抗原负载的树突状细胞疫苗与肿瘤免疫治疗

<正> 免疫识别与免疫逃避是恶性肿瘤发病机理及防治中的关键矛盾,它决定着免疫反应的有无和强弱。在重建免疫识别的方法中,树突状细胞(Dendritic clells,DC)负载肿瘤相关抗原已经成为肿瘤治疗研究的热点。 树突状细胞的生物学特性 1 DC的来源及分类 Steinman和Cohn1973年从小鼠脾脏中分离出来一种新型细胞,根据其最初从淋巴器官分离,且具有树状突起而被     

树突状细胞与肿瘤的免疫治疗

尽管化学治疗和放射治疗的进步明显提高了肿瘤治疗的缓解率 ,延长了患者的生存期 ,但许多肿瘤尚无法治愈 ,因此有必要发展其它治疗方法 ,尤其是抗肿瘤的免疫疗法。树突状细胞 (DCs)在激发 T细胞免疫方面起重要作用 ,可能成为抗肿瘤免疫疗法理想的佐剂 ,值得研究和开发。1　肿瘤抗原和抗肿瘤免疫肿瘤细胞表面存在可被 T细胞识别的抗原 ,这是抗肿瘤细胞免疫的基础 ,也是开展抗肿瘤特异性免疫治疗的前提。这些被认为具肿瘤特异性的抗原 (TSA)包括 [1 ] :(1)变异的蛋白 ,如 K- ras,p5 3,erb B2 等 ;(2 )染色体易位产生的融合基因产物 ,如在…     

树突状细胞及其在妇科肿瘤免疫治疗中的研究进展

树突状细胞(dendritic cell,DC)是已知体内抗原递呈能力最强的细胞,比普通抗原呈递细胞强10～100余倍,它能在机体内外捕获抗原后,将信息传递给T、B淋巴细胞,从而引发一系列的特异性免疫应答反应.近年来,国际上对DC的研究进展很快.现将对DC的生物学特性、获得DC的方法、DC负载肿瘤抗原的途径、DC在妇科肿瘤免疫治疗中的研究进展进行综述.     

小鼠骨髓来源树突状细胞与NS1骨髓瘤细胞的融合瘤苗研制

为了提高肿瘤的免疫原性，有效地引发并增强突主体内抗肿瘤免疫应答，研制小鼠骨髓树太细胞与ＮＳ１骨髓瘤细胞的融合瘤苗。方法利用特异的ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０单克隆抗体和补体缓冲液及ＤＣｓ的半粘附性，直接从骨髓细胞中分离出高纯度的ＤＣｓ及其前休     

RNA转染树突状细胞诱导特异性抗前列腺癌免疫反应的实验研究

目的 研究前列腺癌细胞RNA转染树突状细胞(DCs)诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对前列腺癌细胞的特异性杀伤作用.方法 联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4 (IL-4) 诱导培养小鼠骨髓单个核细胞向DCs分化,脂质体法转染RNA,流式细胞术测定转染后树突状细胞共刺激分子表达的变化,MTT法测定DCs对T淋巴细胞的刺激能力.ELISA法检测IFN-γ的分泌水平.LDH法测定DCs诱导的CTL对前列腺癌细胞的杀伤效果.结果 用GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓来源的单核细胞,体外诱导培养6 d后获得大量DCs;RNA转染后,DCs表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子表达提高(P<0.05),刺激T淋巴细胞增殖能力明显提高(P<0.01);前列腺癌RNA转染的DCs诱导CTL对前列腺癌细胞和肝癌细胞的杀伤作用有明显差异(P<0.01).结论 前列腺癌细胞RNA转染DCs后诱导的CTL对前列腺癌有特异性杀伤作用,为进一步抗肿瘤疫苗的实验研究奠定了基础.     

