大鼠肝癌高表达基因cDNA序列的克隆

目的克隆出大鼠肝癌高表达EST片段相关基因的cDNA完整表达序列,为进一步揭示其生物学功能奠定基础。方法通过基因芯片检测出DEN诱发的大鼠肝癌高表达的EST片段;其中部分高表达的EST片段,采用电子克隆与PCR相结合的方法,克隆出其cDNA完整表达序列。结果与正常大鼠肝组织比较,肝癌组织中明显高表达的EST片段有34个。采用EST电子克隆技术与PCR技术相结合的方法,成功克隆出4个EST片段的cDNA序列,经进一步BLAST对比分析,证明G15、G20、G36、G40等4个基因为新基因,并进行GenBank登录,登录号分别为DQ480746、DQ480747、DQ480744、DQ912022。结论利用大鼠基因芯片高通量地筛选出DEN诱发的肝癌组织高表达的有关基因,并在充分利用生物信息学资源的基础上,成功克隆出4个新基因的cDNA序列,为今后进一步深入观察这些基因的功能及其在肝癌发生、发展过程中的作用机制打下良好的研究基础。     

细胞色素超家族基因在DEN诱发大鼠肝癌过程中的表达特征

[目的]探讨细胞色素基因在肝癌发生过程中表达的特征。[方法]对正常大鼠肝组织以及DEN诱癌后大鼠第4周、8周、16周、20周（肝癌形成）含肝癌组织Affymetrix Rat 230A GeneChip芯片所检测数据标准化处理后，进行差异分析。[结果]从芯片中共筛选出与细胞色素有关的基因81个，其中已知的细胞色素超家族成员58个，包括40个细胞色素P450（Cyp）基因家族成员和11个细胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase，Cox）基因家族成员，以及7个其它成员；其次，在整个DEN诱癌过程中，表达有显著性变化的细胞色素基因有19个，包括9个明显上调的基因和10个明显下调的基因。[结论]细胞色素、尤其是细胞色素P450家族成员可能在大鼠肝癌发生过程发挥重要作用，值得注意的是Cypla1、Cypla2、Cyp3a3、Cyp4bl和Cyp27bl等人类癌症相关基因．以及Cyp26al、Cyba和CoxVa等人类共有基因．变化显著．可能有助于对人类肝癌发生过程的研究及肝癌的诊治。     

5-脂氧合酶抑制剂齐留通抑制二乙基亚硝胺诱导大鼠肝细胞癌形成的实验研究

目的：研究5-脂氧合酶（5-lipoxygenase,5-LOX）在原发性肝癌中的表达及其抑制剂齐留通对肝癌的影响和机制。方法：实验大鼠随机分为正常对照组（n=5）、模型组（n=8）及齐留通组（n=8）。HE染色观察肝癌病理图片,免疫组织化学染色检测5-LOX蛋白,M2型丙酮酸激酶（M2-PK）与细胞角蛋白19（CK19）的表达,RT-PCR检测肝组织5-LOX的表达,TUNEL检测肝癌细胞凋亡。结果：二乙基亚硝胺（DEN）可以诱导大鼠肝癌模型形成。模型组大鼠肝脏可见中等强度5-LOX的蛋白表达,较对照组明显增强（P〈0.01）,而齐留通组5-LOX的表达较模型组明显降低（P〈0.01）。免疫组织化学检测M2-PK在对照组阴性表达,模型组大鼠中等强度表达（P〈0.01）,齐留通组弱表达,较模型组差异显著（P〈0.05）。CK19在对照组大鼠中阴性表达,模型组大鼠较强表达（P〈0.01）,齐留通组中等表达,较模型组差异显著（P〈0.01）。对照组可检测出5-脂氧合酶mRNA的表达,但明显低于模型组,差异显著（P〈0.01）;齐留通组的表达介于二者之间,与模型组相比,有统计学意义（P〈0.01）。TUNEL法检测对照组几乎未见凋亡细胞,模型组大鼠肝脏仅见少数肝癌细胞阳性表达（30%-50%）,而齐留通治疗组大鼠肝脏见大量肝癌细胞阳性表达（70%-80%）,与模型组相比有统计学意义（P〈0.01）。结论：DEN诱发的大鼠原发性肝癌存在5-脂氧合酶表达,5-脂氧合酶抑制剂可防治DEN诱发的大鼠原发性肝癌的形成,其机制与诱导肝癌细胞凋亡相关。     

