shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

雄激素受体反义RNA对前列腺癌细胞LNCaP生长特性的影响

目的　观察雄激素受体 (Androgenreceptor ,AR)反义RNA对前列腺癌细胞LNCaP生长特性的影响。方法　用含不同浓度雄激素培养基培养前列腺癌细胞LNCaP、LNCaPas AR(基因组DNA中整合了AR反义RNA逆转录病毒载体的LNCaP细胞 )和LNCaPNeo(基因组DNA中整合了空逆转录病毒载体的LNCaP细胞 ) ,用台盘蓝染色细胞计数法及3 H 胸腺嘧啶核苷掺入试验观察体外细胞增殖状况。结果　在 1nmol/L合成雄激素R1881、10nmol/L 17β 雌二醇和 1nmol/L孕酮浓度下 ,与LNCaPNeo和LNCaP相比 ,LNCaPas AR生长显著受抑制 (P <0 0 5 ) ,LNCaPNeo与LNCaP细胞增殖无显著性差异 (P >0 0 5 )。3 H 胸腺嘧啶核苷掺入试验表明LNCaPas AR的DNA合成明显抑制率非常显著地高于对照组LNCaPNeoDNA合成抑制率 (P <0 0 1) ,显微镜下观察见LNCaP和LNCaPNeo生长状态良好 ,而LNCaPas AR细胞稀疏且有较多细胞死亡。结论　雄激素受体反义RNA可以改变LNCaP细胞的雄激素非依赖性特征 ,抑制前列腺癌细胞LNCaP对激素的增殖反应     

雄激素受体反义RNA抑制前列腺癌细胞LNCaP致瘤性的研究

目的　观察雄激素受体 (Androgenreceptor ,AR)反义RNA对前列腺癌细胞LNCaP致瘤性的影响。方法　分别用细胞平板克隆形成试验及裸鼠接种实验观察前列腺癌细胞LNCaP、LNCaPNeo和LNCaPas AR 细胞致瘤性的变化。结果　LNCaPas AR细胞的克隆形成效率显著低于LNCaPNeo细胞 (P <0 .0 1)。LNCaPas AR细胞在雄性裸鼠体内形成的瘤体体积明显小于LNCaPNeo细胞并且形成瘤体的时间延长。结论　雄激素受体反义RNA可抑制前列腺癌细胞LNCaP成瘤能力。     

RNA干扰沉默雄激素受体基因对前列腺癌细胞生长的抑制作用研究

目的设计、合成针对雄激素受体(AR)基因的具有高干扰效率的si RNA,观察其对前列腺癌细胞的生长抑制作用。方法设计、合成多个针对AR的si RNA,转染前列腺癌细胞LNCaP,筛选出对AR基因干扰效率最高的ARsi RNA,用RT-PCR检测AR mRNA水平,并计算细胞生长抑制率。结果采用Silencer si RNA Construction Kit成功合成了ARsi RNA,转染LN-CaP细胞,筛选出一个对其生长抑制作用最强的si RNA,并证实AR mRNA水平显著下降,LNCaP细胞的生长抑制率为78.2%。结论针对雄激素受体的si RNA可沉默雄激素受体基因,并抑制前列腺癌细胞的生长。     

雄激素受体反义RNA对前列腺癌细胞雄激素受体表达的抑制作用研究

目的 观测雄激素受体（AR）反义RNA逆转录病毒表达载体在前列腺癌细胞中的表达及其对AR表达的影响。方法 将AR反义RNA逆转录病毒表达载体导入前列腺癌细胞株LNCaP，PCR检测AR目的片段在重组LNCaP细胞基因组中的存在，RT－PCR检测AR反义RNA表达和AR mRNA水平，Western blot检测AR蛋白表达水平。结果 PCR在LNCaP^as-AR基因组DNA中扩增出了AR目的片段，表明AR目的片段整合到了细胞基因组。RT－PCR证实LNCaP^as-AR有AR反义RNA表达，且其AR mRNA水平较LNCaP和空载体转染的LNCaP^Neo显著下调（P＜0.05)，Western blot证实LNCaP^as-AR细胞AR蛋白含量显著下降（P＜0.05)。结论 AR反义RNA可抑制前列腺癌细胞AR表达。     

