结直肠癌患者外周血生存素检测的临床意义

目的采用实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PGR）技术,检测结直肠癌患者外周血中生存素基因的表达,并分析其与转移之间的关系,探讨其成为无创性结直肠癌诊断、转移检测指标的可能性。方法取58例结直肠癌患者,46例非癌性肠道病变患者和29名健康成人的外周血,用实时定量RT-PCR的方法检测Survivin基因的表达,分析其与临床病理因素之间的关系。结果正常对照组外周血中未检测到Survivin mRNA表达转录本。癌前病变患者生存素表达检测率为6．25％,平均拷贝数为1．77±0．75;肠癌组患者生存素表达检测率为79．3％,平均拷贝数为5．62±1．32,两者差异有统计学意义（P〈0．01）。Survivin的表达在各性别、年龄、及不同分化组之间差异无统计学意义,而有、无淋巴结转移组之间以及Dukes分期C、D组与A、B组之间则发现Survivin的表达显著增高（P〈0．05）。生存分析表明,Survivin mRNA的高表达者4年生存率（62．9％）显著低于低表达者（86．6％）（P〈0．05）。回归分析发现,Dukes分期为影响肠癌预后有的独立因素。结论生存素基因在结肠癌患者中存在过表达,并可能与转移有关,采用实时定量RT—PGR检测外周血中生存素基因的表达,可能成为一种较理想的无创性结肠癌诊断、转移检测方法。     

结直肠癌患者外周血生存素检测的临床意义

目的采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PGR)技术,检测结直肠癌患者外周血中生存素基因的表达,并分析其与转移之间的关系,探讨其成为无创性结直肠癌诊断、转移检测指标的可能性。方法取58例结直肠癌患者,46例非癌性肠道病变患者和29名健康成人的外周血,用实时定量RT-PCR的方法检测Survivin基因的表达,分析其与临床病理因素之间的关系。结果正常对照组外周血中未检测到Survivin mRNA表达转录本。癌前病变患者生存素表达检测率为6.25%,平均拷贝数为1.77±0.75;肠癌组患者生存素表达检测率为79.3%,平均拷贝数为5.62±1.32,两者差异有统计学意义(P<0.01)。Survivin的表达在各性别、年龄、及不同分化组之间差异无统计学意义,而有、无淋巴结转移组之间以及Dukes分期C、D组与A、B组之间则发现Survivin的表达显著增高(P<0.05)。生存分析表明,Survivin mRNA的高表达者4年生存率(62.9%)显著低于低表达者(86.6%)(P<0.05)。回归分析发现,Dukes分期为影响肠癌预后有的独立因素。结论生存素基因在结肠癌患者中存在过表达,并可能与转移有关,采用实时定量RT-PGR检测外周血中生存素基因的表达,可能成为一种较理想的无创性结肠癌诊断、转移检测方法。     

PRAME基因在急性白血病中的表达及临床意义分析

本研究检测黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)基因在不同类型急性白血病(acute leukemia,AL)中的表达及其与病情发展的相互关系.用建立的检测PRAME基因的SYBR Green Ⅰ荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(RQ-RT-PCR)方法,对55例急性白血病患者(急性髓系白血病43例、急性淋巴细胞性白血病9例、其它类型的白血病3例)的骨髓样本进行PRAME基因表达情况的检测.同时选择7例非恶性血液疾病患者的骨髓样本和8例正常人外周血样本作为阴性对照,并用白血病细胞系K562作为阳性对照.结果表明35例急性白血病患者中检测出不同水平的PRAME基因表达,在其余20例急性白血病患者及15例对照样本中均未检测出PRAME基因,总阳性率64%,两组之间具有非常显著的差异(p＜0.005).在35例PRAME基因阳性表达的患者中,AML 28例,阳性检出率为65%,其中以M3、M4和M2亚型的阳性检出率较高,分别为90%、70%、67%;ALL 5例,阳性检出率为56%.在31例融合基因阳性患者中,PRAME基因阳性患者为23例,而在24例融合基因阴性患者中,PRAME基因阳性患者达到12例.比较各种临床因素与PRAME表达水平的相关性未发现明显相关.短期观察5例PRAME基因阳性表达的患者显示出经化疗达到完全缓解(CR)后,患者PRAME基因表达均转阴,下降水平为63-23921/106×GAPDH拷贝.长期观察1例M3患者显示化疗后PRAME基因水平逐渐下降并转阴,患者至今仍处于CR状态.结论PRAME基因在65%的急性白血病中呈阳性表达,其中以M3、M4和M2亚型最常见,在正常个体和非恶性血液病患者中不表达.不同白血病个体之间PRAME基因表达水平不同,随病情缓解其表达水平降低或转阴.PRAME基因可以成为微小残留病(MRD)检测的一种分子标志.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的 建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-PCR)方法,探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值.方法 应用SYBR GreenⅠ作为荧光染料,以GAPDH作为内对照,建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法,并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测.结果 56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为1.07±2.99,阳性表达率为66.1%(37/56),30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为0.13±0.07,阳性表达率为6.7%(2/30),30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性;结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化(P＞0.05),但在Dukes C+D期表达水平(1.73±2.15)及表达阳性率82.8%(24/29)均显著高于Dukes A+B期表达水平(0.39±0.87)及表达阳性率48.1%(13/27)(P＜0.01).结论 该FQ-PCR方法简便、特异、可靠;检测外周血CEA mRNA表达水平,对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性,可提高早期结直肠癌诊断符合率;在发生转移的Dukes C+D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A+B期,可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一,动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值.     

