大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础.方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定.结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,透射电镜可见Weibel-Palade小体.第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性.结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞.     

内毒素脂多糖对体外血脑屏障模型通透性的影响及其机制研究

感染性脑损伤时血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性增加在血管源性脑水肿发生发展中起重要作用，因此，阐明感染性脑损伤时BBB通透性改变及其调控机制具有十分重要的临床意义。本研究利用同种属的星型胶质细胞（astrocytes，AS）与脑微血管内皮细胞（bain microvascular endothelial cell，BMEC）共同培养，建立体外BBB模型，探讨BBB紧密连接蛋白和细胞骨架肌动蛋白（actin）在内毒素脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）诱导的BBB通透性增高中的变化及其与Rho／Rho激酶细胞信号转导通路的关系。对这一问题的深入探讨，有助于进一步阐明感染性脑损伤的发病机制，为其临床防治提供新的思路。     

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性

目的　研究豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性特征。方法　 (1)用小池技术建立起内皮细胞通透性的体外模型 ;(2 )研究该体外模型耳蜗微血管内皮细胞的跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白的通透曲线 ,并与脑及肺的内皮细胞通透性进行对照。结果　 (1) 3种内皮细胞的体外模型中加入12 5I 牛血清白蛋白后 ,贝克 时间变化图均呈抛物线型上升曲线 ,其通透性从小到大依次为脑、耳蜗、肺内皮细胞 ,各组间相差显著 (P <0 .0 1) ;(2 )耳蜗、脑及肺 3种内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻呈动态增加过程 ,以 5× 10 4/cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻均到达峰值 ,其跨细胞电阻峰值大小分别为脑 (2 4 4 .7± 4 6 .9Ω/cm2 ) >耳蜗 (118.9± 18.5Ω/cm2 ) >肺 (4 6 .6± 5 .9Ω/cm2 ) ,且各组间相差显著 (P <0 .0 1)。结论　该模型下耳蜗微血管内皮细胞的通透性与其活体时的通透性特征基本一致。     

体外血脑屏障模型的建立与鉴定

目的应用原代分离培养BALB／c小鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMVEC）建立体外血脑屏障模型，探讨跨血脑屏障（blood brain barrier，BBB）电阻与屏障渗透功能的动态关系以及最佳构建条件。方法用酶消化、机械分离结合密度离心的方法得到原代BALB／c小鼠脑血管内皮细胞，通过培养在具有特殊质材和孔径的Transwell小室上建立BBB体外实验模型，采用倒置显微镜、电镜观察细胞形态结构和生长规律，紧密连接ZO-1蛋白免疫组化检测，比较血脑屏障形成前后膜两侧电阻动态变化与1H葡萄糖通透性的关系等方法，探讨血脑屏障模型的建立及生长特性。结果BMVEC培养至汇合后具有典型的“铺路石”样外观；扫描电镜显示细胞形成致密单层，透射电镜、ZO-1蛋白免疫组化证实细胞问形成光滑、连续、高密度的紧密连接；1H葡萄糖的通透量与实时电阻呈负相关，内皮细胞电阻随着通透性的增加而降低，通透率最低时跨细胞电阻为（346&#177;10）Ω／cm2。结论建立的BBB体外模型在形态学、电阻和通透性方面具备了BBB的基本特性。     

大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型的建立

[目的]建立大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型。[方法]采用原代培养脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养方法建立血脑屏障体外模型。[结果]星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞共培养可提高血脑屏障特异性酶——γ-谷胺酰胺转肽酶、碱性磷酸酶的表达,提高脑微血管内皮细胞跨细胞间电阻。[结论]成功建立脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型,而且较单层内皮细胞模型更接近在体状态。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。方法用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养,用光镜及免疫组织化学检测进行鉴定。结果分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养5～7d左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学测定阳性。结论该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。     

体外血脑屏障模型的建立及发展

1885年德国人Paul Ehrlich第一次证明了脑血管的通透性与非神经性血管不同,其后的研究者们相继认识到血和脑之间有屏障存在,并称之为血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB).血脑屏障是一个以脑微血管内皮细胞(brain micro-vascular endothelial cell,BMEC)、星形胶质细胞(Astrocyte)和周细胞(Pericyte)共同构成的结构的和功能的屏障,它调节分子进出大脑以维持神经的微环境.脑微血管内皮细胞以细胞间的紧密连接(tight junction,TJ)为主要特征、缺少窗口结构、低胞饮作用、无Weible-Palade小体,这些其他血管内皮细胞所不具备的特征,使其成为BBB的主要结构基础,也是BBB的功能基础,可以保护大脑不被血液内的微生物和毒素的伤害.     