shRNA沉默雄激素受体基因抑制人前列腺癌裸鼠移植瘤

目的：探讨雄激素受体（androgen receptor,AR）小片段发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）通过沉默AR基因对人前列腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法：建立人前列腺癌细胞株22RV1裸鼠移植瘤模型,同时构建针对其AR的shRNA,经酶切导入质粒载体,测序确认后行重组质粒的大量制备。将荷瘤裸鼠随机分为实验组和对照组,待移植瘤体积长至300 mm³左右时,实验组裸鼠予单次尾静脉注射AR shRNA质粒（2 μg/g体重）,对照组注射等量生理盐水。隔日观察并记录肿瘤体积变化情况,至实验后14 d为观察终点,处死裸鼠取出肿瘤组织称重,比较两组肿瘤生长差异。对肿瘤组织行AR、Ki-67蛋白免疫组织化学染色及TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transterase-mediated dUTP nick end labeling）检测,用HSCORE计分法、增殖指数（proliferative index,PI）和凋亡指数（apopto-tic index,AI）分别量化AR、Ki-67免疫组织化学染色和TUNEL检测结果,比较两组肿瘤组织在AR蛋白表达及细胞增殖、细胞凋亡方面的差异。结果：实验组较对照组肿瘤生长缓慢,至观察终点,实验组肿瘤体积为（1 199.56±86.48）mm ³,较对照组肿瘤体积（1 742.02±98.16）mm ³明显缩小（P=0.002）。实验组肿瘤重量为（1 006.2±79.1）mg,较对照组肿瘤重量（1 383.4±74.8）mg明显减轻（P=0.005）。实验组的AR HSCORE、PI、AI分别为25.8±6.7、（26.0±3.1）%、（55.6±7.9）%,与对照组［268.8±18.7、（87.6±7.9）%、（27.2±3.9）%］相比,差异均有统计学意义（P均<0.01）。结论：AR shRNA可以通过静脉注射的方式,在体内抑制雄激素受体表达,从而抑制人前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长。     

前列腺癌细胞雄激素受体基因CAG重复序列改变的初步研究

目的 了解前列腺癌细胞雄激素受体（ＡＲ）基因ＣＡＧ重复序列有否改变。方法 显微镜下分别取１１例前列腺癌标本的肿瘤细胞及非肿瘤细胞，提取ＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增后，用变性胶电泳测得肿瘤细胞和非肿瘤细胞ＤＮＡ含ＡＲ基因ＣＡＧ重复序列片段的相对长度。结果 有３例（２７．３％）前列腺癌细胞ＡＲ基因ＣＡＧ重复序列较非肿瘤细胞短。其余８例前列腺癌细胞ＡＲ基因ＣＡＧ重复序列与非肿瘤细胞相同。结论 一些病例的前列腺癌     

腺相关病毒8型介导siRNA对前列腺癌雄激素受体表达的抑制

目的:研究腺相关病毒8型( AAV8)介导的siRNA对前列腺癌雄激素受体(AR)表达的抑制作用.方法:针对AR设计了4个不同的siRNA( siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)为实验组,并以病毒颗粒AAV8为载体,转染到前列腺癌LNCaP细胞中,提取总RNA和总蛋白,分别用RT-PCR和Western blot检测AR mRNA和蛋白的表达,另设一不针对AR基因的无意义片断作为阴性对照组,比较实验组与对照组间的差异.结果:各实验组AAV8-AR-siRNA(1～4)与阴性对照组相比较ARmRNA表达水平明显下调,其中siRNA1组AR表达最低.相对于阴性对照组,各实验组的AR蛋白表达水平也均有不同程度的下降,但以siRNA1组AR蛋白表达最低.结论:利用病毒颗粒AAV8介导的RNAi技术能显著地抑制前列腺癌细胞中AR基因的表达,为进一步的动物实验和临床药物研制打下了基础.     

晚期前列腺癌雄激素受体基因CAG多态性相关研究

目的研究晚期前列腺癌患者AR基因CAG多态性现象。方法对晚期前列腺癌患者以病理分级及是否雄激素依赖性进行分组,分别检查其AR基因CAG长度多态性,与健康男性AR基因CAG多态性进行对比。结果共35例患者纳入研究,其中低分化腺癌9例,中分化腺癌14例,高分化腺癌12例,有27例为雄激素依赖性癌,8例非雄激素依赖性癌。纳入15例健康对照。其中前列腺癌患者与健康男性CAG长度比较,P=0.725,P>0.05;不同病理分级前列腺癌与健康男性CAG长度比较,组间差异P=0.849,P>0.05;雄激素依赖与非雄激素依赖前列腺癌与健康男性CAG长度比较,组间差异P=0.350,P>0.05。结论AR基因CAG多态性与晚期前列腺癌病理分级及是否雄激素依赖性无明显统计学关系。     

前列腺癌细胞雄激素受体基因CAG重复序列改变的初步研究

目的了解前列腺癌细胞雄激素受体(AR)基因CAG重复序列有否改变.方法显微镜下分别取11例前列腺癌标本的肿瘤细胞及非肿瘤细胞,提取DNA,经PCR扩增后,用变性胶电泳测得肿瘤细胞和非肿瘤细胞DNA 含AR基因CAG重复序列片段的相对长度.结果有3例(27.3%)前列腺癌细胞AR基因CAG重复序列较非肿瘤细胞短.其余8例前列腺癌细胞AR基因CAG重复序列与非肿瘤细胞相同.结论一些病例的前列腺癌细胞AR基因CAG重复序列可发生变化,其变化与前列腺癌的发生、发展和对抗内分泌治疗的关系尚待进一步的研究 .     