白血病患者WT1基因表达的研究

目的：探讨WT1基因与白血病发病的关系和临床意义。方法：采用逆转录－巢式聚合酶链反应（RT－巢式PCR）方法检测了K562和HL－60两个白血病细胞系、49例急性白血病（AL）患者、33例慢性髓系白血病（CML）患者和25例正常对照的WT1基因表达。结果：K562和HL－60两个白血病细胞系、29例初治或复发AL患者中有21例、20例完全缓解（CR）期AL中有1例、18例CML急变期中有15例、5例CML加速期中有1例、10例CML慢性期患者中有1例表达WT1基因。WT1基因表达见于所有AL亚型，其相对水平与急性白血病的CR率有相关性。≥1．0的患者CR率低及生存期短。在CML中WT1基因表达表现出明显的阶段性，与慢性粒细胞白血病临床阶段及病情进展有关。结论：WT1基因表达与白血病发生有关，WT1基因高表达的患者CR率低、无病生存期短，可作为判断急性白血病预后和监测微量残留病的一项指标，也可作为CML急变的一项诊断指标。     

定量RT-PCR检测PBC患者外周血中颗粒溶素的基因表达水平

目的建立检测人颗粒溶素(granulysin,GNLY)mRNA含量的实时荧光定量RT-PCR的方法,并测定PBC患者外周血单个核细胞(PBMC)中GNLY的基因表达水平,探讨GNLY基因表达水平与原发性胆汁性肝硬化(PBC,primarybiliary cirrhosis)发生发展的关系。方法基于TaqMan荧光探针技术,构建质粒pET28a-GNLY,作为定量模板,建立实时荧光定量RT-PCR方法。用此方法测定了60例PBC、60例乙型肝炎肝硬化及60例健康对照者外周血中GNLY mRNA的含量。结果PBC患者GNLY mRNA的表达范围为5.35×107-4.61×109拷贝/μg RNA;健康对照者为9.28×105-7.32×107拷贝/μg RNA。PBC组GNLY mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组(P<0.01)和疾病对照乙型肝炎肝硬化组(P<0.001)。结论成功建立了人GNLY基因表达含量的荧光定量检测方法,PBC患者GNLY mRNA的含量显著高于健康对照组,GNLY表达与PBC的发生发展存在一定的关联性。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（VQ-PCR）方法，探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值。方法应用SYBR Green J作为荧光染料，以GAPDH作为内对照，建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法，并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测。结果56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为1．07±2．99，阳性表达率为66．1％（37／56），30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为0．13±0．07，阳性表达率为6．7％（2／30），30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性；结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化（P〉0．05），但在Dukes C＋D期表达水平（1．73±2．15）及表达阳性率82．8％（24／29）均显著高于Dukes A＋B期表达水平（0．39±0．87）及表达阳性率48．1％（13／27）（P〈0．01）。结论该VQ-PCR方法简便、特异、可靠；检测外周血CEA mRNA表达水平，对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性，可提高早期结直肠癌诊断符合率；在发生转移的Dukes C＋D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A＋B期，可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一，动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值。     

