牵张应变作用下人牙周膜细胞形态及钙离子浓度变化的实验研究

目的：观察机械牵张应变作用下,人牙周膜细胞（HPDLCs）形态及游离Ca2＋浓度的变化。方法：通过原代和传代培养获得性状稳定的人牙周膜细胞,使用动态机械应变细胞加载仪对细胞进行1%、10%和20%动态牵张应变加载,并加载不同时间,通过流式细胞仪对细胞进行Ca2＋浓度的检测。应用SPSS13.0软件对数据进行方差分析。结果：细胞内游离Ca2＋浓度随牵张应变时间的延长逐渐升高,至60min时达到该组的峰值（P〈0.01）;以后随加载时间的延长逐渐下降,120min时降至对照组水平（P〉0.05）。结论：牵张应变可以引起细胞形态的改变和细胞内游离Ca2＋浓度的变化。     

牵张应变对人牙周膜细胞内磷脂酶C-γ1水平的影响

目的：观察在机械牵张应变作用下,人牙周膜细胞（HPDLCs）内磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）水平的变化。方法：通过原代和传代培养,获得性状稳定的HPDLCs,使用动态机械应变细胞加载仪对细胞进行1％、10％和20％动态牵张应变加载。加载于不同的时间段,通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行PLC-γ1水平的检测。应用SPSS13．0软件对数据进行方差分析。结果：使用流式细胞仪对细胞内PLC-γ1水平检测发现：加载初期,细胞内的PLC-γ1水平维持在较低水平,随着牵张应变加载时间的延长,牙周膜细胞内PLC-γ1水平逐渐升高。50min时PLC-γ1水平达到了各个应变组的最高值（P〈0．01）。随着加载时间的继续延长,60min时各应变组的PLC-γ1水平都有所下降（P〈0．01）。激光扫描共聚焦显微镜检测发现：对照组和动态加载组都有PLC-γ1的表达,但加载50min组表达相对较强。结论：机械牵张应变可以引起HPDLCs内PLC-γ1水平的变化。     

牵张应变作用下人牙周膜细胞内磷脂酶C-γ1水平的变化

目的:观察机械牵张应变作用下,人牙周膜细胞(HPDLCs)内磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)水平的变化。方法:通过原代和传代培养,获得性状稳定的人牙周膜细胞,使用动态机械应变细胞加载仪对细胞进行1%、10%和20%动态牵张应变加载。加载不同时间,通过流式细胞仪对细胞进行PLC-γ1水平检测。采用SPSS13.0软件包对数据进行方差分析。结果:在加载牵张应变初期,细胞内的PLC-γ1水平维持较低水平;随着牵张应变加载时间的延长,牙周膜细胞内的PLC-γ1水平逐渐升高。50min时,PLC-γ1水平达到各应变组的最高值(P<0.01)。随着加载时间的继续延长,60min时,各应变组的PLC-γ1水平都显著下降(P<0.01)。结论:牵张应变可引起细胞内PLC-γ1水平的变化。     

牵张应变作用下人牙周膜细胞内磷脂酶C-γ1水平变化的实验研究

目的 观察人牙周膜细胞（HPDLCs）内磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）水平在机械牵张应变作用下的变化.方法 通过原代和传代培养,获得性状稳定的人牙周膜细胞,使用动态机械应变细胞加载仪对细胞进行1％、10％和20％动态牵张应变加载.并于加载后10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min,通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内PLC-γ1水平的变化.应用SPSS13.0软件包对数据进行统计分析.结果 流式细胞仪检测发现：加载初期,细胞内的PLC-γ1水平维持在较低水平,随着牵张应变加载时间的延长,牙周膜细胞内PLC-Y 1水平逐渐升高.50 min时PLC-Y 1水平达到了各个应变组的最高值（P＜0.01）,60 min时各应变组的PLC-γ1水平都有所下降（P.＜0.01）.激光扫描共聚焦显微镜检测发现：各组都有PLC-γ1的表达,其中50 min加载组表达相对较强.结论 机械牵张应变可以引起人牙周膜细胞内PLC-γ1表达量发生改变.     

