细胞,对照组用DMEM/F12培养基+体积分数为10%胎牛血清培养,实验组用DMEM/F12培养基+体积分数为10%胎牛血清+20 pg/L碱性成纤维细胞牛长因子培养.观察组织块游出细胞的时间和细胞形态,每隔3 d或4 d更抉培养液,待细胞达到80%～90%融合时,用0.25%胰酶消化后,按1:2或1:3的比例传代.结果与结论:倒置显微镜下观察对照组中从8～10 d开始有细胞从组织块四周游出贴壁,实验组中从6～8 d开始有细胞从组织块四周游出贴壁.1周后可见多数呈长梭形或扁平形的成纤维样细胞,围绕组织块成旋涡状,前3代细胞形态及传代间隔时间两组基本相同; 3代以后实验组细胞较对照组易于贴壁,传代死亡率低,生长曲线提示增殖能力强.流式细胞术分析两组细胞周期显示第3,6代70%以上的细胞处于G0/G1期,且第3,6代细胞均阳性表达CD29,CD44,弱表达HLA-ABC,不表达CD34、CD45和HLA-DR.结果提示采用组织块培养法可从人脐带Wharton'sjelly中分离出具有间充质干细胞特性的细胞,且碱性成纤维细胞生长因子能使细胞从组织块游出时间提前和有助于促使细胞贴壁,一定程度上维持细胞形态稳定性,提高增值能力,并且不改变细胞的表面标志物表达.     

小鼠子宫蜕膜基质细胞的分离培养

目的:蜕膜组织的细胞成分相当复杂,其中蜕膜基质细胞约占全部蜕膜细胞数的75%,其能分泌多种细胞因子,既参与蜕膜营养供应作用又能调节蜕膜局部的免疫微环境.实验拟建立良好的小鼠子宫蜕膜基质细胞培养方法,为进一步建立蜕膜细胞共培养系统将为研究病理性妊娠打下良好的基础.方法:实验于2006-09/2008-01在泰山医学院实验动物中心,SPF级实验室完成.①实验材料:8～10周龄C57BL/6雌性小鼠,由北京维通力化实验动物技术有限公司提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:选用孕龄6～8 d的C57BL/6小鼠蜕膜组织进行体外培养,采用胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶混合消化,进行全组分蜕膜细胞培养,采用原代细胞过夜换液方法清除红细胞、淋巴细胞和不贴学的细胞成分,利用传3代方法对蜕膜基质细胞进行分离提纯.纯化后,观察蜕膜基质细胞的生长变化规律,制作细胞爬片,用催乳素免疫组织化学试剂盒检测培养细胞的成分.结果:①小鼠蜕膜基质细胞在接种24 h后大部分已贴壁,贴壁生长的细胞成纤维母细胞状,一般培养5-7 d后细胞融合成单层.原代培养的蜕膜基质细胞在含10%胎牛血清的培养液中可增生数周,四五天传代1次,传代后的细胞形态无明显变化,而传代培养极性渐不明显.②免疫组织化学显示,体外培养传代后95%阳性细胞为蜕膜基质细胞,细胞大小形状基本均一,染色特点为胞质内可见细小的棕色颗粒,且越近胞核染色越深.结论:采用复合酶消化,换液传代方法提纯蜕膜组织,方法简单、经济实用,并可获得较高纯度的蜕膜基质细胞.     