mRNA疫苗冲击树突状细胞诱导抗肿瘤免疫反应的研究

目的：以消化道肿瘤组织mRNA冲击自体DC，诱导特异性免疫应答。方法：20例消化道肿瘤患者外周血分离PBMC(外周血单核细胞)，在IL-4、GM-CSF联合作用下诱导DC，从消化道肿瘤组织中提取mRNA并分别在有脂质体或无脂质体介导下冲击DC，与未经纯化的T细胞混合培养，诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞)。以CTL作为效应细胞，以胃癌细胞系803为靶细胞，LDH释放实验检测杀伤活性。结果：细胞表面标记检测显示诱导前后CD3、CD4、CD14显著下降，CD40、CD86、CD1a、CD83、HLA-DR显著升高，表明IL-4、GM-CSF、联合作用下有效诱导出DC，混合淋巴细胞增殖实验表明该DC具有抗原递呈，刺激淋巴细胞增殖的功能。经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应与未经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应比较，其杀伤率经统计学分析无显著性差异。而二者与单纯经IL-2诱导的未经纯化的T细胞产生的非特异性杀伤比较均有显著性差异。结论：以肿瘤细胞mRNA冲击DC诱导CTL可有效杀伤肿瘤细胞，有可能成为一独特的免疫治疗方法。     

抗原致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究

【目的】探讨肾癌细胞抗原致敏白介素-12（IL-12）基因修饰的树突状细胞（DC）体外诱导、激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫杀伤肾癌细胞的效能及相关免疫机制。【方法】采用重组逆转录病毒介导IL-12基因修饰人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC；超声细胞破碎法提取肾癌细胞粗提抗原（Ag）致敏经IL-12转染的DC；ELISA法检测各组DCs和各组CTLs上清中IL-12、IFN-γ因子的分泌水平；流式细胞仪（FACS）分析各组DCs表面CD83、CD86、HLA-DR的表达；MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖的能力及CTL免疫杀伤肾癌细胞的效能；统计学分析比较各组间的差异。【结果】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC高表达CD83和CD86分子分别为（65．9％±3．1％，92．8％±3．4％），分泌高水平IL-12（279．6±1．7）pg／mL及IFN-γ（892±31）pg／mL，刺激同源T淋巴细胞增殖明显，诱导激活的CTL上清中IFN-γ水平（1146±31）pg/mL显著高于对照组；CTL对肾癌细胞有强大的杀伤作用，显著高于各对照组。【结论】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC能有效地诱导CTL特异性抗肿瘤免疫应答。其机制可能与IL-12基因修饰和抗原致敏活化了DC抗原提呈第二信号，促进了DC高分泌IL-12因子，激活了T淋巴细胞致使CTL分泌IFN-γ的能力增强密切相关。     

动员人外周造血祖细胞定向诱导树突状细胞

目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞（ＤＣ）的生物学特性。为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用ＣＳ－３０００血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）,去除淋巴细胞和单核细胞,阴性选择得到外周造血祖细胞。加入ｒｈＧＭ－ＣＳＦ和ｒｈＩＬ－４培养１０￣１４ｄ成为树突状细胞,然后进行形态学检测、细胞表型和Ｔ细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细     

树突状细胞疫苗与肿瘤免疫

抗原脉冲的树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌ，ＤＣ）的潜能和新颖的肿瘤靶的鉴定，重新激起对恶性肿瘤治疗型疫苗的研究兴趣，已成为许多研究课题的热点。本文综述ＤＣ在肿瘤免疫治疗中的开发应用。１引言人体免疫系统具有抵御恶性细胞失控制性生长的能力，其核心是...     

狼疮鼠骨髓树突状细胞的分离培养和免疫学特性

目的对狼疮鼠骨髓树突状细胞进行分离、培养并分析其免疫学特性,为进一步研究和应用狼疮鼠骨髓来源树突状细胞(DC)奠定基础。方法分离、纯化6周龄雄性BXSB狼疮鼠骨髓单核细胞,以含10%胎牛血清、2ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/ml重组小鼠白细胞介素-4的RPMI-1640培养基培养,以脂多糖(LPS,1μg/ml)刺激24h体外诱导BXSB狼疮鼠骨髓细胞分化为DC,倒置显微镜动态观察细胞形态学变化,流式细胞仪分析细胞表面分子,混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞增殖能力。结果经体外诱导培养第2～8天可见大量细胞集落形成,培养的DC具有典型树突状形态,同时DC可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论体外诱导培养可稳定获得BXSB狼疮鼠骨髓来源DC。     