苦参碱对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的预防作用

目的：研究不同剂量苦参碱（MT）对二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌的预防阻断作用。方法：采用0．01％的DEN诱发大鼠肝癌90天,同时分别用MT注射液30,15,3mg/kg腹腔注射和3mg/kg灌胃,停止诱癌及给药处理30天后,处死大鼠,观察大鼠肝脏的病理改变,肝表面癌结节数,肝／体重比和血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）,γ-谷氨酰转肽酶（γ－GT）,碱性磷酸酶（ALP）的变化。结果：3mg/kg MT腹腔注射组和灌胃组的体重明显高于模型组,肝表面癌结节数,肝／体重比和血清ALT,γ－GT明显低于模型组和它MT腹腔注射组（P＜0．05）,但腹腔注射的三组中ALP较模型组有不同程度升高,灌胃组则有所下降,结论：MT用于预防阻断DEN诱发大鼠肝癌时,不论剂量大小或给药途径如何,均不能完全阻断DEN诱发大鼠肝癌的发生,但小剂量（3mg/kg)的MT长期口服应用,能保护肝细胞免受损伤,延缓DEN诱发大鼠肝癌的发展。     

组胺H2受体mRNA在实验性肝癌中的表达及意义

目的 :探讨大鼠实验性肝癌中组胺H2 受体基因的mRNA表达情况。方法 :采用二甲基氨基偶氮苯 (DAB)诱发大鼠肝癌模型 ,以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)半定量法研究肝癌组织、远癌肝组织及正常肝组织中组胺H2 受体基因的mRNA表达。结果 :组胺H2 受体mRNA在肝癌组织中的表达明显低于远癌肝组织 (P <0 0 1)和正常肝组织 (P <0 0 1)。结论 :肝癌中组胺H2受体基因的转录减少可能与肝癌的发生发展有关     

APE1在DEN诱导大鼠肝细胞癌形成过程中作用的研究

目的：研究DNA损伤修复关键酶脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶（apurinic／apyfimidinic endonuclease 1 Aepl）在大鼠肝细胞癌形成过程的动态变化，初步探讨Apel与肝细胞癌发生、发展的关系。方法：采用改良法建立二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN）诱发大鼠原发性肝癌模型应用免疫组化sP法检测Apel和PCNA在不同诱癌阶段的表达情况。结果：正常大鼠肝脏组织中Apel呈胞核高表达，在不同诱癌阶段的肝脏组织中Apel表达特征有所改变，呈核浆共同表达或、单纯胞浆表达；随着诱癌时间的延长FCNA表达逐渐增加。结论：在DEN诱导大鼠肝细胞癌模型的过程的同时Apel具有表达由核内转向浆内的特征，提示核内DNA损伤修复减少导致基因突变增加，可能是肝细胞癌发生、发展的重要机制之一。     

