胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的：比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性，为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法：实验于2004-11／2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养，每3天换液1／2，每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中，补足神经干细胞分化培养基，继续培养7d，进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定，以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力，并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果：①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果：胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞，并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果：原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应，结合悬浮培养有神经球形成的现象，证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数，阳性率的比较：两组培养1，3，7，11，14，28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异（t=2．41～92．7l，P〈0．01或0．05）。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定：胚胎鼠及新生鼠的MAB阳性细胞分别为（32．6&;#177;5．6）％，（30．7&;#177;6．7）％，抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为（47．5&;#177;9．4）％，（50．3&;#177;8．9）％，P均〉0．05。结论：从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞，表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin，并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强，更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

胎鼠神经干细胞的生长、增殖及分化特点观察

目的：建立神经干细胞的分离、培养、分化及鉴定技术；观察神经干细胞的生长、增殖及分化特点。方法：分离胎鼠大脑皮质及皮质下组织，经消化及机械吹打后，用悬浮培养的方法，获得细胞克隆；用有限稀释法，得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆；用免疫细胞化学方法，鉴定神经干细胞。结果：从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力；原代和传代细胞抗原-nestin呈阳性；单细胞克隆能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论：用此方法分离、培养的细胞具有自我更新和分化潜能、有很强的增殖能力，是属于中枢神经系统的干细胞。     

无血清培养大鼠胚胎向神经干细胞的分化

背景:体外培养扩增获取大量、高纯度的神经干细胞是其移植应用的前提,无血清培养主要目的是去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长因子等干扰因素.目的:在无血清条件下体外分离培养大鼠胚胎神经干细胞,并观察其生物学特性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院中心实验室完成.材料:14～16 d龄SD胎鼠2只,由河北医科大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下取胎鼠大脑皮质,剪碎后机械分离法制作单细胞悬液,加入含B27神经营养添加剂的无血清MEM/F12培养基进行培养,1周后传代.主要观察指标:免疫荧光染色鉴定神经干细胞巢蛋白的表达及传代能力,加入含血清的MEM/F12培养基诱导分化1周后免疫组化检测细胞分化情况.结果:培养48～72h细胞聚集悬浮生长,形成典犁的神经球,呈神经干细胞特异性抗原巢蛋白阳性表达.传代的神经干细胞置于BrdU培养液中5～7d形成次代神经球,呈BrdU阳性,表明次代神经球中绝大部分细胞为传代后细胞分裂而来,具有传代能力,传代后加入含血清的培养基后可以分化为微管相关蛋白2阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞.结论:利用无血清培养技术可成功从胎鼠脑皮质中分离培养出具有分裂增殖能力及多向分化潜能的神经干细胞.     

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的:比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性,为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法:实验于2004-11/2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养,每3天换液1/2,每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中,补足神经干细胞分化培养基,继续培养7d,进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定,以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力,并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果:①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果:胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞,并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果:原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应,结合悬浮培养有神经球形成的现象,证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数、阳性率的比较:两组培养1,3,7,11,14,28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异(t=2.41～92.71,P<0.01或0.05)。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定:胚胎鼠及新生鼠的MAP2阳性细胞分别为(32.6±5.6)%,(30.7±6.7)%,抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为(47.5±9.4)%,(50.3±8.9)%,P均>0.05。结论:从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞,表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin,并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强,更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

远志皂苷元对新生大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的观察远志皂苷元对体外培养的胎鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖分化的影响。方法利用无血清DMEM/F12 体外培养技术从新生Wistar 大鼠大脑海马中培养NSCs,添加不同浓度(0、1、2、4 μg/ml)远志皂苷元。应用免疫荧光技术对NSCs及其分化后的细胞进行鉴定。结果培养的NSCs能够表达Nestin,并具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力。在同一接种密度条件下,远志皂苷元干预组的Nestin 阳性细胞数较对照组减少(P<0.05),神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数较对照组增加(P<0.05)。结论远志皂苷元能促进新生大鼠大脑海马NSCs的分化。     

