异常瘢痕成纤维细胞在低血清及白介素1β作用下的细胞凋亡研究

目的 明确低血清及白介素1β（IL-1β）对瘢痕疙瘩,增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞诱导细胞凋亡的作用。方法 对6例瘢痕疙瘩、6例增生性瘢痕及6例正常皮肤标本采用细胞培养、免疫组织化学及凝胶电泳方法,通过检测Bax,Bcl-2蛋白及特异性DNA梯形条带,对不同成纤维细胞在低血清中及IL-1β作用后的细胞凋亡进行了研究。结果 （1）在低血清中,瘢痕疙瘩和增生性瘢痕成纤维细胞的Gax/Bcl-2蛋白表达比值没有明显改变,但增生性瘢痕成纤维细胞出现程度较轻的细胞凋亡,而瘢痕疙瘩成纤维细胞未见明显细胞凋亡;正常皮肤成纤维细胞出现细胞凋亡,且Bax/Bcl-2比值升高,表明发生细胞凋亡,（2）IL-1β作用下,三者成纤维细胞均发生凋亡,瘢痕疙瘩和增生性瘢痕凋亡比正常皮肤严重。但Bax/Bcl-2比值在瘢痕疙瘩升高,在正常皮肤降低。增生性瘢痕无明显变化。结论 不同的成纤维细胞特性存在差异。     

Bcl—2和Fas基因在瘢痕成纤维细胞中的表达

目的研究凋亡基因Fas/Apo-1和抑凋亡相关基因Bcl-2在瘢痕形成机制中的作用.方法采用免疫组织化学方法对10例正常皮肤、10例增生性瘢痕及10例瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas/Apo-1和Bcl-2蛋白的表达进行检测.Fas蛋白稀释为1∶50;Bcl-2蛋白稀释为1∶40,阴性对照以PBS代替一抗.随机选择五个高倍视野,计算其细胞平均阳性率.结果Bcl-2蛋白在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中阳性率分别为6.78%、38.6%和83.2%.瘢痕疙瘩、增生性瘢痕的表达阳性率高于正常皮肤,有非常显著性差异(P＜0.01),而瘢痕疙瘩的表达阳性率明显高于增生性瘢痕(P＜0.01).Fas/Apo-1蛋白在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中阳性率分别为78.4%、80.4%和84.4%,三组间无显著性差异(P＞0.05).结论病理性瘢痕的形成与Bcl-2基因的过度表达有关,而对Fas基因介导的凋亡不敏感或凋亡受阻,亦是导致瘢痕过度增生原因之一.     

Bcl-2反义寡核苷酸诱导增生性瘢痕细胞凋亡的研究

目的：探讨反义寡核苷酸(ASODN)对bcl-2基因的表达调控及诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的作用。方法：采用RT-PCR法和流式细胞术检测ASODN对bcl-2蛋白和mRNA表达量的调控；通过MTT法比较两条人工合成ASODN直接作用及脂质体D0’FAt，转染对增生性瘢痕成纤维细胞的抑制效果；用相差显微镜、电子显微镜观察bcl-2ASODN诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡效果。结果：ASODN降低bcl-2蛋白和mRNA表达；两条ASODN抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖的作用呈浓度和时间依赖性，且靶位点于mRNA蛋白编码区(ASODN2)和以DOTAP为载体的ASODN对成纤维细胞的增殖抑制效果最佳。Bcl-2ASODN作用于成纤维细胞后，成纤维细胞缩小、凋亡小体和染色质浓缩等特征性改变出现。结论：bcl-2ASODN能抑制bcl-2mRNA和蛋白表达，诱导成纤维细胞凋亡。     

Bax和Bcl-2在增生性瘢痕中表达及其对瘢痕形成的影响

目的观察Bax和Bcl-2在增生性瘢痕和正常皮肤组织内的表达特征及其对增生性瘢痕形成的影响.方法用免疫组化方法和常规病理技术确定这两种蛋白在8例增生性瘢痕和8例正常皮肤中的表达变化规律.结果在正常皮肤内,Bax主要存在于表皮基底层细胞和部分成纤维细胞的胞浆中;Bcl-2蛋白则分布于表皮基底层细胞的胞浆内.在增生性瘢痕中,Bax主要定位于表皮基底层细胞内,阳性细胞率明显低于正常皮肤水平(P<0.05);含有Bcl-2的阳性细胞主要为表皮细胞和部分成纤维细胞,阳性细胞率显著升高(P<0.05).结论增生性瘢痕的发生可能与Bcl-2蛋白过度表达,抑制细胞凋亡相关,而Bax表达降低,其介导的细胞凋亡受阻亦可能是增生性瘢痕形成的原因之一.     