牵张应变诱导人牙周膜细胞晚期凋亡的实验研究

目的研究机械牵张应变对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,HPDLCs）晚期凋亡的影响。方法体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置对HPDLCs加载1%、10%和20%的动态牵张应变6、12、24和48 h,通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜对经过TUNEL染色的细胞进行晚期凋亡检测。采用SPSS 11.0软件包对数据进行统计学分析。结果HPDLCs加载后,呈现栅栏状相互平行排列趋势,排列方向垂直于牵张力方向。各应变组细胞的晚期凋亡率在加载24 h时达到该应变组的峰值,且具有一定时间和应变依赖性。结论通过动态机械应变细胞加载装置对人牙周膜细胞的牵张加载,发现牵张应变可以诱导细胞发生晚期凋亡,具有时间和应变值依赖性,24 h时晚期凋亡率达到峰值。     

牵张应变诱导人牙周膜细胞凋亡信号通路初探

目的通过研究Caspase酶在牵张应变作用下的变化,来初步探讨其引起人牙周膜细胞(HPDLCs)凋亡的可能机制。方法体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置对HPDLCs加载1%、10%和20%的动态牵张应变6、12、24、48 h,利用酶标仪检测Caspase-3活性以及添加Caspase-8和Caspase-9阻断剂后Caspase-3活性。结果 Caspase-3活性具有一定的时间和应变值依赖性,各应变组细胞的Caspase-3活性在加载24 h时达到峰值,Caspase-9阻断剂可以显著降低Caspase-3的活性,而Caspase-8却并没有明显作用同时发现。结论 Caspase-9激活Caspase-3介导的凋亡通路参与了牵张应变诱导HPDLCs的凋亡。     

静态牵张应变对人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响

目的:探讨牵张应变对体外培养的人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响。方法:牵张应变量设为0%、8%、13%、18%、23%共5组,每组分别加载1 h8、h、16 h、24 h后收集细胞,免疫组化检测细胞中COX-2的表达,灰度分析并进行统计学处理。结果:8%~18%牵张应变范围,细胞内COX-2表达随着加载时间和应变量的增高而增强,23%应变量作用下COX-2表达降低,且与加载时间无关联。结论:在细胞的生理应变范围(8%、13%、18%)内,静态牵张应变促进人牙周膜成纤维细胞COX-2的表达,当牵张应变量超过生理应变范围(23%),则COX-2的表达量降低。     

人牙周膜成纤维细胞的培养及牵张应变诱导凋亡研究

目的:探讨人牙周膜成纤维细胞的分离、培养及在牵张应变作用下发生早期凋亡的情况。方法:刮取健康人前磨牙牙周膜,进行牙周膜成纤维细胞的分离、培养及生长曲线描绘。经3～4代传代培养后,对细胞加载1%～20%的牵张应变,加载时间分别为30min,1h、6h、12h然后通过流式细胞仪检测Annexin V-FITC(异硫氰酸荧光素)及激光扫描共聚焦显微镜进行细胞的早期凋亡鉴定。结果:人牙周膜成纤维细胞传代到12代以后,细胞逐渐呈衰老生状,胞体变大,细胞生长缓慢。人牙周膜成纤维细胞的凋亡率在30min组低于对照组,但两者间无统计学差异。在6h内,人牙周膜成纤维细胞的凋亡情况随加载时间和加载应力的增加而增加(P<0.05)。在12h时所有组的细胞凋亡均减少。结论:人牙周膜成纤维细胞的使用最好在12代以内,尤其是3～4代细胞的活力、增殖能力较好。牵张应变可以诱导细胞发生早期凋亡。     