Identification and Ultrastructure Observation of Rat Bone Marrow Derived Dendritic Cells in Vitro

Objective To amplify large number of dendritic cells （DCs） from murine bone marrow and assay their morphological and immunological characteristics. Methods The rat marrow cells were collected and cultured for 3 days and the floating cells were removed. The combination of rat IL-4 and GM-CSF at 5ng/ml were added into the fresh mediums. On day 7-8, cells were supplemented with GM-CSF only （2.Sng/ml）. Dendritic cells at different maturation stages were analyzed for their phenotype, morphology, and functional properties. Results Early stage or immature DCs were round-shaped and showed no dendrites with intermediate levels of MHC- II and low levels of the costimulator molecules CD80 and CD86. Upon further culture, the cultured DCs had the typical morphological characterization of DCs, a strong upregulation of MHC-II, CD80, CD86 and CD11 b could be observed, and the ability of stimulating the proliferation of allogeneic T cells was enhanced. DCs （day 12 and lipopolysaccharide （LPS）- treated） were full maturation with the capacity of stimulating the proliferation of allogeneic strengthened and higher level of MHC- H, CDS0, CD86 and CD1 lb. Conclusion A method to generate large number of DCs from murine bone marrow is established. Dendritic cells at different maturation stages could be obtained, which contribute to further studying the functions of immune tolerance and activation of DCs.     

免疫治疗后荷瘤小鼠树突状细胞的功能评价

目的评价免疫治疗后荷瘤小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）体外激发T细胞增殖及分泌细胞因子的功能。方法采用腹腔注射激发型4-1BB抗体联合DC主动免疫治疗荷瘤小鼠。^3H-TdR掺入试验捡测免疫治疗后荷瘤小鼠骨髓来源DC体外激发T细胞增殖的能力。ELISA法检测DC刺激T细胞分泌IL-2、IFN-γ及IL-10的水平。结果荷瘤小鼠骨髓前体细胞产生的DC激发T细胞增殖及分泌IL-2、IFN-γ的能力下降，但经过免疫治疗后，这类DC激发T细胞增殖及分泌IL-2、IFN-γ的能力均得到改善，而且免疫治疗效果越好，改善就明显。结论荷瘤小鼠经免疫治疗后．其骨髓前体细胞来源DC的免疫功能得到改善。     

BALB/c小鼠骨髓来源高产量成熟树突状细胞的制备和初步鉴定

目的研究制备、鉴定小鼠骨髓来源的高产量树突状细胞（dendritic cells,DC）的方法,为制备DC及体外研究提供依据。方法取BALB/c小鼠骨髓细胞,经重组小鼠巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子（recombinant mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor,rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素4（recomtinant mouse interleukin 4,rmIL-4）诱导、脂多糖（lipopolysacchrides,LPS）刺激制备高纯度DC。利用光学显微镜、扫描电镜对所制备细胞做形态学观察;流式细胞术检测特定表型标记分子表达情况;酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、干扰素γ（interferon gamma,IFN-γ）的分泌量。从形态、表型标记、细胞因子分泌功能三方面对所制备细胞进行初步鉴定。结果所制备细胞具有典型的DC形态学特征,细胞表面高表达CD1a、CD11c、CD80和CD86,相对于普通DC细胞有大量的TNF-α和IFN-γ分泌。结论利用BALB/c小鼠骨髓细胞在细胞因子rmGM-CSF、rmIL-4诱导及LPS的刺激下成功制备出纯度较高的成熟DC。     