PRX2和AKRIBl0在二阶段化学诱发小鼠肝癌形成过程中的表达及意义

目的：探讨PRX2和AKR1B10在二阶段化学诱发小鼠肝癌形成过程中的表达及意义。方法90只C57BL/6J雄性小鼠随机分为实验组（60只）和正常对照组（30只）,用DEN/CCl4/乙醇诱发小鼠肝癌。于第4周、第8周、第12周、第16周和第20周5个时点处死小鼠,观察其肝脏病理组织的改变,应用实时荧光定量PCR法、免疫组化SP法分别检测小鼠肝组织PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA及蛋白质的表达水平。结果①实验诱发小鼠肝癌过程中的第4周见肝细胞肿胀,炎细胞浸润,肝脏呈炎症病变;第8周见肝组织炎症病变加重,出现纤维组织增生及肝细胞再生;第12周见肝组织呈不典型增生;第16周有典型假小叶形成;第20周可见典型的小鼠肝癌病理改变。②化学诱癌的第4周至第20周实验组小鼠肝组织PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA和蛋白质的表达均高于正常对照组（P〈0.05）,且两者的表达水平随着时间的延长,均呈逐步升高的趋势;至第20周肝癌形成时,实验组两者的表达均显著高于癌前各时间点（P〈0.05）。③在二阶段化学诱发小鼠肝癌形成过程中,PRX2 mRNA和AKR1B10 mRNA的表达水平呈正相关（r=0.674,P=0.05）。结论在二阶段化学诱发小鼠肝癌形成过程中PRX2和AKR1B10的高表达是化学诱发小鼠肝癌形成的早期事件,PRX2和AKR1B10可能在化学诱发小鼠肝癌的发生、发展和促进过程中起重要作用。     

WFDC-1基因在原发性肝癌组织中的表达及其临床意义

目的检测WFDC-1基因在肝癌和正常肝组织的表达差异并探讨其临床意义。方法采用荧光实时定量PCR（FQ-RT-PCR）法检测30例肝癌组织及相应远端正常肝组织WFDC-1mRNA的表达,分析其表达与肝癌患者临床特征的相关性。结果 WFDC-1mRNA在肝癌组织中的表达水平（0.050±0.026）明显低于远端正常肝组织（0.113±0.040）,两者差别有统计学意义（P〈0.05）。WFDC-1mRNA在肝癌中的表达水平与HBsAg水平有关,合并HBsAg阳性的肝细胞癌（HCC）中的表达低于HBsAg阴性HCC组（P〈0.05）,而与年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、AFP及有无肝硬化无关（P〉0.05）。结论肝癌组织中WFDC-1基因表达水平明显低于相应正常肝组织,提示WFDC-1表达与降低肿瘤发生有一定的相关性,为潜在的抑癌基因。     

铜锌-超氧化物歧化酶在肝癌组织中的异常表达及意义

目的：观察铜锌-超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）mRNA和蛋白在黄曲霉毒素B1（AFB1）诱发树的肝细胞癌（HCC）形成过程中的表达变化，并对其在人肝癌组织中的表达情况进行验证和对比，探讨CuZn-SOD在肝癌形成中的作用。方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）和免疫组化方法检测35例AFB1诱发的树鼩肝癌、癌旁以及这些动物癌发生前自身的活检肝组织和相应对照组织中CuZn-SOD基因在mRNA水平和蛋白水平的表达情况，并且在35例人肝癌和癌旁组织进行验证。结果：CuZn-SOD mRNA和蛋白在树鼩肝癌组织的表达水平不仅明显低于癌旁及癌前组织，也明显低于实验组虽经AFB。处理但最终未发生肝癌的动物以及正常对照动物的同期活检肝组织。人肝癌组织的CuZn-SOD mRNA和蛋白表达情况与树鼩相似，癌组织的阳性表达率和表达水平均明显低于癌旁组织，并且分化较低的肝癌组织的蛋白表达水平下调更显著。结论：CuZn-SOD可能是肝癌发生的相关基因之一，它在mRNA水平和蛋白水平的表达下降与肝癌的发生发展可能互为因果。     