Bcl-2和Bax在牵张应变诱导HPDLCs凋亡中的表达研究

目的：研究牵张应变诱导人牙周膜细胞（HPDLCs）凋亡过程中细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达变化情况。方法：体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置对HPDLCs加载20%动态牵张应变24h,通过real-time PCR检测Bcl-2和Bax在mRNA水平上的表达差异。结果：HPDLCs加载后,呈现栅栏状相互平行排列趋势,排列方向垂直于牵张力方向。Bcl-2和Bax基因表达显著增加,Bcl-2/Bax比值显著下降,有明显统计学意义（P〈0.05）。结论：牵张应变诱导人牙周膜细胞凋亡过程中,Bcl-2家族起到了重要作用。     

牵张应力对人牙周膜细胞MMP-2表达的影响及相关信号通路的研究

目的：探讨NF-κB通路对牵张应力介导的人牙周膜细胞（HPDLCs）中MMP-2表达的影响.方法：按胶原酶消化法培养HPDLCs,分为5组：非加力对照组（A组）;12％形变率,3h组（B组）;12％形变率,6h组（C组）;12％形变率,12h组（D组）;12％形变率＋PDTC干预,12h组（E组）,通过细胞牵张应力加载系统施加机械牵张应力,结束后收集细胞提取蛋白,用蛋白印迹法检测MMP-2蛋白表达的变化.结果：B、C、D组MMP-2表达大于A组,差异有统计学意义（P＜0.05）,且随着作用时间的延长蛋白表达增加;NF-κB通路抑制剂PDTC可抑制机械牵张应力作用下牙周膜细胞MMP-2表达的增加.结论：持续机械牵张应力可诱导人牙周膜细胞MMP-2表达的增加,从而影响牙周组织细胞外基质代谢,机械牵张应力可通过NF-κB通路影响MMP-2蛋白的表达.     

Cyclic stretching force-induced early apoptosis in human periodontal ligament cells

Objective:  Human periodontal ligament (PDL) cells occur changes in morphology and express relative protein by stretching force. However, whether stretching force, especially excessive stretching force, induces PDL cell apoptosis is not yet clearly understood. In the present study we investigated the relationship between early apoptosis and stretching force in human PDL cells in vitro.
Materials and methods:  The human PDL cells were obtained from healthy premolars. After three to five passages, the cells were stretched by strain 1%, 10% and 20% for 30 min, 1 h, 6 h and 12 h, then early apoptosis were detected through annexin fluorescein isothiocyanate (V-FITC) binding by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy.
Results:  The experiments indicated that human PDL apoptotic cells in the early stage increased in a time- and force-dependent manner in response to stretching strain within 6 h, and then apoptosis decreased at 12 h. Human PDL cells which stretched inclined parallel to each other and aligned their long axis perpendicular to the stretching force vector, but in the centre of the disc, cells showed minimal deformation and unidirectional alignment of PDL cells.
Conclusion:  The overall results suggested that stretching force not only influenced morphology but also induced early apoptosis in human PDL cells.     

机械牵张力对人牙周膜细胞成骨样细胞功能的影响

目的 观察机械力作用下牙周膜细胞成骨样细胞特性的改变，以深入探讨正畸牙齿移动的机理。方法 利用自行研制的细胞加力装置对体外培养的人牙周膜细胞施加间歇性机械牵张力，检测其成骨样细胞表型蛋白碱性磷酸酶（alkaline phosphotase,ALP)、骨桥蛋白（osteopontin,OPN)和骨钙素（osteocalcin,OCN)表达的改变。结果 人牙周膜细胞在受到机械牵引力刺激后表现为ALP分泌活性的影响，而且24h的时段内波动，2、4h和24h出现2个显著增高期（P＜0．01）；OCN受机械牵张力影响出现较缓慢和晚期的表达增强，加力4h后缓慢增高，在12h最为明显（P＜0．05）；非分泌型ALP、OPN随观察时间延长蛋白表达水平，如ALP、OCN和OPN都增强，具有时序性。提示人牙周膜细胞在机械力诱导下向成骨样细胞分化成熟，从而可能在机械力介导的骨改建中起作用。     

