cDNA末端快速扩增技术研究进展

全长 cDNA 的获得是基因克隆的重要内容,也是基因组研究中的一个重要方面．cDNA 末端快速扩增技术(RACE)是获得全长 cDNA 的主要辅助手段之一,从 RACE 的原理出发,指出该技术本身存在的优缺点,阐述 RACE 操作中不容忽视的技术要点,对前人对 RACE 的改进加以总结．     

cDNA末端快速扩增技术的研究进展

cDNA末端快速扩增技术是一种基于多聚酶链式反应的技术 ,它的发展大大便利了应用其它方法获得的部分cDNA序列后克隆全长cDNA 5’和 3’末端的工作。不仅RACE方法能在短时间内得到完整的cDNA末端序列 ,而且一些截短的cDNA末端常常也能在RACE的过程中被扩增 ,而这些截短的产物破坏了全长cDNA克隆的获取。许多研究者对RACE的流程提出了改进方案 ,从而提高了该技术的效力。本文介绍了许多已发表的RACE技术关键步骤的改良 ,包括一些具体有效的操作流程 ,如RNA连接酶介导的RACE/连接锚定PCR等 ,还有其有效性的例证。     

cDNA末端快速扩增技术新进展

全长cDNA的获得是基因克隆的重要内容,也是目前人类基因组研究中后 个重要方面,cDNA末端快速扩增（RACE）技术是以PCR为基础,从部分已知的cDNA序列扩增出其他未知部分的5′端和3′端的cDNA序列的一种方法,本文从RACE技术的基本原理方法出发,详细阐述了其存在的缺陷,并对RACE最新研究进展,如Marathon-PCR,Smart-PACE以及“电子”cDNA克隆等作一综述。     

一种新的cDNA 末端快速扩增获取全长cDNA的方法

为克隆精子发生相关基因的全长cDNA,根据mRNA差异显示获得的ESTs设计引物,利用一种新的cDNA末端快速扩增方法(SMARTRACE)扩增该EST的5′末端,并进行克隆测序,与mRNA差异显示获得ESTs拼接后,获得了三个新的全长cDNA.结果表明,SMARTRACE是一种简便、有效的克隆cDNA5′末端未知序列的技术. Abstract:To clone the full-length cDNAs of genes related to spermatogenesis,ESTs obtained by mRNA differential display were used to design gene-specific primer.Then SMART RACE was performed to obtain the 5′ region of these ESTs.After cloning,sequencing and splicing with ESTs obtained by mRNA differential display,three full-length cDNAs were obtained.The results indicate that SMART RACE is a simple and an effective technique for cloning 5′-end unknown sequence of gene.     

cDNA末端快速扩增试剂盒研发进展

DNA扩增的方法有许多种,其中cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）因其操作简单、成功率相对较高、重复性好,被广泛应用于真核生物基因全长的克隆与分析。本文比较了市售的RACE试剂盒所采用的模板制备策略及改进的扩增方法。     

鳜鱼Mx蛋白全长cDNA的克隆和序列分析

Mx蛋白是一类由I型干扰素诱导表达的抗病毒蛋白。本研究以感染了鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)的鳜鱼为材料,提取肝脏总RNA,通过逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Mx蛋白基因的核心片段序列,再应用3’和5’快速扩增cDNA末端(RACE)方法PCR扩增Mx蛋白cDNA末端,最终获得鳜鱼Mx蛋白cDNA序列(GenBank登陆号：AY392097)。序列分析表明：鳜鱼Mx蛋白cDNA含有2391bp,其中编码区长1881bp,编码627个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为7．15kDa。鳜鱼Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征：一个三联体GTP结合区域(GXXXSGKS/T、DXXG、T／NKXD)一个发动蛋白家族的典型结构特征序列(LPRGS／KGIVTR);以及C端高度保守的Leu拉链结构域。鳜鱼Mx蛋白全基因的获得为下一步研究鱼类Mx蛋白的抗病毒活性、作用机制,以及干扰素的检测奠定了基础。     

一种新的cDNA末端快速扩增获取全长cDNA的方法

为克隆精子发生相关基因的全长cDNA,根据mRNA差异显示获得的ESTs设计引物。利用一种新的cDNA末端快速扩增方法（SMART RACE）扩增该EST的5′末端,并进行克隆测序,与cDNA差异显示获得ESTs拼接后,获得了三个新的全长cDNA。结果表明：SMAR RACE是一种简便、有效的克隆cDNA5′末端未知序列的技术。     

cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良

cDNA末端的快速扩增(RACE)法是延伸已知部分外显子序列和克隆全长cDNA基因的主要方法之一。广泛用于许多已知功能基因片段的进一步延伸和全长cDNA的克隆。但由于其过程复杂、涉及多步连续的酶促过程,如反转录、TdT加尾、第二链合成、RACE-PCR扩增及RACE产物克隆等,在实际应用中有许多问题和相当难度,主要针对RACE各步骤中存在的问题进行了分析,并对其优化和改良进行了综述。     