结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达的研究

目的 检测结直肠癌患者外周血中的循环肿瘤细胞癌胚抗原（CEA）mRNA的表达,并分析其临床价值。方法 40例有明确临床肿瘤病灶存在的结肠癌患者,20例结肠息肉患者和40例健康志愿者,分别以逆转录PCR（RT-PCR）检测其外周血中CEA mRNA的表达。结果 40例结肠癌患者外周血中CEA mRNA表达的阳性率为45.0%（18/40）,而健康对照组均为阴性,两者比较有显著性差异（P〈0.001）;20例结肠息肉患者中CEA mRNA表达阳性率为10%（2/20）;CEA mRNA阳性表达率与肿瘤分期相关,而与肿瘤细胞分化程度并不相关。结论 结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达的检测对肿瘤的分期、决定治疗手段、判断疗效和预后有着重要的临床价值。     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中Brn-3a mRNA表达水平的研究

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞中Brn-3a mRNA 表达及其与疾病活动性的关系.方法 以β-actin为内参照,建立逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法,在Light Cycler Real time PCR检测仪上检测92例SLE患者(活动期46例,缓解期46例)、其他结缔组织病(CTD)患者30例(疾病对照组)、健康体检者30例(正常对照组)外周血单个核细胞(PBMCs)中Brn-3a mRNA 的表达水平和含量.以ΔCt=Ct(待测基因)-Ct(内参基因)来比较基因表达水平的高低.结果 活动期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平明显高于缓解期SLE患者(P<0.01);活动期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平明显高于正常对照组与疾病对照组(P<0.01);缓解期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平与正常人及疾病对照组差异无统计学显著性意义(P>0.05).结论 活动期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平显著高于正常人、疾病对照组和疾病缓解期,提示Brn-3a的表达与SLE的发生发展存在一定关联性,可能参与了SLE的发病过程并与疾病的活动性有关.     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中MBD4 mRNA表达水平的研究

目的探讨系统性红斑狼疮（SEE）患者外周血单个核细胞中MBD4 mRNA表达及其与疾病发病机制、疾病活动性的关系。方法以pactin为内参照,建立逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）方法,在LightCycler RealtimePCR检测仪上检测70例SLE患者（活动期32例、缓解期38例）、其他结缔组织病（CTD）患者30例（疾病对照组）、健康体检者30例（正常对照组）外周血单个核细胞（PBMCs）中MBD4 mRNA的表达水平和含量。以△Ct=Ct（待测基因）-Ct（内参基因）来比较基因表达水平的高低。结果SLE患者PBMC中MBD4mRNA表达水平高于正常对照组与疾病对照组（P〈0．05）,且疾病不同病期（活动期与缓解期）MBD4 mRNA表达水平差别有统计学意义（P〈0．01）。结论结果显示SLE患者PBMC中MBD4 mRNA表达水平显著高于正常人、疾病对照组,提示MBD4 的表达与SLE的发生发展存在一定关联性,可能参与了SEE的发病过程并与疾病的活动性有关。     

胶质瘤组织实时定量 PCR 检测中内参基因的选择

目的筛选胶质瘤组织中表达稳定性高的内参基因,为胶质瘤基因表达研究选取合适的内参基因提供实验基础。方法以相对正常脑组织及胶质瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期组织共25例为实验对象,利用Real-time PCR技术对15个候选内参基因进行筛选,通过geNorm软件对实验结果进行数据分析。结果在15个内参基因中,GUSB、ACTB、TBP、GAPDH、ATP5F1和PPIA 6个基因表达稳定,平均表达稳定度（ M值）均＜0.5,其中ATP5F1和PPIA为表达最稳定的两个内参基因,其M值为0.26。标准化因子V2/3＝0.102,小于取舍值0.15。结论在胶质瘤组织实时定量PCR分析中,ATP5F1和PPIA2个内参基因联合使用,可较好地共同校正基因表达结果。     