BMP4对人牙周膜细胞骨钙素分泌的影响

目的观察体外培养的人牙周膜细胞转染骨形成蛋白4基因(bone morphogenetic protein,Bmp4)后,骨钙素(osteocalcin,OCN)的分泌变化,为深入探讨BMP4在牙周再生中的调控作用奠定基础。方法Bmp4基因转染体外培养的第四代人牙周膜细胞,经原位杂交检测确定Bmp4成功转染细胞后,计数并统计转染组和未转染组人牙周膜细胞中骨钙素的表达变化。结果Bmp4基因转染后的人牙周膜细胞上清液中骨钙素的含量明显高于未转染组细胞。结论Bmp4基因能够促进人牙周膜细胞分泌非胶原蛋白,因此,对牙周组织的再生具有一定的调控作用。     

体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞表型特征的研究

目的 对体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞的表型特征进行研究探讨。方法 组织块 法培养人牙周膜细胞,放射免疫法检测条件培养基中碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和骨钙素（ＯＣＮ）的分泌活性,免疫 组化法检测非分泌型的ＡＬＰ和ＯＣＮ的表达,原位杂交方法检测二者的ｍＲＮＡ水平的表达。结果 人牙 周膜细胞具有成骨细胞的部分表型,碱性磷酸酶在蛋白水平包括分泌和非分泌型及基因转录水平都有一 定的表达,随培养时间的变化不大;而不具有成熟的成骨细胞的表型特征——骨钙素的表达,其无论是在 基因和蛋白水平都没有表达二这一结果为进一步研究人牙周膜细胞在机械力作用下参与骨改建打下基础。     

人牙周膜干细胞的分离培养及初步鉴定

目的 体处分离培养人类牙周膜干细胞并对其生物学性状进行初步鉴定.方法 采用有限稀释法进行牙周膜干细胞克隆筛选,获得单细胞克隆来源细胞,检测其克隆形成率,并采用免疫组织化学染色、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色等方法鉴定牙周膜干细胞的组织来源及生物学特性.结果 有限稀释法获得的牙周膜干细胞克隆株呈簇状生长,排列紧密,细胞呈圆形或椭圆形,细胞较小,排列形成紧密的团块状.免疫组化染色显示细胞波形蛋白阳性,角蛋白阴性;碱性磷酸酶染色阳性;早期间充质干细胞的标志物STRO-1荧光染色显示细胞发出明亮的红色荧光,表达阳性.结论 牙周膜中存在具有高增殖能力的干细胞,克隆化分离培养的人牙周膜干细胞具有强克隆形成能力,具有间充质干细胞表型和生物学特性.     

不同培养基对人牙周膜细胞生物学行为的影响

目的：研究α—MEM、DMEM—LG、RPMI1640三种培养基对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLcs）生物学行为的影响,为体外培养人牙周膜细胞寻找合适的培养基。方法：采用改良组织块培养法,分别用α-MEM、DMEM—LG、RPMI1640三种培养基对hPDLcs进行体外培养,比较三组细胞在游出成功率、增殖及矿化等方面的差异。结果：α-MEM促进hPDLcs增殖作用最强。α—MEM组培养的细胞表达的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）含量最高,与其它两组间有显著差异。DMEM—LG组矿化结节形成个数最多且体积大。结论：α-MEM促进hPDLcs增殖,DMEM—LG促进hPDLcs分化。应根据实验要求选择合适培养基。     

