miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。     

腺病毒介导的人HGF转染大鼠骨髓间充质干细胞及其作用研究

目的：评价携带HGF基因的腺病毒栽体转染鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的效率，以及转染HGF基因对MSC增殖与分化的影响。方法：采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效果和转染率；采用ELISA方法检测转染后HGF的表达情况；细胞增殖分析采用MTT法；MSC向成骨细胞分化采用碱性磷酸酶染色法。结果：转染效率与病毒滴度(MOI)具有量效关系，随着MOI的增加，转染率明显增高，当MOI=400时，转染率可达99．99％。转染HGF后，MSC表达HGF明显增高，48h可达128ng/ml，随后逐渐下降并维持2周以上；转染HGF对MSC的增殖以及向成骨分化没有影响。结论：MSC是一种理想的基因载体细胞，可用于HGF的基因治疗。     

CTLA4Ig基因转染猪皮敷料治疗烧伤临床疗效的Meta分析

【摘要】 目的 系统分析细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白 (CTLA4Ig)基因转染猪皮敷料对烧伤创面的治疗效果。方法 计算机检索中文科技期刊数据库 (维普)、中国期刊全文数据库(中国知网)、中国学术期刊数据库 (万方)、PubMed、The Cochrane Library等数据库建库至2020年12月公开发表的CTLA4Ig 基因转染猪皮敷料治疗烧伤创面的相关文献,并根据纳入与排除标准筛选符合标准的文献进行质量评价及Meta分析。结果 共纳入符合标准的文献5篇,包含烧伤患者368例。Meta分析结果显示,创面行CTLA4Ig 基因转染猪皮敷料治疗的烧伤患者创面愈合时间明显短于其他疗法(MD=-4.01,95% CI 为 -5.08～-2.95,P < 0.001)色素沉着/脱失发生率明显低于其他疗法 (RR=0.16,95%CI为0.08～0.33,P < 0.001),而创面感染率和瘢痕增生 情况与其他疗法无明显差异 (RR = 0.14、0.61,95%CI为 0.02～1.10、0.37～1.01,P = 0.060、0.050)。结论 与其他疗法相比, CTLA4Ig 基因转染猪皮敷料更能有效缩短烧伤创面愈合时间、减少色素沉着/脱失。     

基因修饰人骨髓间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞异种移植的实验研究

目的观察人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-免疫球蛋白融合蛋白(hCTLA4-Ig)基因修饰的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)作为种子细胞异种移植到F344大鼠体内是否成骨,探索获得骨组织工程异基因种子细胞的一种方法。方法应用含有目的基因hCTLA4-Ig和增强绿色荧光蛋白(EGFP)的逆转录病毒感染第1代hMSCs,应用G418筛选出抗性细胞群(hMSCs-CTLA4);用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法分别检测hMSCs-CTLA4中hCTLA4-IgmRNA和蛋白质表达。用荧光激活细胞分选仪(FACS)检测hMSCs-CTLA4中表达hCTLA4-Ig蛋白的阳性率。将hMSCs-CTLA4作为种子细胞在体外构建组织工程骨并移植到F344大鼠皮下,用X线片、组织形态学、免疫组织化学方法分别观察其体内成骨状况和hCTLA4-Ig表达情况。结果分离的hMSCsCD105表达阳性,CD34表达阴性。hMSCs-CTLA4的细胞形态呈梭形,与hMSCs比较无明显改变;倒置荧光显微镜观察见绝大多数细胞呈绿色,强阳性表达EGFP。RT-PCR、免疫细胞化学结果分别证实hMSCs-CTLA4表达hCTLA4-IgmRNA和蛋白。FACS检测结果显示:hMSCs-CTLA4表达hCTLA4-Ig蛋白的阳性率为78.4%。本实验构建的组织工程骨,每克脱钙骨基质(DBM)上吸附、生长的细胞约(1～1.5)×106个。DBM/hMSCs-CTLA4组植入F344大鼠皮下术后2～12周均可检测到hCTLA4-Ig阳性表达细胞,8～12周出现人源性新生骨组织;而单纯DBM组与DBM/hMSCs组表现为DBM逐渐被吸收,代之以纤维结缔组织,没有新生骨组织出现。结论以hMSCs-CTLA4作为种子细胞构建的组织工程骨异种移植到F344大鼠皮下可以成骨。hCTLA4-Ig基因修饰的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)可能作为骨组织工程异基因种子细胞的来源。     