人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

背景:研究表明FGF2,TGFβ/activin/nodal和IGF信号通路是人胚胎干细胞保持其多能性所必需的,然而直接添加外源性碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和胰岛素是否能够维持人胚胎干细胞的自我更新目前尚无报道.目的:拟建立人胚胎干细胞无饲养层无血清条件下的培养体系.设计,时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09/2009-02在中国科学院昆明动物研究所完成.材料:12.5～13.5d龄清洁级ICR孕鼠2只,由昆明医学院动物中心提供.人胚胎干细胞株BG02购自美国Bresagen公司.方法:①消化离心BG02细胞,重悬于无饲养层过渡培养基后接种,常规培养5～7 d,挑去分化的人胚胎干细胞,加入分散酶消化,切割成小团块,离心重悬后按1:3比例重新接种预铺层粘连蛋白的4孔板,此时培养基换成无血清无饲养层培养基,由80%DMEM/F12、20%KSR、2 mmol/L glutamine、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、ITS(×1)、10~6 U/L青霉素、100 mg/L 链霉素、4 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.12 μg/L转化生长因子β1组成.②无菌条件下取出ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,接种在0.1%明胶包被的6孔板中即为饲养层.将生长在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞株BG02预铺至有层粘连蛋白的培养板上,加入含碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1及ITS的无血清培养基连续培养.主要观察指标:观察BG02细胞在无血清无饲养层培养体系中的形态,采用细胞免疫组化法检测人胚胎干细胞特异性分子标志的表达,检测BG02细胞体外分化能力及其核型,比较BG02细胞在无血清无饲养层和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系中的生长情况、细胞集落分化率.结果:在无血清无饲养层培养体系中,BG02细胞连续传代20代,细胞呈典型的人胚胎干细胞形态特征;BG02细胞表达SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81,Oct-4,但不表达SSEA-1;培养20 d后,BG02细胞进一步分化成3个胚层的细胞,分化细胞能够表达甲胎蛋白、巢蛋白、α-肌动蛋白;培养至20代细胞核型均正常(46XY).与在饲养层培养体系下比较,无血清无饲养层条件下BG02细胞BG02细胞生长速度减慢,细胞倍增时间明显延长(P＜0.05),集落分化率明显升高(P＜0.05).结论:实验初步建立了入胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系,添加碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和ITS可以维持人胚胎干细胞的自我更新.     

人乳牙牙髓基质细胞的分离培养与牙再生能力

背景:在牙组织工程和牙再生的研究中,寻找合适的种子细胞是当前的中心和热点.目的:分离培养儿童乳牙牙髓基质细胞,比较研究矿化诱导前后牙本质涎磷蛋白表达的差异.设计、时间及地点:观察性实验,于2006-12/2007-12在大庆油田总医院中心实验室完成.对象:选择8～10岁儿童8名,男4名,女4名,排除传染病及内分泌疾病史,乳牙排除牙体牙髓牙周疾病.牙髓取材于颌外门诊拔除的滞留乳磨牙.方法:通过组织块贴壁法获得乳牙牙髓基质细胞,并在含体积分数10%胎生血清的DMEM培养基中原代培养14 d,消化传代后用添加有10-8 mol/L地塞米松,50 μmol/L左旋抗坏血酸,10 nmol/L维生素D3,10 mmol/L β-磷酸甘油钠的DMEM/F12培养基诱导培养14 d,用不含添加成分的完全DMEM培养基培养作对照.主要观察指标:显微镜下观察细胞形态变化和生长规律.免疫细胞化学染色比较诱导前后牙本质涎磷蛋白的表达差异.结果:乳牙牙髓基质细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,经矿化诱导14 d后多数细胞由梭形转变成多角形和柱型,胞核大而圆,B0%以卜细胞的细胞质牙本质涎磷蛋白表达阳性.而未经诱导的细胞仍为梭形,仅有2%的细胞牙本质涎磷蛋白染色呈阳性.结论:乳牙牙髓基质细胞经矿化诱导培养后具有向成牙本质细胞分化的潜能,可以尝试作为牙再生研究新的种子细胞来源.     

