釉质基质蛋白对乳牙牙髓干细胞体外增殖、分化能力的影响

目的：研究釉质基质蛋白（enamel matrix proteins,EMPs）对人脱落乳牙牙髓干细胞（stem cells from hu—man exfoliated dediduous teeth,SHED）体外增殖分化能力的影响。方法：利用酶消化法联合组织块法获得脱落乳牙牙髓干细胞,并进行形态学观察。三氯乙酸法制备EMPs,用不同浓度的EMPs对SHED进行诱导,利用四唑盐比色法（MTT）检测并分析诱导后的SHED增殖活性的变化,检测经诱导后的培养液中碱性磷酸酶（ALP）。RT—PCR检测牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）及牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein1,DMP-1）的mRNA表达。结果：人脱落乳牙牙髓干细胞呈集落生长,并且在体外具有一定的自我增殖能力。EMPs对乳牙牙髓干细胞的增殖无明显影响,而能够显著提高ALP的活性,并呈现一定的剂量依赖性。经EMPs诱导后,细胞相对高表达DSPP、DMP-1mRNA。结论：EMPs对于SHED向成牙本质样分化具有积极作用。     

EMPs对人牙髓干细胞增殖分化影响的实验研究

目的：将人牙髓干细胞（human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs）与釉基质蛋白（Enamel Matrix Proteins,EMPs）按一定浓度结合,测定牙本质涎磷蛋白（dentin sialoprotein,DSPP）、波形蛋白（vimentin）、碱性磷酸酶（alkaline phophatase,ALP）的表达,阐述EMPs对人牙髓干细胞增殖分化的影响.方法：分别将浓度为100 μg/mL、200μg/mL的EMPs加入培养中的人牙髓干细胞中,分别于3d、5d、7d、9d、11d对细胞进行免疫组化染色,检测细胞爬片DSPP、vimentin、ALP的表达.结果：未经EMPs诱导的人牙髓干细胞DSPP少量细胞阳性表达,vimentin表达阴性,ALP表现低活性.经200 μg/mL的EMPs诱导5d后,人牙髓干细胞DSPP、vimentin染色呈阳性表达,ALP活性明显增加.结论：EMPs对人牙髓干细胞增殖及分化具有促进作用,200 μg/mL的浓度效果最为显著.     

模拟微重力影响人牙髓干细胞的矿化能力与RhoA-Rho激酶信号通路相关性研究

目的初步研究Rho A-Rho激酶信号通路在模拟微重力(Simulated Microgravity,SMG)影响人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs)矿化过程中的作用。方法将经酶消化法分离、纯化后的人牙髓干细胞体外扩增培养,以1×106细胞接种于PLGA支架上,分别于模拟微重力下及普通重力下矿化诱导液中培养,72 h后收集细胞,采用Western Blot检测Rho A蛋白表达;此外,在重力条件下采用Rho激酶抑制剂Y-27632,以矿化诱导液培养组作为对照组,检测矿化诱导3、5、7、10d两组碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)活性变化,采用Western Blot检测矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白牙本质基质蛋白(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达,采用茜素红染色法检测矿化诱导21 d,矿化结节形成水平。结果模拟微重力下,人牙髓干细胞中Rho A蛋白的表达下调;在普通重力矿化诱导条件下,加入抑制剂Y-27632后,各时间点细胞AKP表达水平均较对照组有所降低;矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白DSP、DSPP、DMP-1表达明显下调,矿化诱导21 d,矿化结节形成同样有所减少。结论模拟微重力下,Rho A蛋白表达水平下调;抑制Rho激酶的表达,可降低h DPSCs矿化能力,提示Rho A-Rho激酶信号通路可能参与模拟微重力对h DPSCs矿化能力的影响。     

低浓度氟化钠对人牙髓细胞的成骨/成牙本质分化的影响

目的 探讨低浓度氟化钠对人牙髓细胞（human dental pulp cells,hDPCs）成骨/成牙本质分化的影响。方法 本研究已通过单位伦理委员会审查批准。原代培养hDPCs，采用MTT法检测不同浓度氟化钠对hDPCs增殖的影响；选取合适浓度的氟化钠加入成骨/成牙本质分化诱导培养液中，对hDPCs进行体外诱导，通过茜素红染色检测hDPCs成骨/成牙本质分化能力的变化，RT-qPCR检测分化相关基因的mRNA表达；同时通过RT-qPCR和Western blot检测h DPCs成骨/成牙本质分化过程中内质网应激相关基因的表达。结果 低浓度氟化钠（0.1 mmol/L）在体外可刺激h DPCs增殖，高浓度氟化钠（5～10 mmol/L）可抑制hDPCs增殖（P<0.05）。选取0.1 mmol/L氟化钠体外混合成骨/成牙本质分化诱导培养后hDPCs的茜素红染色增加，成骨/成牙本质分化相关基因牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）和骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）mRNA...     

