Klebsiella pneumoniae甘油脱水酶α亚基基因的克隆与序列分析

甘油脱水酶是1,3 丙二醇发酵过程中的重要限速酶,具有很好的工业应用前景.其中α亚基为甘油脱水酶的主要组成部分,该基因的正确克隆与分析对甘油脱水酶的正确表达起重要作用.作者采用PCR技术,从肺炎克雷伯氏杆菌A.S.1.1736基因组中扩增得到了编码甘油脱水酶α亚基的gldA基因,并将其克隆至pMD18 T载体中.经核苷酸序列分析证实,gldA基因开放阅读框架由1668bp组成.经GenBank检索对照分析,gldA基因序列与国外文献报道的同源性达99.34%,表明所克隆的gldA基因即为克雷伯氏甘油脱水酶α亚基基因.     

甘油脱水酶基因(gldABC)与1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的共表达

将dhaT基因片段以顺反子的形式插入到重组质粒pMD19TS2中gldABC基因的下游,形成重组克隆质粒pMD19TS3,进而将gldABC与dhaT基因以多顺反子的形式亚克隆至pET-28a(+)表达载体上。终浓度为1mmol/L IPTG诱导重组大肠杆菌E.coli/pET-28a(+)/gldABC-dhaT 2h,SDS-PAGE电泳分析结果表明分别在甘油脱水酶三个亚基分子量相对应的61ku、21ku、16ku和1,3-丙二醇氧化还原酶亚基分子量相对应的42 ku的位置上出现了特异性条带。上清液中酶活性分别为甘油脱水酶23.7U/mL,1,3-丙二醇氧化还原酶30.4 U/mL。     

产1,3-丙二醇菌株的筛选、改良及发酵

从自然界筛选得到了9株可发酵甘油生产1,3 丙二醇的肠道细菌,经鉴定均为肺炎克雷伯氏菌.经化学诱变,菌株的1,3 丙二醇产量有所提高,其最终产量达到2%左右.     

gldABC基因与dhaT基因串联表达载体的构建

以肺炎克雷伯氏菌As1．1736的基因组DNA为模板，通过基因扩增仪（PCR）扩增得到了目的基因（g1dABC）并将该基因克隆到pMD19-T Simple载体。通过对该基因的序列分析，甘油脱水酶（g1dABC）结构基因的全长为2816bp。将限制性内切酶处理后的含有自身核糖体结合位点的dhaT基因插入到质粒pMD19-T Simple／g1dABC中g1dABC基因的下游，形成重组克隆质粒pMD19-T Simple／g1dABC-dhaT，并进一步将g1dABC与dhaT串联基因亚克隆到表达载体pET28a（＋）上。     

dhaT基因克隆及其与gldABC基因串联表达载体的构建

以肺炎克雷伯氏菌As1.1736的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了目的基因(dhaT)并将该基因克隆至pMD19-T Simple载体。基因的序列分析表明,dhaT基因全长为1164bp,编码387个氨基酸。将含有自身核糖体结合位点的dhaT基因片段插入到pMD19-T Simple/gldABC质粒的gldABC基因下游,形成重组克隆质粒pMD19-T Simple/gldABC-dhaT,并进一步将gldABC与dhaT串联基因亚克隆到表达载体pET28a(+)上。     

budR表达水平对克雷伯氏菌甘油代谢的影响

通过过量表达和反义RNA抑制改变budR表达水平,考察budR表达水平对克雷伯氏菌甘油代谢的影响。过表达budR使得Bud B和Bud C的酶活提高了48.7%和69.7%,1,3-丙二醇产量降低了12.6%,2,3-丁二醇含量增加了73.3%,同时乙酸含量显著降低。反义RNA抑制budR表达后,Bud B和Bud C酶活分别降低了56%和78%,重组菌的生物量、2,3-丁二醇(BDO)、乙酸、乳酸等均表现为略有降低,1,3-丙二醇含量达到23.4g/L,提高约10%。上述结果进一步丰富了budR基因在调控bud操纵子的表达水平、2,3-丁二醇合成及克雷伯氏菌甘油代谢中的作用,为后续代谢改造克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇提供了新的思路。     

克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶酶活分析方法研究

有氧条件下,建立了克雷伯杆菌破碎方法及其生产1,3-丙二醇代谢途径中关键酶酶活测定方法。超声波细胞破碎优化条件为:超声频率30kHz,100%振幅,间歇频率0.6,超声时间12min。细胞抽提液中甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶酶活测定的最适pH分别为12、9.5和7.0,最适温度分别为45oC、45oC和37。甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶用初速度法测定。甘油脱水酶用终止法测定。     

1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD在肺炎克雷伯氏菌中的表达研究

以大肠杆菌(Escherichia coli)基因组为模板,PCR扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD,经测序确认,将yqhD基因与四环素抗性基因TetR同时插入表达载体pUC18构建重组质粒pUC18-yqhD-TetR,重组质粒转化Klebsiella pneumoniae ME308;37℃,经1.0mmol/LIPTG诱导8h,重组肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶的酶活力达到4.16U/mg,而对照菌株的酶活仅为0.62U/mg;将重组菌在摇瓶中进行微氧发酵培养,经IPTG诱导,可将60g/L甘油转化为33.8g/L1,3-丙二醇。     