胎鼠神经干细胞的生长、增殖及分化特点观察

目的:建立神经干细胞的分离、培养、分化及鉴定技术;观察神经干细胞的生长、增殖及分化特点。方法:分离胎鼠大脑皮质及皮质下组织,经消化及机械吹打后,用悬浮培养的方法,获得细胞克隆;用有限稀释法,得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆;用免疫细胞化学方法,鉴定神经干细胞。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并具有增殖的能力;原代和传代细胞抗原-nestin呈阳性;单细胞克隆能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:用此方法分离、培养的细胞具有自我更新和分化潜能、有很强的增殖能力,是属于中枢神经系统的干细胞。     

鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化肝干细胞的研究

目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow stromal cells,rBMSCs)定向分化为肝干细胞的可行性。方法:采用全骨髓培养法体外培养rBMSCs,设实验组及对照组,应用肝细胞生长因子(HGF)诱导分化,采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化检测CK18、CK19及波形蛋白Vimentin;ELASA等方法检测甲胎蛋白,白蛋白及碱性磷酸酶。结果:rBMSCs经体外培养诱导后呈多角形、卵圆形改变,白蛋白,AFP,CK18、CK19表达阳性,碱性磷酸酶出现明显改变。结论:rBMSCs体外经HGF诱导下,具有向肝干细胞分化的能力,可成为肝组织工程主要种子细胞来源。     

胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞的培养分化及其意义

目的：对胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞进行分离和培养，证实其增殖潜能。方法：从孕17d的SD大鼠胚胎脊髓中分离、培养神经干细胞并用血清诱导其分化，通过免疫荧光化学方法研究其特性。结果：获得了大量未分化、呈悬浮生长的神经干细胞球，传数代后仍有干细胞特性，在血清诱导下，可分化为神经元及神经胶质细胞。结论：本实验成功分离胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞，为神经干细胞的基础研究奠定一定基础。     

Wnt-1在大鼠脑缺血再灌注海马组织内源性神经干细胞早期增殖分化中的作用

目的:检测wnt-1在大鼠脑缺血再灌注海马组织神经干细胞早期增殖分化中的表达及其变化,探讨影响神经干细胞早期增殖分化的分子调控机制。方法:实验于2005-08/2006-08在沈阳医学院完成。选择健康雄性Wistar大鼠30只,随机分为正常组,缺血再灌注3,7,14,21d组,每组6只。缺血再灌注各组采用颈动脉负压分流法制作大鼠脑缺血再灌注模型。正常组不作任何手术处理。用免疫组织化学SP法及显微图像分析检测海马神经干细胞中BrdU,Wnt-1的表达。结果:30只大鼠均进入结果分析。①缺血再灌注各组大鼠海马均可见BrdU阳性细胞。阳性细胞呈棕黄色,形态多样,呈圆形、椭圆形或梭形。脑缺血再灌注第3天缺血海马神经元BrdU阳性细胞明显增多,BrdU阳性细胞百分率为(56.78±2.37)%,第7天达高峰,BrdU阳性细胞百分率为(69.99±6.01)%,第14,21天逐渐减少,分别为(49.35±5.57)%,(38.33±7.89)%。缺血再灌注各组与正常组[(4.89±5.60)%]比较,差异有显著性意义(P<0.05)。②缺血再灌注各组大鼠均有wnt-1表达,海马颗粒层细胞质呈棕黄色颗粒,不着色为阴性。脑缺血再灌注第3天Wnt-1反应产物有所增多,海马组织Wnt-1表达的平均灰度值为103.67±5.49。第7天表达最强,平均灰度值为75.34±6.75,以后表达逐渐减少。缺血再灌注各组与正常组(132.47±2.96)比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:Wnt-1时间依赖性表达与神经干细胞增殖分化进程相吻合,说明其在神经干细胞早期增殖分化中起重要调控作用。     

猪骨髓间质干细胞生物学特性及分化为成骨细胞和心肌细胞的能力

目的:建立猪骨髓间质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)体外分离培养方法。对猪MSCs的生物学特性及分化为成骨细胞和心肌细胞的能力进行研究。方法:抽取猪骨髓体外培养MSCs,绘制生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期。选择第二代MSC体外诱导分化为成骨细胞和心肌细胞。通过碱性磷酸酶染色及钙沉积对成骨细胞进行鉴定;用免疫组化,透射电镜鉴定心肌细胞。结果:MSC细胞形态呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间为26h,细胞周期显示有69.22%细胞处于G0/G1期,24.44%细胞处于S期,细胞化学染色显示POX、SB阴性,PAS、α-NAE阳性,约1%细胞ALP阳性。MSC经体外诱导分化后可形成骨细胞和心肌细胞。结论:猪骨髓MSCs可在体外长期、稳定培养,具有多潜能分化活性,可以为间质干细胞系及组织工程研究提供较理想的细胞来源。为临床间质干细胞的应用研究提供动物模型,并为进一步的临床康复研究提供实验依据。     

