内皮细胞对神经干细胞增殖与分化的影响

已经确定神经干细胞在脑中不是随意分布,而是集中在血管周围的。尽管神经干细胞存在于血管周围,但是对于其与血管组成细胞之间的关系还不是很清楚。据报道,内皮细胞释放的可溶性因子可以刺激神经干细胞自我增殖,抑制其分化,并且提高神经元的比例。将内皮细胞与神经干细胞共同培养可以激活Notch途径来促进神经干细胞自我增殖。另外,血管内皮生长因子对神经细胞的生长也起着非常重要的作用,它促进了中枢神经系统星形胶质细胞的生长与分化。因此,内皮细胞不仅是传统意义上血管的组成部分,还是神经干细胞所在区域的重要成分,并且可以通过大脑产生的神经营养性分泌物来提高神经元的发生。     

联合应用EGF和NGF对成年大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的探讨联合应用表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)对成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单克隆培养细胞行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1w后细胞行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养基中所加营养因子的不同将第4代细胞分为4组培养:EGF组、EGF+NGF组、NGF组、对照组,此4组细胞培养1w后行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单克隆培养后克隆球表达Nestin,诱导分化1w后细胞表达NSE、GFAP。与空白对照组相比,EGF组、NGF组和EGF+NGF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+NGF组细胞的比例最高。结论单独或联合应用EGF、NGF可以促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化。     

大鼠脑的神经干细胞的体外培养、增殖和分化

采用无血清培养基分离和培养大鼠脑的神经干细胞,并通过免疫荧光细胞化学技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向分化潜能的鉴定。鉴定结果表明,所分离培养的细胞为大鼠神经干细胞,具有神经干细胞的特征,并可在体外大量增殖和较长期培养,可经诱导分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞,是进行诱导分化的良好细胞模型。本文讨论了神经干细胞传代培养中应予以注意的问题和对策。     

大鼠海马神经干细胞体外增殖、凋亡和分化的激光扫描共焦显微镜观察

目的 采用激光扫描共焦显微镜观察体外培养胎鼠海马神经干细胞（NSCs）增殖、凋亡及其分化情况。方法 体外分离培养胚胎大鼠海马NSCs,把神经干细胞球培养在共焦显微镜专用培养皿中。用 Hoechst 33258染细胞核,免疫荧光细胞化学技术检测巢蛋白（Nestin）的表达以鉴定NSCs,检测神经元、星形胶质细胞的特异性标记物β-Ⅲ型微管蛋白（β-Ⅲ tubulin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达以测定NSCs的分化能力。通过激光扫描共焦显微镜对神经干细胞球进行光学连续断层扫描,然后用软件进行三维重建,立体动态观察神经球。结果 通过激光扫描共焦显微镜观察到神经球     

转铁蛋白受体基因对神经干细胞体外增殖和分化的影响研究

目的研究转铁蛋白受体基因(TfR)对神经干细胞(NSCs)体外增殖和分化的影响。方法分别将转铁蛋白受体基因神经干细胞(TfR-NSCs)和正常神经干细胞加入神经干细胞分化液分化7 d后,免疫荧光观察细胞分化及分别计算两种细胞胶质细胞和神经元细胞的分化率;CCK-8法检测其细胞在1 d、2 d、3 d时的A值来观察细胞增殖能力。结果转铁蛋白受体基因神经干细胞和正常神经干细胞均可分化成神经元和胶质细胞,且二者分化率未见明显差异(P0.05);转基因神经干细胞的增殖能力未受抑制(P0.05)。结论转铁蛋白受体基因神经干细胞的增殖分化未受明显影响,为下一步转铁蛋白受体转基因神经干细胞的应用提供支持。     