骨向分化骨髓间充质干细胞的免疫学特性研究

目的 探讨骨向分化骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的免疫学特性. 方法 正常成人骨髓分离的BMSCs在骨向诱导培养基中培养2周后,将未分化的BMSCs和骨向分化的BMSCs与同种异体T淋巴细胞、植物血凝素(PHA)共培养,MTT法检测T淋巴细胞的增殖情况;ELISA法测定骨向分化2周的BMSCs上清以及共同反应5d的混合淋巴细胞反应(mixed lymphocytes reaction,MLR)上清转化生长因子(transforming growth factor -β1,TGF -β1)的浓度,并通过加入抗TGF-β抗体检测MLR情况. 结果 无论是未分化的BMSCs还是骨向分化的BMSCs都不会引起同种异体T淋巴细胞的增殖,并且都能抑制PHA诱导的T淋巴细胞增殖.MLR中的TGF -β1浓度显著升高.抗TGF-β抗体能够抵消骨向分化的BMSCs免疫抑制作用. 结论 骨向分化的BMSCs具有低免疫原性和免疫抑制特性.     

CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞抑制淋巴细胞活化的实验研究

目的:研究CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞(BMSCs)对淋巴细胞活化的抑制效应。方法:CTLA4Ig重组腺病毒载体转染BMSCs,以RT-PCR、免疫细胞化学、蛋白印迹法检测CTLA4Ig的表达情况,MTT法、ELISA法观察转染上清对混合淋巴细胞反应(MLR)体系中淋巴细胞活化、增殖的抑制效应。结果:转染组及转染后传两代BMSCs中检测到CTLA4Ig基因的转录,CTLA4Ig弥漫表达于细胞浆;转染后检测培养上清CTLA4Ig即呈阳性,72h达高峰,传一代培养上清中仍可检测到;转染上清对淋巴细胞的增殖、IL-2分泌有明显的抑制作用。结论:CTLA4Ig重组腺病毒能有效介导CTLA4Ig基因在BMSCs中的表达。且CTLA4Ig能有效抑制淋巴细胞的活化、增殖。     

腺病毒介导荧光素酶报告基因感染间充质干细胞的研究

目的 构建携带萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的腺病毒载体(Ad-Luc),研究其感染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)后的体内外生物发光成像.方法 从psiCHECK-2质粒中用PCR扩增Luc基因,克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV后行Nhe Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切和测序鉴定.重组腺病毒穿梭载体与骨架载体pAdeno同源重组并包装纯化后,测定其病毒滴度.用重组Ad-Luc感染BMSC,行体外生物发光成像确定最佳感染复数(MOI),并采用曲线拟合回归分析生物发光强度与MOI的关系.以锥虫蓝染色法评价细胞活力变化,计算细胞存活率.将转染后BMSC(1×106个)植入SD大鼠前肢肌肉内,行体内生物发光成像.细胞存活率组间比较采用两因素重复测量资料方差分析.结果 经酶切和测序鉴定证明,Ad-Luc构建成功,病毒滴度为1×1010空斑形成单位(PFU)/ml.体外生物发光检测结果显示最佳MOI值为50,Ad-Luc可高效感染BMSC,使其表达Luc,且拟合曲线示细胞生物发光强度随MOI增加而增强(R2 =0.98).转染组和未转染组细胞培养1、3、5、7d时,细胞存活率分别为(92.5±2.3)％与(94.1±1.8)％、(91.4±0.9)％与(92.7±2.0)％、(92.1±1.6)％与(93.3±2.4)％、(91.9±1.5)％与(93.0±3.1)％,2组间细胞活力的差异无统计学意义(F=4.38,P＞0.05).体内生物发光成像结果示BMSC移植1、3、7d后仍有存活,但随时间延长,生物发光信号逐渐减弱.结论 Luc报告基因通过腺病毒载体成功转入BMSC,实现了光学报告基因成像对移植干细胞的示踪.     