1,3-丙二醇间歇发酵培养基的优化

从Na+、K+、NH4 +等 1价阳离子对甘油发酵生产 1,3-丙二醇过程中关键酶的活性影响分析出发 ,设计改进发酵培养基组成。通过间歇发酵 ,考察甘油初始质量百分比分别为 2 %、4 %和 6 %的发酵情况 ,结果表明 ,采用无铵培养基氨水调节 pH的发酵 ,甘油的转化率和 1,3 丙二醇的终浓度较高 ,而且与文献报道的培养基相比更为简单 ,有利于工业应用。     

克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶酶活分析方法研究

有氧条件下，建立了克雷伯杆菌破碎方法及其生产1，3-丙二醇代谢途径中关键酶酶活测定方法。超声波细胞破碎优化条件为：超声频率30kHz，100％振幅，间歇频率0．6，超声时间12min。细胞抽提液中甘油脱氢酶、1，3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶酶活测定的最适pH分别为12、9．5和7．0，最适温度分别为45℃、45℃和37℃。甘油脱氢酶、1，3-丙二醇氧化还原酶用初速度法测定。甘油脱水酶用终止法测定。     

甘油耐受菌Klebsiella pneumoniae XJPD-Li合成1，3-丙二醇的研究

利用自行筛选的1,3-丙二醇(1,3-PD)合成菌株Klebsiella pneumoniae XJPD-Li进行发酵,考察了甘油浓度对菌株生长及合成1,3-PD的影响。经多次甘油耐受后菌株XJPD-Li在摇瓶培养48 h,菌体生物量(OD_(650))和1,3-PD产量分别达到1.52和11.16 g/L,相比耐受前分别提高48%和159%。在5 L发酵罐批式培养中,甘油耐受后XJPD-Li菌体生物量并未显著增长,但合成1,3-PD的能力却提高了77%,达到53.13 g/L。     

克雷伯杆菌甘油脱氢酶的分离纯化及性质

在有氧条件下,利用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和Blue Sepharose CL 6B亲和层析提纯克雷伯杆菌胞内甘油脱氢酶.酶的纯化倍数和回收率分别为 32.61 倍和 5.83%.通过SDS PAGE电泳测得该酶亚基的相对分子质量约为 34 000.该酶最适表观反应温度和最适反应pH值分别为60 ℃和11.在30 ℃以下及pH值10~12时,该酶具有良好的稳定性.在45 ℃和pH值11条件下,该酶以甘油和NAD 为底物的米氏常数Km分别为 0.75 mmol/L和 0.12 mmol/L.甘油脱氢酶对甘油的生理反应活性最大,对其它醇类如 1,2 丙二醇、乙二醇也有氧化能力.NH4 和Na 对酶有显著激活作用.巯基保护剂可明显地提高酶的活力.     

微生物发酵粗甘油生成1,3-丙二醇的研究进展

粗甘油是生物柴油生产中的一个主要副产物,而通过微生物可将粗甘油转化为高附加值的1,3-丙二醇。1,3-丙二醇在食品、化工、医药、化妆品等很多领域具有非常广泛的应用。本文从1,3-丙二醇的粗甘油生物转化的迫切性、生产的菌种、合成的途径、合成的基因、发酵转化以及生产中的问题与策略等方面综述了微生物发酵粗甘油生成1,3-丙二醇的最新研究进展。     

GDHt-β亚基基因的套式PCR扩增及其DNA测序

采用套式PCR技术，从肺炎克氏杆菌A．S．1．1736基因组中扩增编码GDHt-β亚基基因，对目的基因进行测序并应用生物信息学进行序列分析，结果扩增出约585 bp的目的DNA片段，经GenBank检索对照分析，该基因序列与国外文献报道的同源性达99．34%，表明成功地获得编码GDHt-β亚基的基因，为进一步研究该亚基的结构与生物学功能奠定了基础。     

肺炎克雷伯氏杆菌二羟丙酮激酶基因(dhaKL)克隆与表达

以肺炎克雷伯氏菌As1.1736的基因组为模板,通过PCR技术成功地扩增了dhaKL基因,并构建了pET-28a(+)/dhaKL表达载体。DNA序列分析的结果表明:dhaKL基因由2个开放阅读框架组成:ORF1全长为1017bp,编码356个氨基酸;ORF2全长633bp,编码210个氨基酸。SDS-PAGE电泳结果表明:dhaKL基因获得了有效表达,上清液中的酶活性为15.6U/mL。     

琥珀酸对产酸克雷伯氏菌好氧发酵甘油产1，3-丙二醇的影响

好氧条件下,通过产酸克雷伯氏菌发酵甘油产1,3-丙二醇的摇瓶实验中发现,添加副产物琥珀酸对菌体生长和1,3-丙二醇合成有促进作用,在5L自动发酵罐上做批式发酵,也得到相似的结果。为探讨其原因,进行了类似的摇瓶实验,分别添加副产物乳酸和乙酸,菌体生长和1,3-丙二醇合成均受到抑制,添加琥珀酸、柠檬酸和苹果酸,对菌体生长和1,3-丙二醇合成均有促进作用。上述结果初步表明,琥珀酸强化了三羧酸循环产生更多的能量,促进了甘油脱水酶的复活,引起1,3-丙二醇产量的增加。