EGFR-STAT3信号通路在大鼠实验性肝癌发生中的作用

背景与目的：许多研究表明，EGFR-STAT3信号传导通路参与肿瘤的形成。本璇验目的在于探讨EG-FR-STAT3信号通路在大鼠实验性肝癌发生中的作用。方法：3’-甲基4-二甲基偶氮苯（3’Me-DAB）诱发大鼠肝癌，免疫组化法检测EGFR、TGFa、STAT3、p-STAT3在诱癌各阶段的表达，分别用蛋白印记方法检测TGFa、STAT3、P-STAT3，原位杂交法检测STAT3在肝癌及正常肝组织中的表达，进行图像定量分析。结果：EGFR、TGFα、STA33在肝细胞坏死和修复期表达有升高趋势。EGFR、TGFα、STAT3、p-STAT3在肝癌中100％表达，与正常组织比较，肝癌中EGFR、TGF仪表达明显升高（P〈0．05）。肝癌中STAT3在mRNA、蛋白水平的表达都较正常肝组织明显升高（P〈0．05）。且其活化形式（p-STAT3）也显苦增高（P〈0．05）。肝癌中TGFα、p-STAT3表达具有相关性。结论：EG-FR-STA33信号转导通路参与大鼠肝癌的发生，高表达的TGFα可激活EGFR信号转导通路形成自分泌环，并导致STA33的持续活化。     

Characteristic gene expression profiles in the progression from liver cirrhosis to carcinoma induced by diethylnitrosamine in a rat model

Background

Liver cancr is a heterogeneous disease in terms of etiology, biologic and clinical behavior. Very little is known about how many genes concur at the molecular level of tumor development, progression and aggressiveness. To explore the key genes involved in the development of liver cancer, we established a rat model induced by diethylnitrosamine to investigate the gene expression profiles of liver tissues during the transition to cirrhosis and carcinoma.

Methods

A rat model of liver cancer induced by diethylnitrosamine was established. The cirrhotic tissue, the dysplasia nodules, the early cancerous nodules and the cancerous nodules from the rats with lung metastasis were chosen to compare with liver tissue of normal rats to investigate the differential expression genes between them. Affymetrix GeneChip Rat 230 2.0 arrays were used throughout. The real-time quantity PCR was used to verify the expression of some differential expression genes in tissues.

Results

The pathological changes that occurred in the livers of diethylnitrosamine-treated rats included non-specific injury, fibrosis and cirrhosis, dysplastic nodules, early cancerous nodules and metastasis. There are 349 upregulated and 345 downregulated genes sharing among the above chosen tissues when compared with liver tissue of normal rats. The deregulated genes play various roles in diverse processes such as metabolism, transport, cell proliferation, apoptosis, cell adhesion, angiogenesis and so on. Among which, 41 upregulated and 27 downregulated genes are associated with inflammatory response, immune response and oxidative stress. Twenty-four genes associated with glutathione metabolism majorly participating oxidative stress were deregulated in the development of liver cancer. There were 19 members belong to CYP450 family downregulated, except CYP2C40 upregulated.

Conclusion

In this study, we provide the global gene expression profiles during the development and progression of liver cancer in rats. The data obtained from the gene expression profiles will allow us to acquire insights into the molecular mechanisms of hepatocarcinogenesis and identify specific genes (or gene products) that can be used for early molecular diagnosis, risk analysis, prognosis prediction, and development of new therapies.     

D-双功能蛋白通过STAT3促进大鼠肝细胞肝癌的形成机制

目的 探讨大鼠肝癌组织中D-双功能蛋白（DBP）的表达及其与信号转导子和转录激活子3（STAT3）活化的相关性。方法 腹腔注射二乙基亚硝胺（DEN）诱导大鼠肝细胞肝癌（HCC）模型。HE染色和血清生化指标检测HCC大鼠肝脏病理恶化程度,蛋白免疫印迹、免疫组织化学和qRTPCR检测DBP、PCNA、cyclinD1、p-STAT3、p-Akt、p-MEK和p-ERK的表达。计量资料两组间比较采用t检验,检测指标相关性检验采用Pearson相关分析。结果 DEN诱导HCC大鼠肝脏恶化严重,HCC大鼠肝脏组织中DBP的表达高于正常大鼠肝脏;HCC组PCNA和cyclin D1 mRNA的表达水平显著高于正常组,而且DBP与PCNA和cyclin D1的表达量呈正相关;在HepG2细胞中DBP过表达和敲低能相应增加和减少细胞的数量,并且引起PCNA和cyclin D1蛋白表达的增加和减少;HCC组大鼠p-STAT3表达显著增加,并且与DBP的表达水平呈正相关,同时p-Akt、p-MEK以及p-ERK的蛋白水平较正常组也显著增强。结论 高表达的DBP在大鼠肝癌的发展进程中发挥了促进作用。     