前列腺癌细胞的雄激素脱逸机制

雄激素受体双重突变使前列腺癌细胞对糖皮质激素敏感,这一发现提示了一条新的途径,由此前列腺癌细胞可以逃避雄激素依赖性。前列腺癌是西方国家男性的第二大癌症死亡原因,已知雄激素、孕激素、肾上腺雄激素,甚至抗雄激素能刺激前列腺癌细胞的基因表达和生长,因此对前列腺癌转移者的标准治疗包括抑制雄激素的产生和     

慢病毒介导shRNA特异性沉默TLR4基因对大鼠肺泡巨噬细胞功能的影响

目的构建表达大鼠TLR4 shRNA的慢病毒,并观察其对大鼠肺泡巨噬细胞TLR4的抑制作用和对内毒素(LPS)诱导的IL-6、IL-1β释放的影响。方法设计并构建4个可能具有干扰效力的shRNA表达质粒,将他们分别与预先构建好的TLR4表达质粒共转染HEK-293T细胞,筛选出一段干扰效果最好的shRNA,使用Gateway的方法重组到慢病毒表达载体中并进行病毒包装和滴度测定,使用包装好的慢病毒感染大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383并加入LPS刺激,ELISA检测IL-1β、IL-6的释放情况。结果成功筛选出具有较高干扰效率的shRNA,并成功包装入慢病毒,慢病毒滴度为2.0×106TU/ml。转染慢病毒后的LPS诱导的肺泡巨噬细胞IL-1β、IL-6的释放均明显减少(P0.05)。结论成功构建了表达大鼠TLR4 shRNA的慢病毒,具有良好的抑制IL-1β、IL-6表达的作用,为下一步动物体内实验基因治疗大鼠肺移植后的慢性排斥反应奠定良好的基础。     

雄激素受体基因多态性与前列腺癌关系的研究

目的探讨前列腺癌与雄激素受体基因多态性(ARStuI)的关系.方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法,对81例前列腺癌患者及90例同龄老年非前列腺癌男性ARStuI进行检测,分析ARStuI与前列腺癌之间的关系.结果前列腺癌患者和对照组中S1等位基因所占比例分别为12.3%和3.3%,差别具有显著意义(P=0.040);S1基因型与进展期(C、D期)肿瘤、高分级肿瘤(Gleason评分≥7)及高危险性肿瘤(进展期肿瘤或高分级肿瘤)均无显著性差异;S1在存在骨转移的患者中的比例为28.0%,而在无骨转移的患者中则为5.4%,其统计学差异具有显著意义(P=0.008).结论前列腺癌的易感性可能与ARStuI有关.     

慢病毒介导的CBS基因沉默对人胶质瘤细胞增殖的影响

目的:探究催化产生内源性H₂S的酶CBS在人胶质瘤细胞增殖中的作用。方法:以人脑胶质瘤U87细胞为实验对象,使用CBS基因shRNA慢病毒载体转染胶质瘤细胞CBS基因,利用0.5μg/mL嘌呤霉素筛选建立CBS-RNAi慢病毒的U87稳定细胞株,通过qPCR法对各组CBS基因的表达量检测,确定目标基因的沉默效果以及CBS基因沉默对于U87细胞的增殖能力的影响。结果:与空白对照组相比,CBS-RNAi 2组的CBS mRNA表达量明显降低,CBS-RNAi 1组和CBS-RNAi 3组的CBS mRNA表达量降低;证明慢病毒介导的RNAi可有效沉默人胶质瘤U87细胞的CBS基因,且CBS-RNAi组沉默人胶质瘤细胞CBS基因的效果最佳。结论:沉默CBS基因能够抑制人胶质瘤U87细胞的体外增殖,CBS基因或可成为临床治疗人脑胶质瘤的新靶点。     

雄激素和表皮生长因子及其受体对前列腺癌细胞增生的作用机制和临床意义

前列腺癌作为当前欧美国家常见的癌症及其在我国的发病率逐渐升高而越来越受到人们的关注。雄激素通过雄激素受体在前列腺发育中促使其上皮增殖和分化。在成人中，前列腺上皮细胞增生和死亡保持在一个相对的动态平衡状态。雄激素在保持前列腺上皮完整性中起重要作用，如果去除雄激素则造成前列腺上皮的凋亡。在成年鼠前列腺研究中发现，去势后7d将有70％的前列腺上皮细胞凋亡。临床上去势治疗是前列腺癌治疗的重要手段，前列腺癌初始是雄激素依赖性的，通过药物或手术去势的方法可有效控制癌的发展。     