TNFR1及Bcl-2在病理性瘢痕组织细胞凋亡中的表达及意义

目的研究TNFR1和Bcl-2在病理性瘢痕组织细胞中的表达及其对成纤维细胞凋亡与增殖的影响.方法取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩患者各15例标本,正常皮肤12例标本,应用免疫组织化学方法进行检测,分析TNFR1和Bcl-2的表达及分布规律.结果 TNFR1在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中成纤维细胞的表达阳性率分别为10.70%、3.23%和7.72%,TNFR1在正常皮肤组中的阳性表达率明显高于增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组,而瘢痕疙瘩组阳性表达率却又明显高于增生性瘢痕组,三组间阳性表达率相互比较差异均有显著意义(P<0.01);Bcl-2在增生性瘢痕组(19.35%)和瘢痕疙瘩组(48.33%)的阳性表达率明显高于正常皮肤组(4.07%),三组间阳性表达率相互比较差异亦均有显著意义(P<0.01).结论 Bcl-2的持续过表达可能是瘢痕疙瘩呈瘤样增生的原因之一.介导的死亡受体凋亡通路受阻及TNFR1介导核转录因子NF-kB的激活,表明TNFR1对成纤维细胞的增殖与凋亡具有双重的调节作用.     

三羟基异黄酮诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡及其机制研究

目的：探讨三羟基异黄酮（Genistein）诱导体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的作用及相关机制。方法：体外分离培养人增生性瘢痕成纤维细胞,不同浓度Genistein作用后,MTT比色法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western Blot法检测细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达。结果：在Genistein作用下,增生性瘢痕成纤维细胞的生长受到抑制;细胞凋亡率增加,与对照组相比具有显著性差异（P〈0.05）;Bcl-2的表达下调、Bax、Caspase-3表达增加。结论：Genistein可通过诱导凋亡抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖,其作用机制可能与影响Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡调控基因的表达有关。     

肥厚性瘢痕细胞凋亡检测及其相关调控因素的研究

目的　探讨肥厚性瘢痕的发生与成纤维细胞和血管内皮细胞凋亡的关系，以及有关调控因素的影响。　方法　应用原位末端标记和免疫组织化学染色等技术，对61例烧伤后整形患者肥厚性瘢痕和20例其他手术患者非肥厚性瘢痕进行了细胞凋亡以及ICE、Bcl-2表达的检测。　结果肥厚性瘢痕增厚期、成熟期成纤维细胞以及血管内皮细胞凋亡阳性细胞指数分别为6.60±4.43和8.90±6.01，成熟期分别为25.60±5.70和26.60±6.02，两期同种细胞间相比，凋亡阳性细胞指数均有非常显著性差异（P＜0.01）。增厚期ICE阳性表达率较成熟期显著降低（P＜0.01），而Bcl-2阳性率却显著高于成熟期组（P＜0.01）。　结论　细胞凋亡减少可能与肥厚性瘢痕的形成有关，ICE和Bcl-2可能参与了肥厚性瘢痕成纤维细胞和血管内皮细胞凋亡的调控。     

虾青素对人源增生性瘢痕成纤维细胞的作用及机制研究

目的:探讨虾青素对人源增生性瘢痕成纤维细胞的作用以及机制研究。方法:体外培养人源增生性瘢痕成纤维细胞分别加入0、10、50、100μmol/L浓度的虾青素作用24h,MTT法检测细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;ELISA法检测细胞中的TIMP-1、MMP-1、COL-I及COL-Ⅲ的浓度;Western-blotting检测Bcl-2、α-SMA、TGF-β1及Bax等蛋白的表达。结果:不同浓度的虾青素使人源增生性瘢痕成纤维细胞活力降低而凋亡率增加;促凋亡蛋白Bax表达上调,抑制凋亡蛋白Bcl-2表达下调,同时抑制α-SMA、TGF-β1的表达及TIMP-1、MMP-1、COL-I、COL-Ⅲ合成。结论:虾青素能诱导人源增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡并抑制HSF细胞增殖、转化,减少胶原分泌,促进胶原酶解,继而有效改善增生性瘢痕的发生与发展。     