人慢性髓性白血病细胞系来源的树突状细胞免疫功能的体外研究

目的：探讨人慢性髓系白血病K-562来源的树突状细胞的免疫功能。方法：用细胞因子粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及IL4在体外诱导培养K-562细胞，获得树突状细胞(DC)检测其细胞表型，并观察其诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外抗肿瘤效应。用ELISA法测定DC培养及DC与外周血单个核细胞共培养上清液中IL-12及IFN-γ的量。结果：联合GM-CSF及IL-4可诱导K-562细胞分化为树突状细胞，K-562DC体外激活的CTL对K-562细胞具有特异性细胞毒活性；诱导DC培养上清及DC与外周血单个核细胞共培养上清测出一定量IL-12及IFN-β。结论：人慢性髓系白血病K-562来源的树突状细胞表达抗原提呈细胞表型，具有诱导CTL反应和分泌IL—12以及促进T细胞分泌IFN-γ的作用。     

骨髓间质干细胞在结直肠肿瘤微环境中的作用

骨髓间质干细胞(MSCs)是由中胚层发育而来的一类成体干细胞,存在于全身结缔组织和器官间质中,属于骨髓非造血干细胞,具有干细胞的一般特性,即自我更新以及多向分化能力。MSCs能够促进结直肠肿瘤的生长。在肿瘤条件下,骨髓中的MSCs随血运迁至肿瘤微环境,参与肿瘤的构建过程。MSCs促进肿瘤侵袭的机制是复杂的,包括MSCs转化为肿瘤相关纤维母细胞参与肿瘤间质的形成以及MSCs对微环境的调节作用。MSCs在结直肠癌靶向治疗策略中的应用前景是广阔的,通过不断的研究,将为MSCs在临床中的安全应用提供新的理论依据。     

自体树突状细胞用于慢性粒细胞白血病骨髓净化的初步研究

目的 考察慢性粒细胞白血病（CML）树突状细胞（DC）刺激自体骨髓T细胞,清除白血病细胞的作用。方法 采用3例CML病人（2例慢性期和1例急变期）外周血,分离单个核细胞（PBMNC）,经塑料贴壁后在含自体血浆、重组人白介素4（rhIL－4)、重组人粒－单集落刺激因子（rhGM－CSF）和重组人肿瘤坏死因子（rhTNFα）的RPMI－1640培养液。37℃CO2孵箱培养10天,或用免疫磁珠从PBMNC分离DC,在含自体血浆、rhGMCSF和rhTNFα的RPMI1640培养液培养3天,收获的细胞即DC加到含rhIL－2的Dexter骨髓长期培养体系,置37℃,5％CO2孵箱培养7天,观察前后骨髓细胞的免疫表型和P210阳性细胞比例。结果 从CML病人外周血获得的DC大多数表达P210。在含rhIL－2的Dexter体系加入DC能进一步增加体系中的T细胞数。在2例慢性期病人体系中的P210。在含rhIL－2的Dexter体系加入DC能进一步增加体系中的T细胞数。在2例慢性期病人体系中的P210阳性细胞减少,但在急性期病例,体系中P210细胞明显增加。结论 CML病人的DC表达P210,能刺激自体骨髓中T细胞增生,在慢性期病人,这些自体DC活化的骨髓T细胞有清除白血病细胞的作用。     

大鼠骨髓Thy-1.1+干细胞的分选与表型研究

目的采用免疫磁珠分选系统（MACS）分离大鼠骨髓Thy-1.1^＋干细胞群，研究Thy-1.1^＋干细胞与肝脏分化潜能相关的表型特征。方法收集大鼠胫骨、股骨骨髓细胞．Percoll密度梯度离心分离单个核细胞，Thy-1．1单抗标记，间接免疫磁珠系统分离纯化Thy-1.1^＋干细胞群，流式细胞仪检测其纯度，锥虫蓝拒染法检测细胞活力，计算回收率。同时流式检测分选前细胞及分选后Thy-1.1^＋干细胞的表型。结果经MACS分选后Thy-1.1^＋细胞比例由56．65％升至94．20％；分选后的细胞活力为99．62％，与分选前的99．79％无明显差异；MACS分选Thy-1.1^＋细胞的回收率为64．65％。Thy-1.1^＋细胞不表达CD34和c-kit；高表达β2微球蛋白（β2M）和CD45；部分表达Flt-3。分选前后CD34^＋和c—kit^＋比例无显著差异；β2M^＋的比例由93．38％下降至86．39％（P〈0．05）；CD45^＋和Fit-3^＋的比例则由67．18％、14．36％升高至分选后的81．12％和58．72％（均P〈0．01）。结论MACS方法能有效分选大鼠骨髓Thy-1.1^＋干细胞群，所得细胞纯度高，细胞活力保持好。大鼠Thy-1．1抗原与CD34、c—kit分子无明显相关性；而与CD45、Fit-3有一定的正相关性；与β2M呈一定的负相关性。     