间充质干细胞的生物学特性及多向分化潜能

学术背景:间充质干细胞是造血微环境中的一种重要细胞成分,可以向多种组织增殖分化,且免疫原性低,临床实验证实间充质干细胞移植可用于组织修复及治疗间充质组织遗传缺陷性疾病.目的:深入认识间充质干细胞的生物学特性及其多向分化潜能. 检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1995-01/2005-12的相关文献,检索词"mesenchymal stem cells,differentiation,biological character",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库1995-01/2005-12的相关文献,检索词"间充质干细胞,多向分化,生物学性质",并限定文章语言种类为中文.共检索到78篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①文章所述内容应与间充质干细胞的生物学特性或多向分化潜能密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:①重复性研究.②Meta分析.文献评价:文献的来源主要是通过对间充质干细胞的生物学特性及其多向分化潜能方面内容进行汇总分析.所选用的30篇文献中,4篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:①间充质干细胞在骨髓组织中的含量最为丰富,此外还存在于胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周血及肝脏、脂肪、肌肉、皮肤等多种组织中.间充质干细胞具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能,在不同诱导条件下可分化为软骨、骨、骨骼肌、肌腱、脂肪、神经及肾脏实质的细胞等.②间充质干细胞体外培养的方法目前主要有3种:密度梯度离心与贴壁筛选法:鉴于间充质干细胞与其他细胞密度的差异,采用Percoll或者Ficoll分离液来实现细胞间的分离,同时依据间充质干细胞贴壁生长的特性,将其与非贴壁细胞分离.流式细胞仪分选法:根据间充质干细胞体积小、相对缺少颗粒这一特性采用流式细胞仪对其进行分选.磁珠分选法:根据间充质干细胞表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选,用抗体包被磁珠,获得相对纯化的间充质干细胞.现今常用含5%~20%胎牛血清的DMEM培养基培养间充质干细胞.目前对于间充质干细胞的鉴定也主要是根据形态、功能等,而且不同来源的间充质干细胞表面标志物也不尽相同.③间充质干细胞在特定的理化环境和细胞因子诱导下,能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、心肌细胞、内皮等多种细胞类型,受到很多因素的影响,而且免疫原性弱,是组织工程理想的种子细胞来源.此外,间充质干细胞易于外源基因的转染和表达,在细胞治疗和基因治疗中也有着广泛的应用.结论:间充质干细胞的多向分化特性使其在组织工程创伤修复、细胞替代治疗、支持造血、基因治疗等方面的应用前景相当广阔.但目前采用的体外分离培养无法得到单克隆的细胞成分,也缺乏可靠的鉴定标准,不同来源的间充质干细胞有何差异等问题亟待解决.     

大鼠脑梗死后内源性神经干细胞的增殖及迁移

背景传统观点认为中枢神经组织在发育成熟和损伤后不能再生,但近年来研究证实,人及成年动物神经系统中均存在神经干细胞,只是大部分神经干细胞在体内处于静止状态.神经干细胞对脑梗死损伤的治疗作用,已成为研究的焦点问题.目的观察脑梗死后内源性神经干细胞的反应过程,探讨内源性神经干细胞在中枢神经系统损伤修复中的作用,为脑梗死损伤后机体自我修复提供理论依据.设计以实验动物为研究对象,随机、对照的实验研究.单位北京协和医院神经外科.材料实验于2003-03/10在中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院神经外科实验室完成.选择健康雄性Wistar大鼠82只,体质量250～300 g.方法用线栓法制作大鼠脑梗死模型,将其分成梗死后1,3,7,14,28 d组,每组14只,对照组为假手术组(12只).免疫组织化学方法动态检测大鼠脑内5-溴脱氧尿苷嘧啶(BrdU)、巢蛋白(Nestin)的表达.主要观察指标大鼠脑梗死后BrdU,Nestin阳性细胞数的变化.结果对照组中,海马齿状回及SVZ区存在少量BrdU和Nestin阳性细胞,脑梗死后1 d,海马和SVZ区BrdU阳性细胞较对照组显著增加(P＜0.05);7 d达到高峰(P＜0.05);14 d后开始下降,但仍高于正常水平(P＜0.05);28 d后接近正常.并且,梗死侧BrdU和Nestin阳性细胞数明显多于对侧(P＜0.05),并且通过胼胝体向对侧迁移.结论脑梗死可激活内源性神经干细胞原位增殖及迁移.     