外周血中检测乳腺癌细胞株hMAM表达的方法探讨

目的建立逆转录结合荧光定量PCR(FQ-PCR)检测外周血乳腺癌细胞hMAM基因表达方法,了解其监测乳腺癌细胞微转移的应用价值。方法克隆目的片段,制备标准品并作测序验证。培养乳腺癌MDA-MB453、MCF7细胞株,制成血液标本模型,GAPDH基因为内对照,逆转录结合FQ-PCR检测乳腺癌细胞株血标本模型和10例乳腺癌患者外周血的hMAM表达。结果电泳和测序证实,克隆产物系预期的目的片段。FQ-PCR标准曲线的相关系数为-1.0;用103copies/μl标准品重复检测5次,x±s:718.9±120.5,CV16.7%;MDA-MB453细胞的血标本作灵敏度试验,相当于104个血细胞中含1个乳腺癌细胞可检出阳性。未检测到MCF7细胞的hMAM表达。10例乳腺癌患者,淋巴结转移的5例中,3例hMAM表达阳性、2例阴性;无淋巴结转移的5例中,1例hMAM表达阳性、4例阴性。结论本方法可有效监测外周血中微转移的乳腺癌细胞,发现不同乳腺癌细胞系hMAM表达程度差异大。     

Selection of stable reference genes for gene expression analysis in sweet potato (Ipomoea batatas L.)

Gene expression analysis is one of the most common and important studies in biology and biomedicine. No matter for traditional blotting analysis or currently commonly used PCR strategy, all need a stable reference gene for normalizing the gene expression. To screen and select housekeeping genes as the most stable reference genes, quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was employed to analyze the expression of sixteen commonly used reference genes (IbelF, Ibα-tubulin, IbHIS, IbCOX, IbGAPDH, IbH2B1, IbARF, IbCYC, Ibβ-tubulin, IbACT, IbEFl-a, IbG14, IbPLD, IbRPL2, IbUBQ, IbUBI) in five different tissues under two different temperature stresses in sweet potato. Data analysis by the Delta CT, geNorm, NormFinder, and BestKeeper programs revealed that IbelF is the most stable gene and IbUBI is the least stable gene as reference. Our study also shows that combination of two or more genes as reference is a better choice, rendering more substantiated expression data for comparison. This study provides evidence for selecting reference genes in sweet potato gene expression analysis.     

Selection of reference genes for expression analysis in the potato psyllid,Bactericera cockerelli

The selection of reference genes is a crucial step for quantitative real‐time PCR analyses and increasingly the use of more than one reference gene for accurate and reliable normalization is being recommended. In this study, a set of six genes was selected and their stability was assessed in different life stages and female organs of Bactericera cockerelli harbouring or not the bacterial pathogen ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ (Lso) haplotype B. The stability of each gene was determined using the Best Keeper , Norm Finder and Ge Norm programs. These analyses identified elongation factor‐1a, ribosomal protein subunit L5 and ribosomal protein subunit 18 as the most stable genes to analyse gene expression during the insect life stages irrespective of Lso presence; Lso haplotype B only affected their respective ranking. By contrast, a common set of normalizers could not be found amongst the different female organs tested (bacteriomes, alimentary canals and reproductive organs).     

CK20 mRNA和hTERT mRNA在大肠癌围手术期血行微转移中的转录特征

目的 探讨细胞角蛋白20(CK20)mRNA和人端粒酶催化亚单位(hTERT)mRNA作为大肠癌围手术期血行微转移标志物的价值.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例大肠癌患者术前、术中及术后外周血CK20 mRNA和hTERTmRNA的表达,并对不同分化程度、不同Dukes分期的大肠癌患者CK20 mRNA和hTERT mRNA的表达进行比较.结果 40例大肠癌患者外周血CK20 mRNA和hTERT mRNA的表达率,术前分别为47.5%(19/40)和45.0%(18/40),术中为70.0%(28/40)和70.0%(28/40),术后为10.0%(4/40)和32.5%(13/40).除术后hTERT mRNA阳性率与术前无显著差异(P＞0.05)外,术中外周血CK20 mRNA、hTERT mRNA阳性率和表达强度(与内参照β-actin比值)均显著高于术前(P＜0.01,P＜0.05),术后明显低于术前和术中(P＜0.01).hTERT mRNA在低分化肿瘤的表达明显高于高、中分化组(P＜0.05),而CK20mRNA在低分化肿瘤的表达强度低于高、中分化组(P＜0.01).大肠癌围手术期Dukes B期和C D期之间CK20 mRNA和hTERT mRNA均无显著性差异(P＞0.05).结论 大肠癌患者围手术期血行微转移的发生几率较高,病理分化程度低者更易发生,但与Dukes分期无明显相关,CK20 mRNA和hTERT mRNA联合检测对大肠癌血液微转移具有较高的敏感性和特异性,是判断围手术期血行微转移的良好标志物.     