Identification of differentially expressed genes in hepatocellular carcinoma and metastatic liver tumors by oligonucleotide expression profiling

BACKGROUND: The characterization of differentially expressed genes between cancerous and normal tissues is an important step in the understanding of tumorigenesis. Global gene expression profiling with microarrays has now offered a powerful tool to measure the changes of thousands of genes in any carcinoma tissues in an effort to identify these key disease-related genes. To compare the gene expression of a primary liver carcinoma, metastatic carcinoma to the liver, and normal liver, the authors analyzed tissue from six primary hepatocellular carcinomas (HCCs), five colorectal adenocarcinoma metastases to the liver, and eight normal livers. METHODS: Samples were processed from total RNA to fragmented cRNA and hybridized onto Affymetrix GeneChip(R) expression arrays. Analyses were performed to determine the consensus pattern of gene expression for primary liver carcinoma, metastatic liver carcinoma, and normal liver tissue and their changes in expression level. RESULTS: In hepatocellular carcinoma, 842 genes were overexpressed, and 393 genes were underexpressed in comparison with genes of normal liver tissue. Of note, 7 of the 20 most increased identified known genes previously have been associated with liver carcinoma or other types of cancers. The 13 additional identified genes until now have not previously shown strong association with cancers. Furthermore, the authors identified 42 genes and 24 expressed sequence tags that are expressed at a significant level in both HCC and metastastic tumors, presenting a list of marker genes indicative of cancerous liver tissue. CONCLUSIONS: In this study, genes that can be involved in the production of and maintenance of hepatic carcinomas were identified. These data offer new insight into genes that are potentially important in the pathogenesis of liver carcinoma, as well as additional targets for new strategies for cancer therapy and treatment.     

Neuroserpin (PI-12) is upregulated in high-grade prostate cancer and is associated with survival

We carried out Genechip analysis using prostate cancer and non-malignant tissue to identify specific genes related to prostate cancer. We focused on neuroserpin (PI-12), which has been identified as one of the genes with high expression in prostate cancer. We analyzed the relationship between its expression pattern and clinical characteristics. Prostate cancer and normal prostate tissue were analyzed by Affymetrix GeneChip technology. We carried out real-time quantitative PCR on a total of 102 specimens: 45 of normal prostate, 45 of previously untreated prostate cancer (constituting 45 pairs of samples obtained at radical prostatectomy, with each pair dissected from the same prostate specimen) and 12 of recurrent hormone refractory prostate cancer (HRPC). Results showed that the neuroserpin gene was more highly expressed in prostate cancer than in normal prostate tissue. Neuroserpin expression in untreated prostate cancer was significantly higher than that in normal prostate. In HRPC it was significantly higher than that in untreated prostate cancer and normal prostate. In untreated prostate cancer, neuroserpin expression was significantly higher in high grade tumors such as poorly differentiated adenocarcinoma than in lower grade tumors such as well or moderately differentiated adenocarcinoma. Higher neuroserpin expression was associated with shorter recurrence-free survival after radical prostatectomy, shorter recurrence-free survival in HRPC patients and shorter overall survival in HRPC patients. The neuroserpin gene may be associated with the development, progression and aggressiveness of prostate cancer. Our present data suggests that higher neuroserpin expression may predict an unfavorable outcome after radical prostatectomy or hormone therapy.     