骨髓间充质干细胞成纤维样集落的培养方法及多向分化潜能

目的:建立原代小鼠骨髓间充质干细胞成纤维样集落的培养方法,了解间充质干细胞的培养特性及其多向分化潜能。方法:实验于2004-10/2005-10在郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所完成。①间充质干细胞的分离:选取SPF级2月龄昆明种小鼠30只,无菌条件下抽取双侧股骨、胫骨骨髓,制成骨髓单细胞悬液,计数有核细胞的密度。②血清浓度对成纤维样集落的影响:调整有核细胞密度为5×108L-1,分别接种于体积分数为0.02,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25的胎牛血清-DMEM培养基中,每种血清浓度各4孔,1mL/孔,24h后换液。随后每72h换液,连续观察2周。③有核细胞密度对成纤维样集落的影响:分别调整有核细胞至106L-1,107L-1,2.5×108L-1,5×108L-1,109L-1,分别接种于12孔板中,每种密度4孔,24h后换液。随后每72h换液,连续观察2周,瑞氏吉姆萨染色后计数成纤维样集落的个数。④成骨与成脂肪诱导:调整有核细胞密度在5×108L-1,接种于预包被鼠尾胶的12孔板中培养。24h换液,去除未贴壁的细胞,以后每48h换液1次,换液后加入成骨诱导液、成脂肪诱导液。观察各血清浓度下细胞生长情况,消化培养板中的成纤维样集落流式细胞仪检测CD34,CD133,CD90,CD105。VonKossa和油红O法染色鉴定间充质干细胞成骨与成脂肪诱导情况。结果:①不同血清浓度对成纤维样集落形成的影响:胎牛血清-DMEM培养液体积分数为0.02,0.05时,细胞可保持成纤维样,但增殖较慢;体积分数为0.15,0.2,0.25时,细胞增殖较快,但细胞易分化;体积分数为0.1时,细胞可基本保持成纤维样,且增殖速度适中。②有核细胞不同接种密度对成纤维样集落形成的影响:有核细胞接种密度为106L-1,107L-1时,每孔成纤维样集落数为0～1个。接种密度高于109L-1时,每孔成纤维样集落之间出现交叉或融合。接种密度分别为2.5×108L-1,5×108L-1,109L-1时,10d左右可见典型的成纤维样集落。成纤维样集落个数与所接种有核细胞密度呈正相关。③成纤维样集落中的间充质干细胞表面标记流式检测结果:成纤维样集落中的间充质干细胞呈CD34-,CD133-,CD90 ,CD105 ,分别各占2.5%,3.1%,67%和78%。④间充质干细胞成骨与成脂肪诱导情况:成脂肪诱导2周后成纤维样集落中(80±7)%的间充质干细胞出现脂滴,成骨诱导2周后成纤维样集落出现矿物结节。分别以油红O和VonKossa’s矿化结节特异性染色后,成脂肪诱导中成纤维样集落(85±6)%的细胞胞浆呈红色,成骨诱导中大多数的成纤维样集落中心位置出现钙结节。结论:全骨髓接种合适密度的有核细胞可形成典型的成纤维样集落,且成纤维样集落具有成骨、成脂肪等多向分化潜能。     