阿魏酸钠对培养大鼠大脑微血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用

目的：研究缺氧对脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMEC）的损伤及阿魏酸钠（Sodium ferulate）对它的保护作用.方法：取体外培养的大鼠脑皮质微血管内皮细胞,置于95%N2和5%CO2的缺氧盒中12h造成内皮细胞缺氧.用透射电镜观察BMEC的超微结构变化.用内皮细胞线粒体活性和内皮细胞死亡率来评价内皮细胞活力,并用乳酸脱氢酶（LDH）漏出量作为评价损伤的指标.结果：体外培养大鼠脑皮质BMEC缺氧12h后,细胞超微结构损伤,细胞存活率及线粒体活性明显降低,LDH释放量显著增加.阿魏酸钠可显著对抗缺氧对BMEC的损伤.结论：阿魏酸钠对大鼠脑皮质BMEC缺氧损伤具有保护作用.     

小鼠脑微血管内皮细胞的体外培养

目的 探讨脑微血管内皮细胞的体外培养方法并进行细胞超微结构研究及组织型纤溶酶原激活物（ＴＰＡ）活性测定。方法 取新生小鼠脑组织,通过匀浆、过筛、胶原酶消化、差速粘附等技术对鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养,待细胞铺满瓶底时,用０．１２５％胰酶－０．０２％ＥＤＴＡ消化,离心收集内皮细胞,进行传代培养。原代、传代各取８例,吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试ＴＰＡ活性。结果 经Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学鉴定     

豚鼠血迷路屏障通透性的体外模型

目的 研究豚鼠血迷路屏障通透性体外模型的建立方法及其通透性特征。方法 （1）用组织块贴壁培养法分离培养豚鼠耳蜗微血管内皮细胞，免疫组化法进行鉴定；（2）用小池技术建立起内皮细胞通透性的体外模型，并研究该模型中耳蜗、脑及肺3种内皮细胞对^125I-牛血清白蛋白的通透性；（3）研究豚鼠血迷路屏障对^125I-牛血清白蛋白的通透性。（3）研究豚鼠血迷路屏障对^125I-牛血清白蛋白的通透性。结果 （1）培养细胞致密融合对具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观，经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子，95％以上的培养细胞的胞质中呈棕黄色阳性反应；（2）耳蜗、脑及肺3种内皮细胞的体外模型中加入^125I-牛血清白蛋白后，贝克－时间变化图均呈抛物线型上升曲线，90min内几乎呈直线；（3）豚鼠血迷路屏障对^125I－牛血清白蛋白的通透性曲线与体外模型相似。结论 血迷路屏障的体外模型能大体反映在体时的通透性特征。     

血脑屏障紧密连接的分子构成及信号调控的研究进展

血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）对于维持中枢神经系统内环境的稳定具有重要的意义。BBB是一层连续覆盖在99％脑毛细血管腔表面的内皮细胞膜，脑微血管内皮细胞之间的紧密连接（tight junction，TJ）是血脑屏障的结构与功能的基础。跨膜蛋白、胞质附着蛋白及细胞骨架蛋白共同组成了TJ，各种内源、外源的信号通路通过调节这些蛋白达到对血脑屏障通透性的调节。研究表明，TJ是保持BBB完整性的重要因素。外伤、缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素等均可能引起TJ结构及功能发生改变造成BBB损害，从而导致BBB的通透性升高引起脑水肿。本拟对血脑屏障的紧密连接分子基础和信号调控的研究进展进行综述。     