干扰素α-2b对瘢痕成纤维细胞凋亡的影响

目的:探讨干扰素α-2b对瘢痕成纤维细胞(fibroblasts cell FB)凋亡的影响。方法:利用免疫组织化学和原位杂交方法检测瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、正常皮肤体外培养FB的Bax和Bcl-2蛋白以及DNA的变化。结果:瘢痕疙瘩FB的Bcl-2蛋白表达量减少(P<0.05),瘢痕疙瘩FB的Bax、增生性瘢痕及正常皮肤FB Bax和Bcl-2蛋白表达无显著性变化(P>0.05)。三者FB Bax/Bcl-2b比值无明显差异(P>0.05),DNA检测三者FB未见典型的细胞凋亡的梯形条带。结论:干扰素α-2b不能诱导瘢痕疙瘩和增生性瘢痛FB细胞凋亡。     

TNFR1及Bcl-2在病理性瘢痕组织细胞凋亡中的表达及意义

目的　研究TNFR1和Bcl- 2在病理性瘢痕组织细胞中的表达及其对成纤维细胞凋亡与增殖的影响。方法　取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩患者各 15例标本 ,正常皮肤 12例标本 ,应用免疫组织化学方法进行检测 ,分析TNFR1和Bcl- 2的表达及分布规律。结果　TNFR1在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中成纤维细胞的表达阳性率分别为 10 .70 %、3.2 3%和 7.72 % ,TNFR1在正常皮肤组中的阳性表达率明显高于增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组 ,而瘢痕疙瘩组阳性表达率却又明显高于增生性瘢痕组 ,三组间阳性表达率相互比较差异均有显著意义 (P <0 .0 1) ;Bcl- 2在增生性瘢痕组 (19.35 % )和瘢痕疙瘩组 (48.33% )的阳性表达率明显高于正常皮肤组 (4.0 7% ) ,三组间阳性表达率相互比较差异亦均有显著意义 (P <0 .0 1)。结论　Bcl- 2的持续过表达可能是瘢痕疙瘩呈瘤样增生的原因之一。介导的死亡受体凋亡通路受阻及TNFR1介导核转录因子NF -kB的激活 ,表明TNFR1对成纤维细胞的增殖与凋亡具有双重的调节作用。     

激素治疗瘢痕的机理研究

目的　明确类固醇治疗瘢痕的具体作用机理。　方法　用细胞培养、免疫组织化学及分子生物学技术对 6例瘢痕疙瘩 ,6例增生性瘢痕患者及 6例正常人皮肤的成纤维细胞在激素作用下的细胞凋亡进行了研究 ;同时对 6例激素局部注射后的在体增生性瘢痕的成纤维细胞的增殖、生物合成及细胞凋亡进行了研究。　结果　 (1)激素可以诱导体外培养的不同成纤维细胞的凋亡 ,同时伴有Bax/Bcl 2蛋白比率的升高。 (2 )局部注射激素可以通过抑制PDGF基因表达而抑制瘢痕成纤维细胞的在体增殖。 (3)局部注射激素可以通过抑制转录而抑制前胶原基因表达从而抑制在体瘢痕成纤维细胞的I、III型胶原合成。 (4)激素局部注射可引起瘢痕c myc和p5 3基因表达增高从而诱导在体瘢痕的细胞凋亡。　结论　激素治疗瘢痕的疗效是通过抑制增殖及生物合成促进细胞凋亡而实现的。     

增殖瘢痕成纤维细胞接触后增殖及生物合成特性对异常瘢痕形成的机理

目的 为明确不同异常瘢痕成纤维细胞在体外完全接触后其增殖活性及生物全成功能的特性。方法 以瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮肤（各6例）为材料，通过细胞培养、免疫组织化学及分子生物学等方法，对不同成纤维细胞在细胞接触及未接触时通过检测增殖细胞核内抗原、P16、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及前胶原基因表达对成纤维细胞的增殖、抑制及生物合成进行了研究。结果 瘢痕疙瘩成纤维细胞接触表现为细胞交叉重叠及较高的增殖活性及旺盛的生物合成功能，提示其失去了接触性抑制及密度抑制。皮肤成纤维细胞接触后则增殖及生物合成功能明显下降。增生性瘢痕成纤维细胞接触后表现为旺盛的生物合成功能，但其增殖活性处于瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞之间。结论 不同瘢痕成纤维细胞接触后增殖及生物合成的特性可能是形成不同瘢痕的机理之一。     

Smad7 down-regulation via ubiquitin degradation mediated by Smurf2 in fibroblasts of hypertrophic scars in burned patients