盐酸小檗碱对体外培养人牙周膜细胞生物活性的影响

目的:探讨盐酸小檗碱对原代培养的人牙周膜细胞(PDLC)生物活性的影响。方法:采用细胞培养技术、噻唑蓝(MTT)比色法、考马斯亮蓝法、酶动力学方法观察盐酸小檗碱对PDLC增殖活性、蛋白合成及碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。结果:①与对照组比较,作用24h,盐酸小檗碱(0.005～0.030g/L)能明显增强人牙周膜细胞增殖能力(P<0.05);作用48h,盐酸小檗碱(0.005～0.020g/L)能明显增强人牙周膜细胞增殖能力(P<0.05);作用72h,盐酸小檗碱(0.010～0.020g/L)能明显增强人牙周膜细胞增殖能力(P<0.05)。②盐酸小檗碱(0.005～0.020g/L)细胞培养液中蛋白总含量均明显高于对照组(P<0.05)。③盐酸小檗碱(10～20g/L)细胞培养液中ALP活性均明显高于对照组(P<0.05)。结论:盐酸小檗碱在0.010～0.020g/L浓度范围内有促进PDLC的增殖及生物合成作用,能增强牙周膜细胞ALP活性。     

牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K对人牙周膜细胞增殖的影响

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K对人牙周膜细胞增殖的影响.方法 组织块法体外培养人牙周膜细胞,不同浓度的牙龈蛋白酶K作用于人牙周膜细胞24h,对照组为无牙龈蛋白酶K作用的人牙周膜细胞.浓度为12.5μg/ml牙龈蛋白酶K分别作用于人牙周膜细胞24、48、72、96h,对照组也培养相同的时间.采用MTT法检测人牙周膜...     

雌激素对人牙周膜干细胞干性维持的影响

目的研究雌激素对人牙周膜干细胞（hPDLSC）干性维持的影响。 方法分离、培养原代hPDLSC并完成其干细胞鉴定;雌激素处理48 h,采用流式细胞术检测雌激素对hPDLSC细胞周期的影响;定量聚合酶链反应（q-PCR）检测人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因、干性相关基因Oct4、Sox2、c-Myc以及衰老相关基因p16和p53的变化;雌激素长期处理后观察细胞克隆形成能力及骨向分化能力的改变。应用SPSS 17.0软件,利用配对样本t检验对组间均数进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。 结果实验获得的hPDLSC符合间充质干细胞鉴定标准。流式细胞术结果显示,雌激素处理48 h后hPDLSC增殖能力（29.730 ± 1.845）较对照组（23.587 ± 2.905）明显提高,差异有统计学意义（t= 9.913,P= 0.010）。q-PCR结果显示雌激素处理48 h后,hTERT表达量（1.958 ± 0.338）较对照组（1.000 ± 0.018）明显提高（t= 7.00,P= 0.001）;Oct4表达量（2.539 ± 0.493）较对照组（1.000 ± 0.011）明显提高（t= 6.26,P= 0.001）;Sox2表达量（2.234 ± 0.255）较对照组（1.016 ± 0.221）明显提高（t= 6.26,P= 0.003）;c-Myc表达量（1.328 ± 0.091）较对照组（1.003 ± 0.088）明显提高（t= 5.67,P= 0.002）;而衰老相关基因p16表达量（0.460 ± 0.085）较对照组（1.009 ± 0.163）明显降低（t= 12.24,P= 0.007）;p53表达量（0.301 ± 0.041）较对照组（1.004 ± 0.115）明显降低（t= 7.77,P= 0.016）。雌激素长期处理后,雌激素处理组的克隆形成率（0.058 ± 0.008）显著高于对照组（0.013 ± 0.008）,差异有统计学意义（t= 5.60,P= 0.028）,成骨能力显著强于对照组（A_对照组= 1.238 ± 0.084;A_E2=2.460 ± 0.182,t= 16.41,P<0.001）。 结论雌激素能提高hTERT和Oct4、Sox2、c-Myc的基因表达量,维持细胞增殖,抑制细胞衰老。雌激素长期处理能维持体外扩增时hPDLSC的干性。