小鼠胰腺干细胞在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下的体外连续传代培养

背景:胰腺干细胞具有分裂与高度分化潜能的特性,可以在体外进行成功分离和培养,但体外如何对其进行有效扩增是亟待解决的问题.目的:在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下体外传代培养小鼠胰腺干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在广西中医学院基础医学院细胞无菌培养室完成.材料:SPF级新生昆明小鼠20只,孕14 d昆明小鼠多只,均购自广西中医学院实验动物中心. 方法:取SPF级新生昆明小鼠的胰腺组织,V型胶原酶消化,未消化完全的组织块自然沉降后,收集上层的含细胞离散液,离心弃上清,加入含角质细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM培养基,在经多聚赖氨酸溶液处理的24孔板中培养.取孕14 d昆明小鼠,剖腹取胎鼠,去除头部及内脏,将躯干及四肢采用组织块胰蛋白酶消化法分离培养成纤维细胞,调整密度为5×108L-1接种于24孔板中, 传至第3代经丝裂霉素适当处理制备饲养层细胞.取原代培养5 d的胰腺干细胞,按30个/cm2密度种入铺有饲养层细胞的孔板中,当胰腺干细胞铺满小孔底部面积的80%时继续传代.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态变化,原代培养48 h对细胞进行碱性磷酸酶染色,通过免疫组织化学染色鉴定胰腺干细胞特异分子标志物巢蛋白的表达.分别于传代后2,3,4,5 d检测碱性磷酸酶、巢蛋白和胰十二指肠同源盒基因1的表达. 结果:原代培养的来源于胰腺组织的细胞中,可见一些大、圆、单个核的细胞,胞浆折光性强,核浆比例大,呈附壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达胰腺干细胞特异性分子标志巢蛋白,且具有活跃的分裂增殖能力.在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件下对胰腺干细胞进行体外传代培养,可连续传至第3代,各代胰腺干细胞仍保持大、圆、单个核、核浆比例大及增殖能力强等特性,传代后各时间点碱性磷酸酶、巢蛋白染色均呈阳性,胰十二指肠同源盒基因1蛋白染色呈阴性反应,可保持未分化状态. 结论:以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,经丝裂霉素C处理后可分泌供胰腺干细胞生长所需的因子,并抑制胰腺干细胞的自主分化,体外连续传至第3代仍能够保持较好的生长特性、高度增殖能力及未分化状态.     

改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞

背景：乳牙牙髓干细胞具有极强的增殖活力,可以在短期内获得组织工程需要的细胞量。目的：比较传统酶消化法和改良酶消化法获取人乳牙牙髓干细胞的成功率及生物学特性。方法：取无龋滞留乳切牙12颗,随机数字表法均分为两组,分别应用传统酶消化法和改良酶消化法分离获取乳牙牙髓细胞,在不同代次细胞中检测细胞扩增天数、收获量、生长曲线、倍增时间、克隆形成率、细胞表面特异标记物STRO-1、CD146、CD34和CD45的表达。细胞成骨、成脂诱导分化能力及通过检测碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白表达水平,判定细胞牙向分化潜能。结果与结论：两组细胞生长曲线,扩增天数、细胞收获量及细胞倍增时间相比,差异有显著性意义（P〈0.05）;牙向分化实验结果显示,改良酶消化法碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白较传统酶消化法和对照组而言呈强阳性表达。然而,两组在克隆形成率、细胞表面特异标记物及多项诱导分化等方面差异无显著性意义（P〉0.05）。说明改良酶消化法与传统酶消法相比,可在较短时间内完成同源乳牙牙髓干细胞体外扩增培养,可为牙齿再生治疗提供高质量种子细胞,是乳牙牙髓干细胞体外培养的可靠方法。     

酶解组织块法原代培养人牙周膜干细胞和牙髓干细胞

背景:酶解组织法是一种高效的原代细胞培养方法,利用该法可提高牙周膜干细胞和牙髓干细胞的培养成功率。目的:比较牙周膜干细胞和牙髓干细胞的原代培养成功率、细胞形态、生长特征,并对其进行多种细胞标志的鉴定。方法:取因正畸需要拔除健康牙20颗,其中16颗用于牙周膜干细胞原代培养,4颗用于牙髓干细胞培养。酶解组织块法培养两种细胞,MTT法检测两种细胞的生长曲线,利用RT-PCR法、细胞免疫组化法、细胞免疫荧光法鉴定两种细胞的标志。结果与结论:牙髓干细胞的原代培养成功率明显高于牙周膜干细胞,显示更快的生长能力。通过酶解组织法分离纯化的两种干细胞均显示正常的细胞形态和生长特征,表达相应的细胞标志CD105,CD73,波形丝蛋白vimitin,Stro-1,不表达角蛋白CK-17和CD45。提示酶解组织块法是一种高效的原代培养牙周膜干细胞和牙髓干细胞的方法。     