沉默lncRNA PCA3减少前列腺癌细胞雄激素受体表达抑制前列腺癌细胞增殖和转移

目的 研究沉默lncRNA PCA3 对前列腺癌细胞的影响。方法 选择前列腺癌细胞LNCaP 和C4-2 细胞,使用siRNA 干扰PCA3 在细胞内的表达,实时定量PCR 法检测干扰效果,检测siRNA 干扰PCA3 后对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,Western blot 法在前列腺癌C4-2 细胞内分别检测雄激素受体及其变体7 的表达情况。结果 PCA3 特异性的siRNA 可明显抑制前列腺癌细胞内PCA3 mRNA 的表达,抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭潜能。沉默PCA3 后的C4-2 细胞内雄激素受体及其变体7 表达明显减少。结论 沉默lncRNA PCA3可减少前列腺癌细胞内AR 及AR-V7 的表达,从而抑制前列腺癌细胞增殖和迁移等恶性转变。     

雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌雄激素受体表达水平的变化

目的:从雄激素受体表达水平变化的角度,探讨雄激素依赖性前列腺癌向雄激素非依赖性前列腺癌转化的可能机理。方法:体外培养雄激素依赖性前列腺癌细胞株(LNCaP细胞)和雄激素非依赖性前列腺癌细胞株(PC-3细胞),应用流式细胞术测定两种细胞株在生理盐水和二氢睾酮(DHT)作用下雄激素受体(AR)的表达水平。结果:两种细胞株均有AR表达,两种条件下AR的表达水平分别为:LNCaP细胞生理盐水处理组85.99±4.97,DHT处理组93.74±3.63;PC-3细胞生理盐水处理组8.52±1.57,DHT处理组9.52±1.75,两种条件下LNCaP细胞的AR表达水平均高于相应条件下PC-3细胞的AR表达水平,两者有显著性差异(P<0.05)。DHT作用下LNCaP细胞的AR表达水平显著高于生理盐水作用下LNCaP细胞的AR表达水平(P<0.05);DHT作用下PC-3细胞的AR表达水平与生理盐水作用下PC-3细胞的AR表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论:雄激素依赖性前列腺癌细胞过表达AR,并且二氢睾酮能促进其表达AR;雄激素非依赖性前列腺癌细胞AR表达较少,二氢睾酮对其AR表达无明显作用,雄激素依赖性前列腺癌向雄激素非依赖性前列腺癌转化可能与前列腺癌雄激素受体表达水平下降有关。     

慢病毒介导FGFR1 沉默对肺癌细胞 增殖和凋亡的影响

目的 探讨慢病毒介导成纤维生长因子受体1（FGFR1）沉默对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。 方法 构建慢病毒表达载体LV-shFGFR1,对其进行包装和病毒颗粒制备。将A549 肺癌细胞分为干扰组、 空载体组及对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blotting 检测各组细胞FGFR1 mRNA 和蛋白 相对表达量,MTT 比色法检测细胞增殖情况,流式细胞术和Hoechest 染色检测细胞凋亡情况。结果 ① 3 株 肺癌细胞中,A549 细胞的FGFR1 mRNA 相对表达量高于H3255 和A-427 细胞（P <0.05）。② 3 组A549 细 胞中FGFR1 mRNA 和蛋白的相对表达量比较,差异有统计学意义（P <0.05）;空载体组与对照组比较,差异 无统计学意义（P >0.05）;干扰组低于对照组（P <0.05）。③干扰组、空载体组、对照组0、12、24、48 和 72 h 的A549 细胞增殖情况比较,不同时间点、各组间、随时间变化趋势均有差异（P <0.05）。④ 3 组A549 细胞凋亡率比较,差异有统计学意义（P <0.05）;空载体组与对照组比较,差异无统计学意义（P >0.05）;干 扰组高于对照组（P <0.05）。结论 慢病毒介导FGFR1 沉默抑制A549 肺癌细胞增殖,同时促进肺癌细胞凋亡, 提示FGFR1 可能参与肺癌细胞的发生、发展过程。     

慢病毒载体介导shRNA的研究进展

RNA干扰（RNAi）通过双链RNA的介导,特异性阻止相关序列的表达,从而导致转录后水平的基因沉默.RNAi广泛存在于真核生物中.慢病毒载体是理想的真核细胞基因转移工具,广泛应用于相关的RNAi研究领域,如抗病毒研究、癌症及其治疗、基因治疗.现已发现,慢病毒载体能够介导组织、时间特异的RNAi,在疾病的基因靶向治疗上必有广阔前景.     

慢病毒介导HIF-1α沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用Western Blot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。Western Blot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③Western Blot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。