实验性创伤后脊髓凋亡细胞的流式细胞仪分选方法

目的：探讨创伤后脊髓凋亡细胞的流式细胞仪分选方法。方法：使用PI和Annexin V/PI检测法进行细胞凋亡的检测和分选。结果：Annexin V/PI检测法细胞凋亡的检出率显著高于PI法（P＜0．05）,并可区正常细胞,凋亡细胞和死亡细胞。结论：Annexin V/PI是目前较为理想的细胞凋亡检测和分选方法。     

流式细胞仪分选大鼠胰岛β细胞方法的建立及应用

目的:应用流式细胞仪(FCM)结合侧向角散射光(SSC)和细胞自发荧光强度分选大鼠胰岛β细胞。方法:选取正常雄性SD大鼠,胶原酶消化显微镜下手捡纯化胰岛。胰岛以胰蛋白酶和DNA酶消化成单细胞悬液。依据细胞自发荧光强度和SSC的差异通过流式细胞仪进行细胞分选。细胞存活率用PI/HO双染法鉴定,β细胞的纯度用细胞免疫组化鉴定。胰岛素测定采用酶联免疫吸附法。结果:自发荧光强度和SSC均高的细胞群中胰岛素染色阳性的细胞百分比为(94.5±0.95)%,较分选前单细胞中胰岛素染色阳性细胞百分比(81.2±1.12)%增高,为β细胞富集群;自发荧光强度和SSC均较低的细胞群中胰岛素染色阳性的细胞百分比为(10.0±0.82)%,为non-β细胞群。分选出的β细胞群死亡率低(<0.001)。此外,Forskolin(FK)和Exendin-4(EX4)可以显著增强β细胞胰岛素的分泌(PFK<0.001,PEX4<0.05)。结论:根据β细胞自发荧光和SSC与non-β细胞的差异进行纯化的β细胞死亡率低、纯度高,胰岛素分泌功能较好,是一种值得推广的分选β细胞的方法。     

免疫磁珠分离及流式细胞仪分选纯化外周血CD34+/CD90+干细胞

目的　建立人外周血CD34 细胞及其亚群的纯化分离方法。方法　用干细胞采集仪收集了 3例病人的外周血干细胞 ,应用免疫磁珠分离柱快速分离其中的CD34 细胞 ,随后采用分选型EPICSElite流式细胞仪进一步分选出CD34 /CD90 双阳性早期造血干细胞。结果　免疫磁珠分离纯化后CD34 干细胞的纯度可达 83%～ 95 % ,回收率 5 4 %～ 71% ,活细胞率 >95 %。流式细胞仪分选后的CD34 /CD90 细胞纯度可达 90 %以上 ,回收率在 4 0 %～ 5 0 % ,生存率 >95 %。起始标本中CD34 细胞含量越高 ,纯化所得到的干细胞纯度和回收率越高。两种纯化后的干细胞在形态学上有明显的不同。结论　联合应用免疫磁珠分离和流式细胞仪分选 ,可以较高的回收率快速纯化高纯度的CD34 细胞及其亚群     

流式细胞仪分选侧群细胞条件的探索与优化

目的探讨不同浓度的荧光染料(Hoechst 33342)和抑制剂维拉帕米(verapamil)对流式细胞仪分选侧群(SP)细胞的影响。方法实验分为Hoechst 33342组(Hoechst 33342浓度分别为2.5、5.0和7.5μg/mL)和抑制组(Hoechst 33342+verapamil,verapamil浓度分别为50、100和150μmol/L),用流式细胞仪分选人肺腺癌细胞系A549中SP细胞,摸索Hoechst 33342和verapamil的最佳浓度,并用本实验室构建的一株肿瘤细胞系K1进行验证。结果在verapamil和Hoechst 33342浓度分别为150μmol/L和7.5μg/mL时,A549细胞染色充分,SP细胞亚群与非SP(non-SP)细胞亚群分群明显,SP细胞约为2.2%。K1细胞在verapamil为50μmol/L和Hoechst 33342为5μg/mL时,SP细胞亚群与non-SP细胞亚群分群明显,SP细胞亚群可被verapamil抑制,其比例约为1.3%。分选后的SP细胞和non-SP细胞可进一步扩增培养。结论 Hoechst 33342和verapamil可影响肿瘤细胞中SP细胞分选效率。     

利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪(FACS)技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆化,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的比例混合,分别孵育0.5、1、2、4 h后用碘化丙啶(PI)标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0.5、1、2、4 h均能得到明显的杀伤效果,而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法(LDH)具有显著相关性(γ=0.997,P=0.003),而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统51Cr释放法、LDH法的一个补充,而且具有经济、快速和敏感的特点。     

微孔板法全自动血型仪性能确认及参数优化

目的:通过对微孔板法全自动血型仪性能确认进行探讨,对仪器的参数进行优化,提高血型检测的准确性.方法:采用试管法,分别配制弱A、弱B及弱D抗原,检测正定型和Rh(D)血型;筛选滴度为1:32的人源抗-A、抗-B,用生理盐水稀释配成相应的弱抗体,检测反定型.用单克隆Ig-M抗D进行稀释,模拟血型弱抗体标本.上述标本用微孔板...     

三种特异性抗体结合流式细胞术分选母血中胎儿细胞方法的评价

研究证实母血中的游离胎儿细胞可用于无创性单基因病产前诊断。胎儿细胞仍是检测胎儿染色体异常的惟一来源，虽然母血中胎儿有核红细胞（FNRBC）数量很少，但其特异性形态在正常人外周血中极罕见，并可携带完整的胎儿基因。因此，建立富集母血中胎儿细胞的方法则是无创性产前诊断的关键。本研究用3种FNRBC特异性抗体和流式细胞术分选胎儿细胞，并通过计算FNRBC准确率和特异性，以评价分选母血中胎儿细胞的最适宜方法。     

流式细胞仪三色法检测外周血Th细胞亚群培养方案的研究

目的改进流式细胞仪三色法检测外周血T h细胞亚群的刺激培养方案。方法外周全血经RPM I1640培养液和终浓度为25μg/L的PM A、1 m g/L的Ionom yc in、20μg/L的M onens in培养2 h后,用流式细胞仪分别检测CD 4、CD 69阳性细胞及CD 3阳性细胞表达IFN-γ和IL-4的比例。同时检测培养前CD 4阳性细胞及培养4 h后CD 3阳性细胞表达IFN-γ和IL-4的比例。结果淋巴细胞门中CD 4 细胞与CD 4-细胞能明显区分,培养前与培养2 h后CD 4 细胞比例差异无显著性(P>0.05);T淋巴细胞中90%以上表达CD 69;刺激培养2 h和4 h后CD 3 细胞表达IFN-γ和IL-4的比例差异无显著性(P>0.05)。结论该实验确定的培养方案能满足流式细胞术CD 4、IFNγ-、IL-4三色法检测T h细胞亚群的培养要求。