人CD40L胞外区和人CTLA4Ig双基因共表达腺病毒载体的克隆和鉴定

目的：构建人CD40L胞外区和CTLA4Ig双基因共表达重组腺病毒载体并鉴定。方法：RT-PCR扩增人CD40L胞外区片段，与致瘤素信号肽连接后构建穿梭质粒，经酶切、插入、同源重组，获质粒pAdshCD40L-IRES2-CTLA4Ig，经293细胞包装，获共表达双基因的腺病毒pAdvshCD40L-IRES2-CTLAg，并行凝胶电泳、PCR、共聚焦显微镜检测。结果：电泳、PCR扩增出了600bp和400bp的特异性片段、共聚焦显微镜观察到CD40L绿色荧光和CTLA4Ig红色荧光的共表达。结论：成功构建了人CD40L．胞外区和CTLA4Ig共表达双基因重组腺病毒载体。     

Survivin在骨髓间充质干细胞中的表达研究

目的：培养鉴定骨髓间充质干细胞（MSCs）,检测survivin的表达。方法：应用Ficoll法分离培养MSCs,流式细胞仪检测其特异性表面标志物,RT—PCR检测survivin mRNA表达。结果：培养MSCs的超微结构显示了干细胞特性,流式细胞仪检测证实为MSCs,survivin mRNA表达阳性。结论：Survivin在正常人骨髓间充质干细胞中有表达,提示它可能参与了其生物学行为并影响间充质干细胞存活。     

异基因骨髓源间充质干细胞对极重度放射损伤小鼠造血功能重建的影响

目的 探讨异基因骨髓源间充质干细胞(MSC)输注对极重度放射损伤小鼠造血功能重建的影响.方法 以C57BL/6(H-2b)雄性小鼠为供体制备MSC单细胞悬液.取雌性BALB/c(H-2d)小鼠120只作为受体,随机分为MSC-A组、MSC-B组、MSC-C组和PBS组(n=30).均接受60Co γ射线致死剂量(8Gy)照射,前3组小鼠于照射后2h分别经尾静脉输注MSC 1×106、1×105、5×104/R,PBS组在相同时间点经尾静脉输注等体积(0.4ml)PBS.观察小鼠的生存情况及外周血白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)的变化,进行骨髓单个核细胞、粒-单系祖细胞(CFU-GM)及脾集落形成单位(CFU-S)计数,对Y染色体进行检测,并观察小鼠股骨骨髓的病理学变化.结果 各组小鼠经致死剂量照射后,WDC、HGB和PLT均迅速下降,PBS组小鼠于照射后17d内全部死亡.MSC-A、MSC-B、MSC-C组小鼠的外周血WBC、HGB、PLT在2周左右开始逐渐恢复,观察至56d,各组小鼠的生存率分别为61.9%、47.6%、38.0%.MSC各治疗组小鼠的生存率、骨髓单个核细胞、CFU-GM、CFU-S均明显高于PBS组(P<0.05),前述各项指标均随MSC输注数量的增加而增加.移植后10d,MSC各治疗组小鼠骨髓中均可检测到Y染色体,但仅在移植后初期短暂植入.MSC输注后42d,MSC各治疗组骨髓增生活跃.结论 异基因来源的骨髓源MSC单独输注可促进极重度放射损伤小鼠造血功能重建;随着MSC输注数量的增加,其促造血重建功能增强.     

经体外预处理人胎儿骨髓间充质干细胞的潜在自身成瘤性

目的评价经体外预处理、启动免疫保护功能的人胎儿骨髓间充质干细胞（hfBMSCs）的潜在自身成瘤性。方法采用流式细胞术检测细胞表型及细胞周期,染色体核型分析检测遗传稳定性,裸鼠皮下接种检测体内成瘤性。结果体外预处理的hfBMSCs呈正常间充质干细胞表型,可通过阻滞细胞周期于G0-G1期抑制hfBMSCs生长增殖（P〈0.05）,对染色体核型无影响,不具备体内成瘤性。结论经体外预处理的人胎儿骨髓间充质干细胞不具有自身成瘤性。     