遗传霉素（G418）纯化许旺细胞过程中成纤维细胞胞浆空泡化的光镜观察

背景：以往研究应用遗传霉素（G418）联合差速贴壁及差速分离法除去成纤维细胞用于许旺细胞的纯化,对纯化过程中成纤维细胞形态变化的描述及可能其原理的推测很少。目的：利用光学显微镜采集纯化的不同时期成纤维细胞和许旺细胞形态学照片,描述成纤维细胞病理学变化。方法：利用差速贴壁、差速分离法结合遗传霉素抑制来纯化大鼠坐骨神经来源的许旺细胞。将传代培养的细胞分2组,实验组：细胞重复一次差速贴壁后转移到另一六孔培养板,每2d更换新鲜纯化培养液,用差速分离法传代。对照组：差速分离纯化1次后转移到另一六孔培养板,每2d更换新鲜基础培养液,用差速分离法传代。在纯化的不同时期,利用光学显微镜观察成纤维细胞病理学变化。结果与结论：在纯化的早期,光学显微镜下不能观察到成纤维细胞的病理变化,但成纤维细胞的增殖速度减慢,持续纯化经过3代（三四周）之后,光镜下可观察到逐渐加重的细胞病理变化,直至细胞空泡化。结果表明,应用遗传霉素纯化许旺细胞过程中,成纤维细胞增殖受限较早,但是胞浆的空泡化延迟至第3次传代及以后发生。     

条件培养基诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的连续进行性特征

背景:骨髓间充质干细胞具有多方向分化潜能,如何将其在体外诱导分化为软骨细胞是目前此研究领域的前沿方向。目的:加入一定条件培养基后以体外方式诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,观察其在原代、传代培养一系列连续进行性过程中的特征变化。设计:单一样本、开放性实验。单位:苏州大学附属儿童医院骨科。材料:选取2002-08/2003-09苏州大学附属儿童医院收治的单纯性骨囊肿患者5例,3～12岁,在采用自体骨髓注射移植治疗时,均经家属同意每例患者采集5mL骨髓,与浓度为20U/mL的肝素1mL混匀使用,作为本实验人骨髓间充质干细胞的来源。F-12培养液(美国,Gibco);新生牛血清(杭州四季青生物工程有限公司);胰蛋白酶(美国,Sigma);转化生长因子β1(美国,Sigma);维生素C(南京第三制药厂,批号021017)。方法:①标准培养液的配制:向F-12培养液中加入体积分数为0.1的新生牛血清,青霉素、链霉素各100U/mL,Hepes5.8g/L;NaHCO32g/L,谷氨酰胺0.3g/L,pH调至7.2～7.4。②条件培养液的配制:向标准培养液中加入转化生长因子β1使终浓度为1μg/L,再加入维生素C使终浓度为50μg/L,pH调至7.2～7.4。③细胞原代培养:抗凝骨髓5mL,稀释后离心,取有核细胞层,以3×109L-1密度接种于两个50mL培养瓶,另以1×109L-1密度接种于铺有盖玻片的6孔板。选1瓶及3孔加入条件培养液,另1瓶及余下3孔加入标准培养液,分别于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中饱和湿度培养,48h首次换液,以后2～3d换液1次,均为全量换液。倒置显微镜下观察细胞形态。④细胞传代培养:当加入标准培养液的原代细胞培养10～14d,铺满瓶底的80%以上时,用胰蛋白酶 乙二胺四乙酸的混合液消化传代。取传至3,6代的细胞,每一代均分装于两个50mL培养瓶中,1瓶使用标准培养液,1瓶使用条件培养液;同时在铺有盖玻片的6孔板上,3孔使用标准培养液,3孔使用条件培养液。诱导培养时间≥7d。倒置显微镜下观察细胞形态变化。⑤指标检测:采用阿尔新蓝染色法检测原代及传至3,6代细胞糖胺多糖阳性率。免疫组化法测定第3,6代细胞Ⅱ型胶原的阳性表达。主要观察指标:①细胞形态观察。②糖胺多糖的分泌检测。③Ⅱ型胶原的表达检测。结果:①倒置显微镜下,原代培养的骨髓间充质干细胞多数为成纤维细胞样的纺锤形细胞,偶有宽阔、平坦的多边形细胞,传代后表现为一致的纺锤形细胞,经转化生长因子β1 维生素C条件培养液诱导后变为圆形或椭圆形。②与原代细胞浆内糖胺多糖阳性率82.4%比较,使用条件培养液的第3代细胞糖胺多糖阳性率降低至76.3%(χ2=1.14,P>0.05),第6代细胞则显著降低至68.5%(χ2=5.22,P<0.05)。使用标准培养液的传代细胞均为阴性。③使用条件培养液的第3,6代细胞Ⅱ型胶原均呈阳性表达,可见棕黄色的颗粒分布于细胞浆内;而使用标准培养液的传代细胞均为阴性。结论:人骨髓间充质干细胞在转化生长因子β1及维生素C条件培养基的作用下,糖胺多糖和Ⅱ型胶原表达阳性,表现出软骨细胞的生物学特性。     

鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质千细胞向神经元样细胞的分化

目的:观察人骨髓间充质干细胞经鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导后向神经元样细胞方向的分化情况.方法:取肝素抗凝人骨髓血,Percoll梯度法体外分离培养骨髓间充质干细胞,胰酶消化后传代扩增.取第4～6代骨髓间充质干细胞,当细胞达90%融合时,按2×103/孔接种于24孔板内,第2天分为两组,诱导组用含有50%C6胶质瘤细胞上清液的完全培养基(含体积分数为0.1胎牛血清的L-DMEM培养基)诱导,每隔2 d换液1次;对照组单纯加入完全培养基进行培养.诱导后3 d,两组细胞采用S-P法进行免疫细胞化学染色,检测神经元特异性标志物的表达.结果:诱导24 h后,诱导组多数骨髓间充质干细胞表现出典型的神经元样外观,对照组细胞形态无明显变化.诱导3 d后,诱导组神经元烯醇化酶阳性细胞率显著高于对照组(P<0.01);诱导组神经丝蛋白阳性细胞率为(44.2±2.4)%,对照组为阴性:两组胶质纤维酸性蛋白均呈阴性表达.结论:鼠脑C6胶质瘤细胞上清液可成功诱导入骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较(英文)

背景:通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的:对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法:①预损伤法:预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法:直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论:预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P>0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

人牙髓干细胞的体外培养及神经样诱导分化

背景：牙髓组织来源干细胞的发现及概念的确立有助于从细胞水平上认识牙齿发育和再生修复机制。目的：了解人牙髓干细胞向神经元样细胞诱导分化能力和诱导分化条件。方法：取健康青年人的第三磨牙的牙髓组织后,制成单细胞悬液,加入含有体积分数为15%胎牛血清α-MEM培养基在6孔板培养,传代培养后加入丁羟基茴香醚、forskolin、β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子诱导剂进行培养。结果与结论：免疫荧光和反转录-聚合酶链反应检测显示,诱导2周后人牙髓细胞除了stro-1,Col-Ⅰ,牙本质涎蛋白表达阳性外,还有巢蛋白,神经元特异性烯醇化酶的表达也是阳性,而牙龈纤维细胞表达均为阴性。说明人牙髓组织中存在成体干细胞,在一定的诱导培养条件下,牙髓干细胞有向神经元样细胞分化的潜能。