成体人牙髓干细胞的分离与鉴定

目的从成体人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，初步探讨其分化潜能。方法选取年轻患者因正畸或阻生拔除的健康第三磨牙，取出牙髓，采用酶消化及过滤法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。扩大培养细胞克隆，检测STRO-1的表达。体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节形成、牙本质涎蛋白(DSP)表达、Oil Red—O染色、PPARr2基因表达等方面进行检测。结果克隆来源细胞STRO-1表达阳性。在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达DSP，已向成牙本质细胞方向发生了分化。成脂肪诱导后，Oil Red—O染色阳性，可检测到PPARr2基因表达。结论从成体人牙髓组织中可以分离培养出干细胞，在体外能有效增殖并保持低分化状态。     

重组人结缔组织生长因子对牙髓细胞增殖与成牙本质分化的影响

目的：研究重组人结缔组织生长因子（recombinant connective tissue growth factor, rCTGF）对牙髓细胞（human dental pulp cells,hDPCs）增殖及分化的影响。方法：利用不同浓度（0、1、10、100 ng/mL）rCTGF分别处理牙髓细胞,CCK8法检测牙髓细胞增殖情况;茜素红染色和半定量试验检测细胞矿化结节的形成变化,qRT-PCR测定成牙本质分化相关基因DMP-1、DSPP和OC的表达情况,Western 免疫印迹法测定rCTGF刺激牙髓细胞后,ERK1/2信号通路的磷酸化水平。采用SAS 9.3软件包对数据进行统计学分析。结果：高浓度的rCTGF（100 ng/mL）可以促进牙髓细胞增殖;经矿化诱导后,10 ng/mL rCTGF促进牙髓细胞矿化结节形成的效果最好,钙盐沉积量最明显（P<0.05）,成牙本质分化相关基因DMP-1、DSPP的表达显著上调（P<0.05）。Western 免疫印迹结果显示,10 ng/mL rCTGF刺激牙髓细胞后,p-ERK1/2蛋白的表达升高。结论：rCTGF可能通过激活ERK1/2信号通路,促进牙髓细胞的增殖与分化。     

硅酸钙生物陶瓷对牙髓细胞体外增殖分化的影响

目的:应用硅酸钙(CaSiO3,CS)生物陶瓷作用于人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs),研究其对hDPCs增殖及向成牙本质细胞方向分化的影响。方法:从年轻健康患者(18²0岁)拔除的智齿或前磨牙牙髓组织中获取hDPCs进行培养。将质量浓度为0.2 g/mL的CS浸提液按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和1/128倍比稀释后作用于hDPCs。MTT实验检测不同质量浓度CS浸提液对hDPCs增殖的影响,进而筛选出最佳浓度。以最佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液培养hDPCs 2、4 d后,Real-Time PCR检测以下hDPCs成牙本质相关基因的表达:牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein 1,DMP-1),Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,COL-Ⅰ)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN);培养7、14 d后碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及半定量检测ALP活性。结果:最佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液能够促进hDPCs的增殖,对牙髓细胞DSPP、DMP-1、COL-1、OPN等成牙本质相关基因的表达有较为明显的促进作用。ALP染色及半定量分析显示该浓度的CS浸提液能够提高hDPCs分泌ALP的活性。结论:最佳质量浓度(1/64倍比稀释)CS浸提液能够明显促进hDPCs的增殖,提高成牙本质相关基因的表达,进而促进hDPCs向成牙本质细胞方向分化,为后期hDPCs结合CS支架材料进行牙本质再生的研究打下基础。     

釉质基质蛋白通过miR-32对乳牙牙髓干细胞成骨与成脂分化的影响

目的: 探讨釉质基质蛋白（EMPs）对乳牙牙髓干细胞（SHED）成骨和成脂作用的影响,并探讨其分子机制。方法: 采用流式细胞术检测SHED表面抗原CD73、CD146、CD34和CD45的表达。通过OB成骨诱导液诱导SHED,采用茜素红染色检测其成骨分化能力。将SHED分为4组,NC组为无效序列shRNA干扰SHED,EMPs组为无效序列shRNA干扰SHED后,再用100 μg/L EMPs干预SHED,miR-32 inhibitor组为miR-32 shRNA质粒干扰SHED,EMPs+miR-32 inhibitor组为沉默miR-32后,再用100 μg/L的EMPs组干预SHED。qPCR检测miR-32、牙本质涎磷蛋白 (DSPP)、牙本质基质蛋白1 (DMP-1)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPARγ）和CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）的基因表达。采用Western免疫印迹法检测DSPP、DMP-1、PPARγ和C/EBPα蛋白表达量,茜素红染色检测SHED成骨能力,油红O染色检测SHED成脂能力。采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。结果: 流式细胞术结果显示,SHED的CD146和CD73阳性表达,CD34和CD45阴性表达,与干细胞表面标志物特征一致。茜素红染色和油红O染色显示,矿化结节和油滴明显增多,与干细胞多向分化特征一致。与NC组相比,EMPs组中miR-32基因表达量显著增加（P<0.05）,miR-32 inhibitor组和EMPs+miR-32 inhibitor组中miR-32表达量显著减低（P<0.05）。与NC组相比,EMPs组DSPP和DMP-1表达量,矿化结节数量显著增加（P<0.05）,PPARγ和C/EBPα表达量和油脂滴数量显著降低（P<0.05）,而miR-32 inhibitor组结果与之相反（P<0.05）。与miR-32 inhibitor组相比,EMPs+miR-32 inhibitor组DSPP、DMP-1、PPARγ和C/EBPα表达量,矿化结节数量和油脂滴数量无显著差异（P>0.05）。与EMPs组相比,EMPs+miR-32 inhibitor组DSPP和DMP-1表达量,矿化结节数量显著降低（P<0.05）,而PPARγ和C/EBPα表达量及油脂滴数量显著增加（P<0.05）。结论: EMPs通过促进miR-32的表达,从而调控SHED的成骨和成脂分化。     