骨髓间充质干细胞在肺损伤大鼠肺组织的分化

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞的可能性.方法 将SD大鼠MSCs用DAPI标记后注入受体大鼠体内.75只受体大鼠随机分为5组(n＝15):肺损伤组、MSCs治疗组、MSCs对照组、单个核细胞对照组和正常对照组.分别于MSCs、单个核细胞注入受体大鼠体内1、2、4周后观察肺组织结构变化,检测肺组织中植入细胞情况及广谱细胞角蛋白的表达水平.结果 MSCs治疗组大鼠肺组织在各时间点均有少量植入的细胞,并且部分植入的细胞表达广谱细胞角蛋白.MSCs植入后2周大鼠细支气管壁有少量植入的细胞同时表达广谱细胞角蛋白.其余各组未发现植入细胞的标记.结论 MSCs可在损伤的大鼠肺组织中分化为肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞.     

丹酚酸B对骨髓间充质干细胞SCF表达的影响

目的研究中药单体丹酚酸B对骨髓间充质干细胞(MSCs)中干细胞因子(stemcell factor,SCF)的影响。方法用贴壁培养法分离、培养和纯化MSCs,取第三代MSCs进行实验。用含不同浓度丹酚酸B的低糖DMEM培养液培养MSCs,ELISA法检测培养24、48、72h的上清中SCF的含量;RT-PCR法检测培养24、48、72h的SCF mRNA的表达。结果膜型和可溶型SCF mRNA均有表达。随着培养时间的增加,0.3μg/ml、3μg/ml、30μg/ml丹酚酸B可明显促进SCF的分泌和SCF mRNA的表达(与空白对照组比较,P<0.05),而0.03μg/ml丹酚酸B组和空白对照组比较无明显差异(P>0.05)。结论丹酚酸B可促进MSCs分泌SCF并促进SCF mRNA的表达,提示SCF可能在中药丹参治疗心肌梗死中发挥了重要作用。     

骨髓间充质干细胞对大鼠皮肤损伤促愈作用的研究

目的：研究骨髓间充质干细胞（MSCs)对大鼠皮肤损伤所发挥的促愈作用。从而为临床皮肤损伤修复提供新的种子细胞来源。方法：体外培养扩增雄性Wistar大鼠的骨髓MSCs，选择雌性Wistar大鼠30只制作皮肤损伤模型，并随机分为MSCs-胶原膜组（接种细胞胶原膜组，A组），单纯胶原膜组（B组）和自然愈合组（对照组，C组），每组10只。采用创面大体观察、组织学检查和透射电镜等方法观察创面愈合情况，并结合原位杂交方法判定创面愈合过程中是否存在植入细胞。结果：伤后7，14d,3组中任何两组之间创口收缩率比较，差异均有非常显著性意义（P＜0．01），其顺序为A组＞B组＞C组；组织学检查显示，A组肉芽组织含量明显多于B、C组；电镜检查显示，A组受损皮肤接近正常；原位杂交结果表明，移植后7，21，27d,A组均可检测到雌性Wistar大鼠受损皮肤真皮层有雄性大鼠sry基因的表达。结论：MSCs可对皮肤损伤发挥明显的促愈作用。     

骨髓间充质干细胞亚群心肌分化基因的筛选

目的利用基因芯片筛选小鼠骨髓间充质干细胞4个亚群的差异表达基因,寻找心肌分化特异性基因。方法将小鼠骨髓间充质干细胞通过CD45和CD31的磁珠分选,获得SCA-1^＋/CD45^-/CD31^-、SCA-1^＋/CD45^-/CD31^＋、SCA-1^＋/CD45^＋/CD31^＋及SCA-1^＋/CD45^＋/CD31^-4群细胞。采用基因芯片技术完成Agilent小鼠全基因4＊44K芯片表达谱基因检测,分析差异表达基因。根据基因芯片中所检测的基因表达量在SCA-1^＋/CD45^＋/CD31^＋亚群中最高,且为其他亚群表达量的两倍以上为原则,通过RT-PCR验证各亚群及未分选细胞中的差异基因的表达量。结果根据皮尔森关联算法计算4组细胞亚群之间的关联值位于0.979～0.995之间,通过RT-PCR检测发现,Rock2基因在SCA-1^＋CD45^-CD31^-亚群中表达最高,而在SCA-1^＋CD45^＋CD31^＋亚群中表达很低,Itga4在未分选群中表达最高;Cxadr在SCA-1^＋CD45^-CD31^-亚群中表达最高;Epor在SCA-1^＋CD45^-CD31^＋亚群中表达最高;myl3在SCA-1^＋CD45^＋CD31^＋亚群中表达最高。结论 Rock2、Cxadr、Itga4、Epor和myl3基因在干细胞亚群向心肌分化中发挥不同作用。     