大鼠大肠癌模型建立及其基因表达谱初步研究

目的建立实验性大肠癌动物模型,利用基因芯片技术筛选大肠癌发病进程中差异表达基因,探讨大肠癌发生发展过程中可能的信号通路。方法利用二甲肼诱发大鼠大肠癌,收集4例大鼠中的息肉、腺瘤、癌组织及对应正常组织,提取总RNA,应用大鼠全基因组表达谱芯片检测疾病及对应正常组织的基因表达情况,筛选不同组织之间的差异表达基因,以实时荧光定量PCR技术对基因芯片检测结果进行验证,最后利用生物信息技术对差异表达基因进行通路及功能归类。结果获得成功建模大鼠4只。基因芯片结果显示,息肉组织、腺瘤组织及大肠癌组织与正常大肠黏膜组织相比,差异表达基因分别为493、3 472及3 060个。大肠癌序列相关基因在3种病理组织中的表达均发生不同程度的变化。通路分析结果显示,在息肉组织中,细胞因子-细胞因子受体相互作用通路相关基因变化最为显著,P=5.62E-08;在腺瘤组织中,嘌呤代谢通路相关基因变化最为显著,P=7.73E-30;而在大肠癌组织中,核糖体通路相关基因变化最为显著,P=1.40E-27。功能分析结果显示,生物过程功能类归属基因表达变化最多,分子功能类基因其次,而细胞组分类基因最少。RT-PCR验证结果与芯片结果完全相符。结论在成功建立大肠癌动物模型的基础上,通过芯片技术筛选和鉴定了大肠癌疾病发生及发展相关基因,建立了肠息肉、腺瘤及大肠癌组织基因表达谱,为探寻大肠癌早期发病机制及基因靶向治疗提供了分子依据。     

一个肝癌相关基因的生物信息学及其基因表达分析

目的 :筛选并克隆肝癌相关基因 ,探讨肝癌发病机制。方法 :在国家人类基因组南方研究中心肝癌基因表达谱及其功能研究的工作基础上 ,发现 1个未知功能基因 (暂命名LLC基因 ) ,其DNA拷贝数在肝癌基因组中呈降低的趋势。本研究利用生物信息学和RT PCR的方法 ,对其进行功能预测并在转录组水平检测该基因的表达。结果 :LLC基因定位于染色体8p2 3 3区段 ,全长为 670 6bp ,含有 2个外显子 ,1个内含子 ,其开放阅读框长为 1871bp ,编码 1个含有 62 3个氨基酸的蛋白。该基因在 67%( 16/2 4)肝癌组织中呈现下调趋势。同时其在人体内多种组织均有表达。结论 :LLC基因有可能是一个新的肝癌相关抑癌基因     

实时荧光定量PCR检测大鼠肝癌组织中MEF2及ⅡHDACs的表达

[目的]检测大鼠肝脏组织中MEF2A/2C mRNA及HDAC4/10 mRNA表达水平,并分析MEF2A/2C mRNA与HDAC4/10 mRNA表达的相关性。[方法]采用0.01%二乙基亚硝胺饲喂Wistar大鼠,建立大鼠肝癌模型,提取大鼠肝组织中的总RNA并逆转录为cDNA,应用Real-timePCR检测MEF2A/2C mRNA与HDAC4/10 mRNA表达量。[结果]18周后,大鼠致癌率为100%,总死亡率为35%,MEF2A/2C mRNA在第4、8周表达量显著增加（P〈0.01）,HDAC4/10mR-NA在第4周大量表达（P〈0.01）,随后都逐渐趋于正常水平。MEF2A/2C mRNA与HDAC4/10 mRNA表达水平在时间上不存在相关性。[结论]大鼠肝癌发生过程中,MEF2与肝癌组蛋白乙酰化有关,但MEF2A/2C mRNA与HDAC4/10 mRNA表达量在时间上无明显的关联性。