骨髓间充质干细胞成纤维样集落的培养方法及多向分化潜能

目的：建立原代小鼠骨髓间充质干细胞成纤维样集落的培养方法，了解问充质干细胞的培养特性及其多向分化潜能。 方法：实验于2004-10／2005-10在郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所完成。①间充质干细胞的分离：选取SPF级2月龄昆明种小鼠30只，无菌条件下抽取双侧股骨、胫骨骨髓，制成骨髓单细胞悬液，计数有核细胞的密度。②血清浓度对成纤维样集落的影响：调整有核细胞密度为5&;#215;10^8L^-1，分别接种于体积分数为0．02，0．05，0．1，0．15，0．2，0、25的胎牛血清-DMEM培养基中，每种血清浓度各4孔，1mL／孔，24h后换液。随后每72h换液，连续观察2周。③有核细胞密度对成纤维样集落的影响：分别调整有核细胞至10^6L^-1，10^7L^-1，2．5&;#215;10^8L^-1，5&;#215;10^8L^-1，10^9L^-1，分别接种于12孔板中，每种密度4孔，24h后换液。随后每72h换液，连续观察2周，瑞氏吉姆萨染色后计数成纤维样集落的个数。④成骨与成脂肪诱导：调整有核细胞密度在5&;#215;10^8L^-1，接种于预包被鼠尾胶的12孔板中培养。24h换液，去除未贴壁的细胞，以后每48h换液1次，换液后加入成骨诱导液、成脂肪诱导液。观察各血清浓度下细胞生长情况，消化培养板中的成纤维样集落流式细胞仪检测CD34，CD133，CD90，CD105。VonKossa和油红O法染色鉴定间充质干细胞成骨与成脂肪诱导情况。 结果：①不同血清浓度对成纤维样集落形成的影响：胎牛血清-DMEM培养液体积分数为0．02，0．05时，细胞可保持成纤维样，但增殖较慢；体积分数为0．15，0．2，0．25时，细胞增殖较快，但细胞易分化；体积分数为0．1时，细胞可基本保持成纤维样，且增殖速度适中。②有核细胞不同接种密度对成纤维样集落形成的影响：有核细胞接种密度为10^6L^-1，10^7L^-1时，每孔成纤维样集落数为0～1个。接种密度高于10^9L^-1时，每孔成纤维样集落之间出现交叉或融合。接种密度分别为2．5&;#215;10^8L^-1，5&;#215;10^8L^-1，10^9L^-1时，10d左右可见典型的成纤维样集落。成纤维样集落个数与所接种有核细胞密度呈正相关。③成纤维样集落中的问充质干细胞表面标记流式检测结果：成纤维样集落中的问充质干细胞呈CD34^-，CD133^-．CD90^＋，CD105^＋，分别各占2．5％，3．1％，67％和78％。④间充质干细胞成骨与成脂肪诱导情况：成脂肪诱导2周后成纤维样集落中（80&;#177;7）％的间充质干细胞出现脂滴，成骨诱导2周后成纤维样集落出现矿物结节。分别以油红0和Von Kossa’s矿化结节特异性染色后，成脂肪诱导中成纤维样集落（85&;#177;6）％的细胞胞浆呈红色，成骨诱导中大多数的成纤维样集落中心位置出现钙结节。 结论：全骨髓接种合适密度的有核细胞可形成典型的成纤维样集落，且成纤维样集落具有成骨、成脂肪等多向分化潜能。     

不同因子影响骨髓间充质干细胞的多向分化

背景：在组织工程领域,关于骨髓间充质干细胞定向诱导分化的研究越来越多,但是细胞培养基中不同成分会对骨髓间充质干细胞的体外增殖分化产生影响。目的：针对培养基中不同因子对骨髓间充质干细胞定向诱导分化的作用加以综述。方法：第一作者应用计算机检索1998年1月至2012年4月Pubmed数据库及万方数据库。检索英文关键词为“bone marrow mesenchymal stromal cells, cell culture medium, differentiation”,中文关键词为“骨髓间充质干细胞,细胞培养,定向诱导分化”,纳入有关不同因子对骨髓间充质干细胞向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞定向诱导分化作用的文献,排除重复研究。结果与结论：计算机初检共得到184篇文献,根据纳入排除标准,对其中30篇文献进行综述。大体说来,骨髓间充质干细胞向成骨分化的主要因子有地塞米松、转化生长因子、维生素C、维生素D3、β-甘油磷酸钠及乙烯雌酚等;向软骨分化的主要因子有地塞米松、转化生长因子、维生素C、胰岛素样生长因子及成纤维细胞生长因子等;向脂肪细胞转化的主要因子有地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素和消炎痛等,但是其中一些因子的作用机制及不良反应还不明确,需要进一步的研究与验证。同时,骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量较低,不同的分离方法会导致不同的分离率,因此如何选取一种分离率高的分离方法仍有待研究。     

脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞/前体细胞的增殖与分化

目的:目前认为大脑和脊髓中有内源性神经干细胞/前体细胞存在,但脑和脊髓损伤后这些内源性神经干细胞/前体细胞的活化、增殖、分化机制仍不清楚.应用5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo2-deoxyuridine, BrdU)体内标记的方法,观察了大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞/前体细胞的增殖、分化变化过程.方法:实验于2007-04/09在珠江医院中心实验室进行.[1]实验材料:36只同一窝别雌性SD大鼠由南方医科大学动物实验中心提供,体质量200～220g,按照随机数字表法将大鼠分为对照组、预标记组和损伤后标记组,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.[2]实验方法:采用Allen法建立脊髓损伤模型,损伤后连续10d腹腔注射Brdu来标记损伤后活化增殖的细胞;对照组采用Brdu连续10d腹腔注射,以标记脊髓内保持分化活力的细胞;预标记组在Brdu连续10d腹腔注射标记后,于第12天进行脊髓损伤.[3]实验评估:采用免疫组织化学法检测Brdu标记的内源性神经干细胞/前体细胞增殖情况.结果:[1]对照组可见整个脊髓切片均有大量的Brdu阳性细胞存在,这些细胞主要分布于脊髓外侧区域.[2]与对照组比较,预标记组Brdu阳性细胞在损伤后1d明显减少,7d后增多,21d后逐渐恢复并超过对照组水平.[3]损伤后标记组在损伤后1d即见大量Brdu阳性细胞增殖,阳性细胞数亦较预标后损伤1d时明显增多,损伤后7d Brdu阳性细胞数达到高峰,并超出对照组水平,这些细胞分布于损伤周围的灰质及室管膜区,但在损伤后21d, Brdu阳性细胞数未见继续增加.与对照组相比,损伤后标记组有较多的巢蛋白阳性细胞在室管膜区表达,1d即有增加,在7d达到高峰,21d减少.结论:脊髓损伤后出现明显的细胞增殖、分化反应,主要存在损伤后1周以内,1d即可见明显增生,尤以7d时明显,21d保持平稳,这些细胞主要分布在损伤脊髓中央管周围的室管膜区和损伤区域周围.     

骨髓源性神经样细胞体外存活、增殖的特性

目的:寻找骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样/星形胶质样细胞的有效方法,并评价其体外存活和增殖特性。方法:实验于2005-07/2006-08在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。采用贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。收集第5代骨髓间充质干细胞单细胞悬液,以1×109L-1置入6孔培养板中,加入DMEM 20%胎牛血清生长培养基,24h后更换生长培养基为DMEM/F12 2?7 40μg/L碱性成纤维生长因子 20μg/L内皮生长因子诱导分化培养基,诱导10～20d,即采用多因子分阶段逐步诱导方法定向诱导骨髓间充质干细胞分化为神经前体样细胞。更换诱导分化培养基为DMEM/5%胎牛血清生长培养基,分两组进行诱导:一组向神经元样诱导分化:全反式维甲酸连续加样,首次浓度0.5μmol/L,以后每天全量加样;二组向星形胶质样细胞诱导分化:10μg/L血小板衍生生长因子BB首次加样,以后每天半量加样,均连续诱导10～14d,进而分化为神经元样/星形胶质样细胞。应用活细胞计数试剂盒CCK-8检测神经元样/星形胶质样细胞的增殖及存活情况,绘制生长曲线及细胞存活曲线。结果:①碱性成纤维生长因子 表皮生长因子连续诱导7d后骨髓间充质干细胞分化为球团样的神经前体样细胞,巢蛋白表达阳性。②全反式维甲酸、血小板衍生生长因子BB分别连续诱导10d后骨髓间充质干细胞逐步分化出神经元样、星形胶质样细胞,并分别表达纤维丝蛋白200及胶质纤维酸性阳性蛋白。③神经元样细胞早期生长较缓慢,具有一定的增殖能力,六七天后达到高峰,此后增殖能力明显下降,细胞存活率明显下降,十四五天之后细胞存活率下降到7.6%以下,难以传代培养。星形胶质样细胞初期生长慢,5d后生长加速,进入对数生长期,七八天后进入平台期,仍保持较高的细胞存活率。结论:采用多因子分阶段诱导方法可成功诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样/星形胶质样细胞。神经元样细胞存活、增殖能力较差,难以传代,星形胶质样细胞存活、增殖能力较强,可建立传代的二倍体细胞系。     