骨髓间充质干细胞条件培养基对INS-1细胞凋亡的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞条件培养基(BMSC-CM)对促炎因子诱导大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)凋亡的影响及其作用机制.方法 培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)至第3代,收集、浓缩其上清液,获得富含BMSCs分泌因子的条件培养基.用含促炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的培养基处理INS-1细胞48h,造成炎症损伤β细胞模型,加入不同浓度的BMSC-CM继续培养12h,所获细胞分为以下5组:正常对照组,促炎因子组,1×BMSC-CM组,2×BMSC-CM组,4× BMSC-CM组.采用CCK-8法检测INS-1细胞存活率,膜连蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)检测细胞凋亡率,二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)的生成量.结果 与正常对照组相比,促炎因子组INS-1细胞存活率下降至正常对照组的75.84％±1.53％,细胞凋亡率增加(17.23％±1.77％),细胞内ROS水平明显升高(34.3％±0.80％),差异均具有统计学意义(P＜0.01).而BMSC-CM有效对抗了促炎因子导致的INS-1细胞损伤,其作用呈剂量依赖性,4×BMSC-CM组效果最佳,该组INS-1细胞存活率较促炎因子组升高了11.86％,达到87.7％±2.08％,细胞凋亡率下降至8.67％±1.59％,ROS生成量减少至17.1％±2.14％,差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 BMSC-CM可抑制促炎因子诱导的INS-1细胞凋亡,其作用机制可能与BMSC-CM降低细胞内ROS水平有关.     

HGF基因修饰增强间充质干细胞的免疫抑制作用

目的：探讨HGF基因在间充质干细胞（mesenehymal stem cell，MSC）中过表达对细胞生物学的影响，为扩充MSC临床应用范围提供依据。方法：用携带HGF基因的重组腺病毒感染人骨髓来源的间充质干细胞后。与对照细胞相比，进行以下项目的检测：FCM测定细胞表型；MTT法测定细胞增殖能力；ALP和钙定量以及组织化学染色检测细胞体外成骨和成脂肪能力；^3H—TdR掺入法测定MSC—HGF对混合淋巴细胞反应中效应细胞增殖活性的抑制作用。结果：HGF基因转染后MSC表型、体外增殖和分化能力无改变；混合淋巴细胞反应中，MSC—HGF对异基因抗原诱导的淋巴细胞增殖活性的抑制效应存在剂量依赖关系；MSC—HGF／MSC与效应细胞比例为1：80时，MSC组淋巴细胞增殖活性（cpm值）降低19．8％，MSC—HGF组降低68．3％，抑制率是MSC组的3．45倍。结论：HGF基因转染的人骨髓MSC仍维持固有的增殖和分化能力，而对体外细胞免疫反应具有更强的抑制效果，提示MSC—HGF在造血干细胞移植和器官移植中的潜在应用价值。     

在体诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的初步观察

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs)分化为表皮细胞的可行性，方法：抽取小型香猪的骨髓，经密度梯度离心分离、纯化间充质干细胞及培养扩增后，应用5－溴脱氧尿嘧啶（5－BardU)标记技术进行细胞标记。将已标记的细胞以注射方式回植到提供骨髓的香猪的皮内及皮下，分别于注射后1，2周取材，常规石蜡包埋，连续切片，行5－BrdU和角蛋白免疫组织化学染色，对比研究。结果：大多数5－BrdU阳性细胞聚集在真皮中的小血管周围。但有少数5－BrdU阳性标记细胞出现在表皮的棘层和颗粒层，并同时表达角蛋白，结论：在皮肤微环境下骨髓间充质干细胞具有分化为表歧细胞的潜能。