血脑屏障分子组成研究进展

血脑屏障（BBB）是维持脑内环境稳定和避免有害物质入侵脑组织所必须的膜性结构。脑微血管内皮细胞之间的紧密连接是BBB的结构基础,是保持BBB完整性的重要因素。紧密连接结构是由胞浆黏附蛋白、claudin、occludin、连接黏附分子和tricellulin共同组成的。外伤、缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素等均可能引起紧密连接结构及功能发生改变,造成BBB损害,导致BBB的通透性升高,进而引起脑水肿。本文拟对血脑屏障的分子组成研究进展进行综述。     

脑溢安对缺氧大鼠脑微血管内皮细胞VEGF蛋白表达的影响

目的:观察脑溢安血清对体外缺氧培养的大鼠脑微血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。方法:大鼠用脑溢安浸膏连续灌胃3d后,心脏内采血分离出血清;用新生7d SD大鼠脑内分离培养的微血管内皮细胞（RCMEC）移入厌氧培养箱造成缺氧模型;MTT法测定细胞活性;免疫细胞化学及Werstern blotting研究脑微血管内皮细胞VEGF蛋白表达。结果:缺氧18h脑溢安组OD值较对照组增高（P<0.05）。缺氧损伤的脑微血管内皮细胞内VEGF蛋白表达增强,脑溢安血清组VEGF蛋白的表达水平高于对照组(P<0.01)。结论:缺氧可诱导脑微血管内皮细胞VEGF蛋白的表达;脑溢安可以上调VEGF蛋白的表达,这可能是脑溢安对缺氧的脑微血管内皮细胞的保护作用机制之一。     

大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的 探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障(BTB)模型提供材料.方法 采集出生3～5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达.结果 体外培养2h时脑微血管段贴壁,12～48 h见圆形生发中心形成,2～3d单层内皮细胞自生发中心长出,4～5 d见较大单层内皮细胞团,5～7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈“铺路石”样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示“铺路石”样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性.结论 本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究.     

亚低温对脑出血后血脑屏障内皮细胞Rho激酶Ⅱ表达影响的研究

目的通过观察亚低温对实验性脑出血后的血脑屏障（BBB）、BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的影响,进一步探讨亚低温减轻血管源性脑水肿的机制。方法将健康雄性SD大鼠（54只）随机分为3组：生理盐水组、脑出血组和亚低温＋脑出血组。采用自体血注入法建立脑出血模型,伊文思蓝浓度测定BBB通透性、脑水含量（干湿重法）,观察各组大鼠BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达（免疫组化法）。结果脑出血24 h后BBB通透性开始增加,72 h达高峰,7 d后开始下降,其变化趋势与脑水含量及BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达一致。亚低温＋脑出血组的BBB通透性、脑水含量及BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达均低于脑出血组。结论脑出血后血管源性脑水肿的形成与BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的高表达有关;亚低温可以通过减少其表达来减轻BBB通透性的增加,减轻脑水肿,进一步保护脑组织。     

脑心通胶囊对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用

目的 观察脑心通胶囊对体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用.方法 建立体外培养大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血再灌注损伤模型,模拟脑缺血3 h,再灌注1,3,6,12,24,36,48,72 h后损伤内皮细胞的活性、死亡率变化以及脑心通胶囊的影响,测定体外培养大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血3 h,再灌注24 h时脑心通胶囊含药血清对细胞裂解液SOD活性、MDA及NO含量的影响.结果 体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞在模拟缺血再灌注损伤后,细胞内线粒体活力下降,死亡率升高,脑心通胶囊0.24,0.48 g&#183;kg-1能不同程度改善细胞损伤(P＜0.05,P＜0.01),明显提高裂解液中SOD活性(P＜0.05,P＜0.01),降低裂解液中MDA和NO含量(P＜0.05,P＜0.01),对大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用.结论 脑心通胶囊对体外培养大鼠脑微血管内皮细胞模拟脑缺血损伤有保护作用,其机制可能与抗脂质过氧化作用有关.     