血管内皮细胞和脂肪干细胞体外联合培养细胞的增殖

背景:血管内皮细胞可有力支持脂肪干细胞向成骨方向转变,还可以加快血管的发生,为干细胞成骨提供营养支持.目的:探讨血管内皮细胞和脂肪干细胞体外联合培养对混合细胞增殖的影响.方法:设立单纯血管内皮细胞培养组、脂肪干细胞与血管内皮细胞按3:1,1:3,1:1混合培养组、单纯脂肪干细胞培养组,加入含胎牛血清的L-DMEM,置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中.倒置显微镜下观察细胞形态变化,改良MTT法绘制细胞生长曲线.结果与结论:脂肪干细胞与血管内皮细胞按3:1,1:1混合培养14 d,细胞之间出现许多突触连接,部分细胞融合成团块状,其余培养方式均未见细胞团出现.随培养时间的延长,各培养方式下细胞吸光度值均逐渐升高,单纯脂肪干细胞培养、脂肪干细胞与血管内皮细胞按3:1,1:3,1:1混合培养12 d时细胞吸光度值达高峰,且按1:1混合培养的吸光度值最高;而单纯血管内皮细胞培养10 d吸光度值达高峰;随后各培养方式下细胞吸光度值逐渐下降.提示血管内皮细胞与脂肪干细胞体外联合培养,细胞能够相互促进增殖,1:1混合比例条件下细胞增殖能力最强.     

大鼠眼外肌成肌细胞的增殖及分化特征

目的:完善眼外肌成肌细胞体外培养、鉴定的方法及观察其生物学特性。方法:实验于2005-02/08在青岛大学医学院附院中心实验室(省级实验室)完成。取出生后3～7d的大鼠,通过大鼠眼外肌细胞的取材、分离、消化、培养等技术,观察细胞的形态、生长曲线、细胞融合率,观察大鼠眼外肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用成肌细胞标记物α-横纹肌肌动蛋白、中间丝结蛋白免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:①成肌细胞的生长情况:在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。②成肌细胞融合率:在24h和48h融合率提高明显,72h达高峰,之后不再变化。③细胞免疫化学检测结果:α-横纹肌肌动蛋白和中间丝结蛋白免疫细胞化学染色阳性。结论:体外培养的大鼠眼外肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,其生物学特征同骨骼肌卫星细胞。     

持续 Wnt 信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖简

背景：如何提高胚胎干细胞诱导效率、促进胚胎干细胞源造血干细胞体外增殖成为目前急需解决的课题。目的：以外源性Wnt3a作为诱导剂,激活培养中的小鼠胚胎干细胞Wnt/β-catenin信号通路,观察该通路的激活是否促进胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化。方法：用外源性wnt3a（100μg/L）持续作用ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d,通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量,QRT-PCR检测Wnt下游靶标基因的表达量来确定经典Wnt/β-catenin信号通路是否被激活,然后采用单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化,流式细胞仪检测造血发育相关表面标志CD34＋/Sca-1＋,同时以QRT-PCR法检测造血相关基因的表达情况。结果与结论：ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经wnt3a（100μg/L）连续培养21 d后发现β-catenin蛋白在细胞内积累;Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加,可见经典 Wnt/β-catenin 信号通路有被激活;单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化的过程中检测到CD34＋/Sca-1＋细胞含量在14 d时占总细胞量高达20.2%,而对照组的仅占11.9%。造血相关基因骨形态发生蛋白4、FLK2及CD34的表达量均增加,而Smad5的表达则明显受到抑制。说明Wnt3a持续作用可激活Wnt/β-catenin信号通路,并促进ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的定向分化。