TGF-β1 (transforming growth factor β1) was considered to play a critical role in the forming of hypertrophic scars. Smad, as a kind of signal downstream mediators, can modulate the functions of TGF-β1. Smad7 can regulate TGF-β1/Smad pathway and present negative feedbacks, which prevents fibrosis mediated by TGF-β1. Nonetheless, the mechanisms related to Smad7 activity in regulating hypertrophic scarring are hardly known. The studies have shown that Smad7 decrease induced by the increase of Smurf2 (Smad ubiquitination regulatory factor 2, an E3 ubiquitin ligase of Smad7) ubiquitination degradation plays a part in fibrosis. We thus made a hypothesis that Smad7 could not inhibit TGF-β1 because Smurf2 ubiquitin degradation was increased in hypertrophic scar fibroblasts. In our research, it was discovered that there was an increase in Smad7 mRNA levels but no increase in Smad7 protein levels in the fibroblasts of hypertrophic scars after TGF-β1 treatment. The ubiquitination activity and degradation of Smad7 protein were increased in the fibroblasts of hypertrophic scars compared with the fibroblasts of normal skin. Enhanced degradation of Smad7 protein in the fibroblasts of hypertrophic scars was prevented by proteasome inhibitors MG132 / MG115. Furthermore, it was found that TGF-β1 stimulation increased Smad7 protein expression after silencing Smurf2 gene in hypertrophic scar fibroblasts, and enhanced Smad7 degradation was prevented in hypertrophic scar fibroblasts after Smurf2 was silenced. It was implied that ubiquitin degradation mediated by Smurf2 might contribute to decreased Smad7 protein levels following TGF-β1 stimulation in the fibroblasts of hypertrophic scars.     

增生性瘢痕内应激活化蛋白激酶及其游信号分子基因表达的变化

目的　探讨增生性瘢痕和自身对照正常处皮肤中应激活化蛋白激酶 (SAPK)及其上游信号分子MAPKs(MKK4和 MKK7)基因表达的变化。　方法　提取 8例增生性瘢痕和自身对照正常处皮肤组织的总 RNA后 ,分离纯化 m RNA,用 RT- PCR方法检测 SAPK,MKK4和 MKK7基因在不同组织中的表达变化规律。　结果　增生性瘢痕中 ,MKK7和 SAPK基因表达较弱 ,自身对照皮肤组织中 ,这两种基因 PCR结果的灰度比分别为增生性瘢痕的 1.5倍和 2 .6倍 ,基因表达量明显升高 (P<0 .0 1) ,而 MKK4在这两种不同类型组织中的表达量无统计学意义 (P>0 .0 5 )。　结论　增生性瘢痕中 MKK7和 SAPK基因表达降低引起细胞凋亡减少 ,可能是瘢痕内成纤维细胞大量增殖 ,增生性瘢痕形成的机制之一。     

595nm激光对兔耳瘢痕成纤维细胞增殖与凋亡的影响

目的：探讨595nmVbeam激光照射对增生性瘢痕动物模型伤口愈合过程中成纤维细胞增殖与凋亡的影响。方法：成年大耳白兔20只,建立兔耳腹侧面增生性瘢痕模型,对比研究在瘢痕形成过程中595nmVbeam激光照射对兔耳瘢痕成纤维细胞的影响,采用免疫组化方法检测增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达和细胞凋亡的原位检测。结果：兔耳增生性瘢痕经595nmVbeam激光照射后,按不同时间段取材进行免疫组化染色并与对照组比较,高倍镜下观察结果,显示PCNA蛋白表达明显减弱,细胞凋亡增加。结论：595nmVbeam激光照射可抑制兔耳增生性瘢痕成纤维细胞的增殖过程,诱导细胞凋亡。应用595nmVbeam激光预防和治疗瘢痕是可行的。     