高糖对脑微血管内皮细胞活力和内皮素-1的影响

目的：探讨体外培养条件下高糖状态对大鼠脑皮质微血管内皮细胞（Brain microvascular endothelial cells，BMEC）的影响。方法：建立大鼠脑皮质微血管内皮细胞体外培养模型，用透射电镜观察正常浓度（5．05mmol／L）和高浓度（15mmol／L、30mmol／L）葡萄糖培养基中培养24h后内皮细胞的超微结构变化，用MTT法评价内皮细胞活力，采用放射免疫方法测定内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）含量，用原位杂交法测定ET-1mRNA表达。结果：高浓度葡萄糖可使内皮细胞超微结构损伤，细胞活力降低，ET-1分泌显著上调，并呈剂量依赖性损伤细胞，但ET-1mRNA表达无明显变化。结论：高糖对脑皮质微血管内皮细胞有显著的损伤作用，ET-1升高在糖尿病微血管病变早期可能起主要作用。     

槲皮素对血脑屏障的透过及胶质瘤U251细胞活性的影响

目的 研究槲皮素对血脑屏障(BBB)透过情况及对人胶质母细胞瘤U251细胞增殖和凋亡的影响.方法 原代培养脑微血管内皮细胞(BMVEC)和星形胶质细胞(AC),建立BBB体外模型,通过电子显微镜和跨膜电阻值(TEER)测量验证BBB模型,采用高效液相色谱(HPLC)检测槲皮素透过血脑屏障的情况.槲皮素处理U251细胞,用MTT观察细胞的生长、TUNEL检测细胞凋亡、彗星电泳(SCGE)分析DNA损伤及流式细胞术(FCM)分析细胞周期分布情况.结果 透射电镜及TEER鉴定BBB体外模型构建成功,HPLC检测发现槲皮素对血脑屏障的透过率达到65.54%.槲皮素对人胶质母细胞瘤U251细胞有明显的增殖抑制及凋亡诱导作用,流式细胞仪检测提示槲皮素作用后,U251细胞阻滞于G2/M期.结论 槲皮素可有效透过BBB,并对人胶质母细胞瘤U251细胞有明显的增殖抑制及凋亡诱导作用.     

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞体外通透性的研究

目的　研究豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性特征。方法　在成功建立豚鼠耳蜗微血管内皮细胞体外通透性模型的基础上 ,研究该体外模型跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白的通透性。结果　①耳蜗微血管内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻呈动态变化过程 ,以 5× 10 4/cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,其跨细胞电阻峰值大小为 (118 9± 18 5 )Ω/cm2 ;②体外模型中加入12 5I 牛血清白蛋白后 ,其通透性呈上升期抛物线型曲线 ,90min内几乎呈直线。结论　跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白变化曲线能反映体外耳蜗微血管内皮细胞的通透性特征     

划痕损伤对大鼠大脑皮层微血管内皮细胞NF-κB表达及继发性死亡的影响

目的  通过体外培养SD大鼠大脑皮层微血管内皮细胞并制作划痕损伤模型,观察划痕损伤对脑微血管内皮细胞NF-κB表达及其自噬、凋亡和坏死的影响。方法  体外培养SD大鼠大脑皮层微血管内皮细胞并制作划痕损伤模型,应用NF-κB抑制剂吡咯醛二硫氨基甲酸（PDTC）干预划痕损伤脑微血管内皮细胞。随机分为对照组、单纯损伤组、损伤+抑制组,在不同时间点（损伤后1、6、12、24及48 h）分别应用免疫荧光细胞化学法测定磷酸化NF-κB p65蛋白的表达,Annexin V/PI染色法检测凋亡、坏死,Western blot检测自噬蛋白LC3Ⅱ表达情况。对照组为无划痕损伤的脑微血管内皮细胞。结果  脑微血管内皮细胞划痕损伤后NF-κB蛋白表达于伤后1 h开始表达增强,于24 h达高峰,与对照组比较差异有统计学意义（P <0.05）。凋亡、坏死及自噬各指标均随时间推移有不同程度升高,与对照组比较差异有统计学意义（P <0.05）。而经PDTC处理后上述变化均受不同程度的抑制,与单纯损伤组相比差异有统计学意义（P <0.05）。结论  划痕损伤后可激活脑微血管内皮细胞NF-κB表达,同时可引起脑微血管内皮细胞的自噬、凋亡和坏死。