中国野葡萄新基因cDNA全长的克隆及序列分析

根据对中国野生葡萄华东葡萄株系白河-35-1在白粉病诱导下构建的cDNA文库中获得的1条EST序列设计特异引物,以总RNA逆转录产物为模板,进行SMART-RACE扩增。结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,并预测了蛋白质的理化性质、信号肽、酶与非酶分析、亚细胞定位以及蛋白质二级结构。结果表明,获得的中国野生葡萄新基因的全长序列为854 bp,其开放阅读框为585 bp,5′非编码区为107 bp,3′非编码区为162 bp;同源性比对表明该新基因推导的氨基酸序列与拟南芥RNA结合蛋白和水稻推定的半乳糖基转移酶的同源性分别为55%和63%,第8~82位氨基酸序列与RNA识别基序相类似,是一个典型的结构功能域;推导该基因表达产物为相对分子质量为21 801.27、等电点为6.86的不稳定蛋白,定位于细胞核,不包含信号肽,二级结构主要是无规则卷曲。     

RACE: cDNA末端快速扩增技术进展

ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端快速扩增技术进展明洪黄秉仁中国协和医科大学基础医学院中国医学科学院基础医学研究所国家分子生物学重点实验室北京１００００５基因表达水平和模式的变化驱动着生物体内主要的生物学过程。分离和克隆基因是研究基因结构、功能以及表达的基础。以往建立和筛选ｃＤＮＡ和ＤＮＡ文库来分离克隆目的基因的经典方法繁琐而且工作量大。ＰＣＲ技术的出现极大地提高了分离克隆目的基因的效率。反向ＰＣＲ、锅...     

蒙古冰草PLD基因cDNA克隆及生物信息学分析

以蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)叶片为材料.根据已报道的醉酒毒麦PLD基因片段设计特异引物,通过RT-PCR和RACE技术,获得蒙古冰草PLD基因的全长cDNA(GenBank登录号为EU333811).该基因cDNA全长2 966 bp,包含2 439 bp的完整开放读码框,编码813个氨基酸.BlastP搜索结果显示,该基因推测的氨基酸序列与已克隆的醉酒毒麦、玉米、水稻PLD基因氨基酸序列的一致性为80%～89%.利用生物信息学软件在线分析其序列结构、氨基酸组成及编码氨基酸的性质和结构,结果表明:该基因编码的蛋白为可溶性蛋白,其相对分子量为92 079.2 Da,理论等电点为5.24,无跨膜域、无信号肽;其二级结构主要以无规卷曲为主;三级结构显示紧靠N端处为C2域,在中间和靠近C端处存在PLD的标志序列,即HKD基序.系统进化树显示,蒙古冰草PLD与醉酒毒麦的亲缘关系最近.     

相异物种同源基因cDNA的快速克隆

介绍了一种结合生物信息学数据库的比较分析,在系统发生相近物种的棱酸保守区设计PCR引物,通过RT-PCR和RACE方法,在相异物种中快速克隆同源基因cDNA的一种简捷方法。     

利用Y-RACE法进行棉花胚珠cDNA末端快速扩增

在YADE(Y shapedadaptordependentextension)方法的基础上 ,设计了一种新的cDNA末端快速扩增方法 ,称为Y RACE法 .利用该方法只需一次cDNA合成就能进行多个基因的 3′和 5′末端的扩增 .分别利用Y RACE方法和RACE试剂盒 (TaKaRa)扩增了一个棉花胚珠cDNA片段F0 2 7的末端序列 .序列比较表明 ,用Y RACE方法扩增的末端序列较试剂盒所得序列在最末端稍短 ,但同样能进行正确拼接并获得全长编码序列 .对Y RACE法的优缺点和可能的改进作了进一步讨论 .     

High Efficiency Selection of Full-length cDNA by Improved Biotinylated Cap Trapper

We report here an improved protocol for the preparation of full-lengthcDNA libraries that improves the previously reported method(Carninci, P., Kvam, K., Kitamura, A. et al. 1996, Genomics,137, 327–336), that allows long cDNAs to be cloned moreefficiently. One potential disadvantage of the original biotinylatedCAP trapper protocol is the exposure of mRNA to chemical andenzymatic attacks during the biotinylation of the cap structure,before the first-strand cDNA synthesis (and selection of full-lengthcDNA by biotinylated cap). Here, we show that the biotinylationof the cap structure is very specific and effective even ifbiotinylation is performed on the mRNA/cDNA hybrid producedby the first-strand cDNA synthesis reaction. Consequently, mRNAremains protected from chemical and enzymatic degradation duringthe overnight biotinylation step, thus making it possible toselect full-length cDNAs of longer average size. We herein reportthe efficiency and specificity of the new version of the protocolfor cap structure biotinylation and capture of full-length cDNA.