CD34+HPC来源的树突状细胞体外扩增和功能研究

目的研究脐血CD34^ HPC体外扩增诱导产生功能性树突状细胞(DCs)的有效方案。方法Ficoll分离脐血获得单个核细胞。免疫磁珠阳性分选CD34^ HPC,^sH^-TdR检测DCs激发异体T细胞增殖的能力。MTT法检测特异性CTL的杀伤能力。结果SCF FL GM—CSF IL-4诱导生成的DCs激发T细胞增殖和特异性CTL的杀伤能力均高于其他组。结论SCF FL GM—CSF IL-4可有效扩增CD34^ HPC并诱导产生功能性DCs。     

荷瘤小鼠骨髓来源树突状细胞诱导的抗肿瘤作用

目的:探讨能否从荷瘤小鼠骨髓细胞诱导出功能正常、具有抗肿瘤作用的树突状细胞(DC),与正常小鼠骨髓来源的DC比较有无差异。方法:于体外用mGM-CSF和mIL-4分别从正常小鼠和CT26结肠腺瘤小鼠的骨髓细胞诱导DC,并用CT26肿瘤细胞抗原冲击致敏。用相差显微镜观察DC的形态学变化;流式细胞术检测CT26肿瘤细胞抗原致敏前后DC表面分子变化;3H-TdR掺入法检测肿瘤抗原致敏DC刺激T细胞增殖的能力;乳酸脱氢酶(LDH)4 h释放法检测肿瘤抗原致敏DC诱导同基因T细胞增殖、分化为细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤活性。结果:荷瘤小鼠骨髓来源DC与正常小鼠骨髓来源DC的Ia-Kd、H-2Kd、CD80、CD86I、CAM-1表达水平和它们刺激T细胞增殖的能力以及所诱导产生的CTL杀伤活性均无显著性差异。结论:荷瘤小鼠骨髓来源的DC与正常小鼠骨髓来源的DC具有相似的功能和抗肿瘤作用,提示可以从荷瘤机体的DC前体诱导出具有抗肿瘤作用的DC用于肿瘤的免疫治疗。     

大鼠OX-62+树突状细胞的体外诱导及生物学特性

目的 :从大鼠骨髓中有效地诱导、培养OX 6 2 + 树突状细胞 (dendriticcells,DC) ,观察其表型及功能特征。方法 :大鼠骨髓细胞培养 3h ,贴壁细胞加入含重组大鼠GM CSF和IL 4 ,继续培养 6～ 12d ,淘洗法去非粘附细胞中的Fc受体阳性细胞 ,流式细胞仪分析细胞表型及抗原摄取能力 ,混合淋巴细胞反应检测其刺激同种T细胞增殖能力 ,ELISA测定分泌IL 12水平。结果 :培养DC90 %以上表达OX 6 2。培养 6d的OX 6 2 + DCs具有不成熟表型 ,表达中等水平的MHCII抗原和低水平的CD80、CD86、ICAM 1;分泌少量IL 12 ;具有较强的摄取抗原能力 ,但刺激同种T细胞增殖能力极低。培养 12d的OX 6 2 + DC已经成熟 ,MHCII、CD8、CD86、ICAM 1表达明显增加 ;分泌IL 12增加 ;摄取抗原能力下降 ;刺激同种T细胞增殖能力明显增强。结论 :成功建立了体外大量扩增大鼠骨髓OX 6 2 + DC的新方法。