艾滋病毒感染者外周血T细胞TCR β链CDR3谱系漂移的监测

目的利用"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测HIV感染者外周血T细胞受体(TCR)β链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法提取6例HIV感染者、4名正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell-PBMC)中的总核糖核酸(RNA),反转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA),设计人26个TRBV基因家族上、下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增26个TRBV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果正常人外周血T细胞TCRβ链26个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"显示多克隆增生的高斯分布,呈现溶点不同的CDR3多态性,6例HIV感染者的外周血TCRβ链CDR3谱系的26个家族CDR3表达频率不一致,患者各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCRβ链CDR3谱系漂移的方法稳定简便,可以用来监测正常人和HIV感染者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移。     

前列腺癌组织中前列腺特异性膜抗原基因表达的临床意义

目的检测前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因在前列腺癌组织中的表达,并探讨其意义。方法利用半定量(RT-PCR)法检测52例前列腺癌组织及35例前列腺增生组织中PSMA的表达。结果 (1)PSMA在前列腺癌及前列腺增生组织中的阳性表达率分别为84.6%(44/52)及68.6%(24/35),虽然前列腺癌组织中PSMA表达阳性率高于前列腺增生组织,但两者差异无统计学意义(P>0.05)。PSMA mRNA半定量结果在两组间存在差异,癌组织中PSMA的表达量明显高于增生组织中的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)PSMA基因表达量与肿瘤的分化程度有关,分化程度越低,表达量越高,高分化前列腺癌与低分化前列腺癌间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PSMA在前列腺癌中的表达与肿瘤的分化程度有关,且高于前列腺增生组织,提示PSMA可作为判断预后及分化程度的指标。     

大肠恶性肿瘤外周血微转移的检测及其临床意义

目的　研究大肠癌患者外周血CK19mRNA的表达 ,并探讨其临床意义。方法　采用RT PCR方法检测 4 1例大肠癌患者和 8例胃肠道非恶性病变手术患者的外周血CK19mRNA的表达。结果　 8例胃肠道非恶性病变手术患者、8例健康志愿者的外周血CK19mRNA无阳性表达 ;4 1例大肠癌患者外周血CK19mRNA阳性表达率分别 :单次外周血采样CK19mRNA阳性表达率为 4 1 5 % ;两次采样总阳性率大肠癌患者为 6 5 9% ,外周血重复采样阳性率高于单次采样 (P <0 0 1)。DukeC、D期患者CK19mRNA阳性表达率高于DukeB期 (P <0 0 5 )。结论　大肠癌患者外周血CK 19mRNA是一种敏感、特异的检测方法 ,可以作为检测大肠癌微转移的指标并指导其治疗和预后。     

Hugl-1基因在人大肠癌组织中的表达及其对LS174细胞增殖和迁移能力的影响

目的研究Hugl-1基因在人大肠癌组织中的表达及其与临床病理的相关性,探讨外源Hugl-1基因转染对大肠癌LS174细胞增殖和迁移能力的影响。方法采用RT-PCR及Western-blot法检测人大肠癌组织及相应癌旁正常组织中mRNA和蛋白质的表达水平。以成功构建的分别能稳定表达外源pcDNA3.0-Hugl-1、空载体pcDNA3.0的大肠癌细胞系和未转染的LS174细胞为研究对象,通过软琼脂集落形成、划痕修复、细胞黏附和Transwell细胞侵袭等一系列细胞学功能实验,观察稳定转染细胞株Hugl-1的表达差异对肿瘤细胞增殖、黏附、运动和侵袭的影响。结果 Hugl-1基因在大肠癌组织中表达下调或缺失,表达水平低于癌旁正常组织。Hugl-1表达降低与肿瘤分期及淋巴结转移相关。RT-PCR、Western-blot显示重组体pcDNA3.0-Hugl-1转染细胞株中目的基因Hugl-1在mRNA和蛋白质水平上表达均较空载体转染细胞株和未转染细胞株增强（P〈0.05）;对转染前后的细胞观察表明,重组体转染组细胞增殖能力无明显改变,但是其迁移运动和侵袭能力降低,细胞黏附能力增加。结论研究表明,Hugl-1表达下调与大肠癌的发生发展有关,Hugl-1基因表达下调可能使肿瘤细胞的结构稳定性丧失,促使肿瘤细胞扩散。