曲安奈德、干扰素α-2b和维拉帕米治疗增殖瘢痕的作用机制比较

目的 比较曲安奈德、干扰素α-2b和维拉帕米局部注射对瘢痕疙瘩和增生性瘢痕增殖、凋亡和TGF-β1表达的影响. 方法 增生性瘢痕和瘢痕疙瘩各6例,局部注射曲安奈德(40 mg/ml)、干扰素α-2b(150万U/ml)和维拉帕米(2.5 mg/ml)后7 d,切取标本,采用免疫组织化学、末端脱氧核苷酸介导的生物素化的脱氧尿嘧啶DNA切口末端标记方法,检测细胞增殖核抗原和TGF-β1的表达及细胞发生的凋亡情况,并以未注射药物的瘢痕疙瘩和增生性瘢痕以及健康皮肤为对照. 结果 ①曲安奈德可抑制瘢痕疙瘩和增生性瘢痕细胞增殖和诱导细胞凋亡,同时抑制细胞TGF-β1表达从而抑制瘢痕的增殖增生;②干扰素α-2b可通过抑制瘢痕疙瘩、增生性瘢痕细胞的增殖和TGF-β1表达而抑制瘢痕的增殖增生,但其不能诱导细胞凋亡;③维拉帕米可通过抑制瘢痕疙瘩、增生性瘢痕细胞的增殖和诱导细胞凋亡而抑制瘢痕的增殖,同时抑制细胞TGF-β1表达,其诱导细胞凋亡的作用妹强于曲安奈德,但抑制TGF-β1表达作用弱于曲安奈德和干扰素α-2b. 结论 曲安奈德、干扰素α-2b和维拉帕米局部注射后,对瘢痕疙瘩和增生性瘢痕在临床上虽均有效,但作用机制不尽相同.     

瘢痕中肌动蛋白及肌球蛋白的实验研究

目的　探讨增生性瘢痕、瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞中肌动蛋白和肌球蛋白Ⅱ的不同表达情况及其与瘢痕挛缩的关系。方法　取增生性瘢痕15例,瘢痕疙瘩10例,正常皮肤15例,用免疫组织化学方法检测其中肌动蛋白和肌球蛋白Ⅱ的表达情况,同时做细胞培养,用流式细胞术检测成纤维细胞中肌动蛋白和肌球蛋白Ⅱ的表达情况。结果　增生性瘢痕肌球蛋白Ⅱ的免疫组织化学染色呈阳性,而瘢痕疙瘩及正常皮肤肌球蛋白Ⅱ的表达均为阴性。增生性瘢痕肌球蛋白Ⅱ的表达较其它两种组织有非常显著性差异(P<0.01),而瘢痕疙瘩和正常皮肤无显著性差异(P>0.05)。流式细胞术检测增生性瘢痕、瘢痕疙瘩及正常皮肤三种组织中肌球蛋白Ⅱ的阳性率分别为(95.11±2.78)%、(16.86±7.11)%及(5.31±1.79)%,增生性瘢痕肌球蛋白Ⅱ表达的阳性率较其它两种组织有非常显著性差异(P<0.01),而瘢痕疙瘩和正常皮肤无显著性差异(P>0.05)。三种组织中肌动蛋白的免疫组织化学染色均为阳性,无显著性差异(P>0.05)。流式细胞术检测三种组织中肌动蛋白的阳性率分别为(77.77±15.43)%、(88.89±10.29)%及(82.92±13.48)%,其表达的阳性率无显著性差异(P>0.05)。结论　瘢痕挛缩与肌球蛋白Ⅱ密切相关,而肌动蛋白在细胞中除作为细胞的收缩蛋白之一外,同时与细胞的活动及运动有关,是细胞生命活动中必不可少的蛋白之一。     

细胞信号传导在激素和干扰素诱导的增殖瘢痕成纤维细胞凋亡中的作用

目的 探讨对瘢痕疙瘩和增生性瘢痕成纤维细胞在激素和干扰素α-2b(IFNα-2b)作用后是否产生凋亡,以及相关细胞信号传导通路的激活或抑制是否一致.方法 对6例瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及6例皮肤标本,采用细胞培养、免疫组织化学、凝胶电泳及FACE ELISA方法通过检测Bax和Bcl-2蛋白表达、特异性DNA梯状条带以及激活(磷酸化)的ERK1/2和JNK的吸光度A值,对不同成纤维细胞在地塞米松(0.1 mg/ml)和干扰素α-2b(1000U/ml)作用后的细胞凋亡及相关细胞信号传导通路进行了研究.结果 地塞米松可通过激活ERK1/2和JNK细胞传导通路诱导三类不同来源成纤维细胞发生细胞凋亡;干扰素α-2b不能诱导这三类不同来源成纤维细胞发生明显细胞凋亡,且IFN α-2b抑制增殖瘢痕的ERK1/2通路,而对JNK通路无影响,其不引起正常皮肤成纤维细胞ERK1/2和JNK通路的变化.结论 激素类药物和干扰素α-2b对瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的作用机制不同.