SHH和bFGF体外诱导人牙髓干细胞向神经细胞分化的研究

目的：研究体外使用音猬因子（SHH）、碱性成纤维生长因子（bFGF）体外诱导人牙髓干细胞（DPSCs）分化为神经细胞的可行性,以优化人牙髓干细胞向神经细胞分化的诱导条件。方法：从因正畸或阻生拔除的第一前磨牙或第三磨牙中提取牙髓,采用酶消化及过滤法得到单细胞悬液,有限稀释法培养分离的原代人牙髓干细胞,并进行克隆化培养,检测间充质干细胞特异性标志物STRO-1的表达。将人牙髓干细胞分别接种于含有不同浓度诱导液,MTT法检测不同时间、两种因子单独或联合对细胞增殖能力的影;免疫荧光法检测抗微管相关蛋白（MAP-2）、神经元烯醇化酶（NSE）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。透射电镜观察诱导前后细胞超微结构。结果：克隆来源细胞的间充质干细胞特异性标志物STRO-1表达阳性。100μg/L音猬因子SHH与20μg/L碱性成纤维生长因子bFGF单独作用促增殖作用最强（P〈0.05）,碱性成纤维生长因子bFGF单独作用各组及对照组均未检测出神经元样细胞。音猬因子SHH作用各组检测到阳性细胞。而100μg/L音猬因子SHH与20μg/L碱性成纤维生长因子bFGF联合增殖和分化作用均优于其它组。透射电镜观察到神经元样细胞表现。结论：100μg/L音猬因子和20μg/L碱性成纤维生长因子联合可以在体外有效诱导人牙髓干细胞分化为神经细胞。     

腺病毒介导的人骨形成蛋白7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化作用的研究

目的探讨腺病毒介导的人骨形成蛋白7(Ad-hBMP-7)转染对体外培养的人牙髓细胞增殖及向成牙本质细胞分化的作用。方法人胚肾293细胞扩增复制缺陷型重组腺病毒,选用细胞半数感染剂量法测定病毒滴度。体外培养人牙髓细胞,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测病毒的转染率。将 Ad-hBMP-7感染人牙髓细胞,Western blot 检测蛋白表达情况,噻唑蓝比色法(MTT)、酶动力学法、von Kossa 染色及半定量逆转录聚合酶链分别检测转基因细胞的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙化结节的形成和牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA 的表达。结果病毒滴度为1.785×10~(12)pfu/L;人牙髓细胞受 Ad-hBMP-7感染48 h 后即可检测到外源蛋白表达;当感染复数为75时,重组腺病毒对牙髓细胞的转染率达(91.1±1.0)%;与空载体组及未转染细胞组相比,细胞的增殖特性无明显改变;ALP 活性高于对照组(P<0.05);能够形成矿化结节;DSPP mRNA 的表达呈剂量和时间依赖性。结论 Ad-hBMP-7可促进体外培养的人牙髓细胞向成牙本质细胞分化,但对细胞的增殖无明显改变。     

脐静脉内皮细胞与牙本质浸提液诱导的牙髓干细胞共培养成血管的研究

目的:探讨共培养牙本质浸提液(dentin extract, DE)诱导的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)和人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)在成血管方向的潜能。方法:制备人牙本质浸提液,分别诱导培养hDPSCs 7 d和14 d后,Real-time PCR和Western blot检测诱导后hDPSCs中牙本质涎蛋白(DSP)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的表达;血管形成实验共分为5组,分别是:HUVECs组、DE诱导后的hDPSCs组以及按5∶1、5∶5、5∶10比例共培养HUVECs和诱导后hDPSCs组,分别在第3、6、9h检测各组小管形成的相对长度和节点数目。结果:DE诱导的hDPSCs 在mRNA和蛋白水平上表达的DSP、DSPP和DMP-1显著提高(P＜0.05);体外小管形成实验结果示共培养组较早形成稳定的网状结构,在3 h时,HUVEc与诱导后hDPSCs比例为5∶1组形成的小管相对长度和相对分支点数明显高于HUVECs组(P＜0.05),而5∶5组和5∶10组低于HUVECs组(P＜0.05)。结论:牙本质浸提液诱导后的hDPSCs与HUVECs按一定比例共培养可促进血管结构的形成。