不同生长因子对人胚胎脑海马区神经干细胞体外生长的影响

本研究比较了不同生长因子对人胚胎脑海马区神经干细胞(NSCs)体外生长的影响。取胎龄8 ~12周的人胚胎脑海马,按基础培养液中生长因子的不同将培养细胞分为:h EGF组、h -bFGF组、h- EGF+h -bFGF组、h -EGF+h LIF组、h- bFGF+h LIF组、h -EGF+h bFGF+h- LIF组,将机械分离的单细胞悬液以2×106 个细胞/ml接种到上述组别,观察各生长因子的作用。结果发现,原代细胞培养6h时,各组细胞情形区别不大;随培养时间的延长,h -EGF+h- bFGF组和h- -EGF+h -bFGF+h- LIF组先形成许多小细胞簇, 7d后,这两组的细胞球数量进一步增加;而h- bFGF+h -LIF组和h- EGF+h -LIF组有较少的细胞球,h bFGF组偶见小细胞球,h- EGF组细胞几乎全部死亡。将培养的h -EGF+h -bFGF+h -LIF组的神经干细胞用1%FBS诱导分化后,行免疫细胞化学鉴定。结果表明,诱导分化12h时,细胞呈RNA 结合蛋白(Musashi1)阳性, 7d时,细胞大部分呈βⅢ管蛋白(βⅢ- tu- bulin)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性,极少数为半乳糖脑苷脂(Galc)阳性。以上结果提示,人胚胎脑海马区NSCs的体外存活增殖必须依赖于h -EGF和h- bFGF的共同作用,而h- LIF对早期培养的人NSCs的影响不明显。     

神经干细胞在海人酸毁损大鼠海马中的迁移和分化

本研究旨在观察胎鼠神经干细胞移植入海人酸毁损成年大鼠海马中的迁移和分化情况。立体定位注射海人酸毁损大鼠海马CA1区锥体细胞,毁损一周后,将Hoechst33342标记的神经干细胞移植毁损区,分别于术后1、2、4、8周取材,利用荧光技术和免疫组织化学方法,追踪移植的神经干细胞在毁损侧海马中的存活、迁移和分化情况。结果显示,移植的神经干细胞在海马锥体层呈链状迁移,并分化为MAP2阳性细胞和GFAP阳性细胞。这些结果提示移植的神经干细胞在海马锥体层呈链状迁移,大部分分化为胶质细胞,部分分化为神经元。     

EPO对体外培养的神经干细胞增殖、分化和凋亡的影响

为探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对大鼠神经干细胞增殖、分化和凋亡的影响,本研究采用显微解剖、机械吹打和无血清悬浮培养方法分离培养大鼠神经干细胞,向培养基中添加不同剂量的EPO,通过计数干细胞克隆形成率、四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测法检测神经干细胞的增殖情况,用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色和激光扫描共聚焦显微镜检测细胞凋亡率;向有血清分化培养基中加入不同剂量的EPO,以神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibril-lary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色检测神经干细胞的分化情况。结果显示:与对照组相比,加入>5U/mlEPO后神经干细胞克隆形成率和MTT检测OD值明显增高,而凋亡率显著下降,分化培养后NSE阳性细胞较对照组明显增多。结果提示:EPO可促进大鼠神经干细胞的增殖,抑制其凋亡,促进其向神经元方向分化。     

FN和Col对VEGF诱导hMSCs体外内皮分化的影响

目的：探讨细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）FN（Fibronectin）和Col（I type Collagen）对VEGF诱导人骨髓间充质干细胞hMSCs体外内皮分化的影响。方法：采用生长因子VEGF165与纤维连接蛋白FN或Ⅰ型胶原Col，联合对hMSCs进行内皮诱导分化。通过免疫细胞化学和流式细胞分析对分化后细胞群检测。结果：分化后细胞群形态没有明显改变；FN和Col可引起内皮分化早期标志KDR和CD34增强，FN效应较为明显；两种基质蛋白也引起β1整合素表达增强。结论：hMSCs诱导后具备内皮分化趋势；ECM-整合素受体和VEGF165相互作用调控hMSCs分化；β1整合素的改变参与hMSCs的内皮分化。     

皮下注射碱性成纤维细胞生长因子促进血管性痴呆大鼠海马神经干细胞的增殖

BACKGROUND:As a neurotrophic factor, basic fibroblast growth factors extensively distribute in the central nervous system, and play an important physiological role by combination with their relative receptors. OBJECTIVE:To investigate the effect of basic fibroblast growth factors on the learning ability and proliferation of nestin-positive hippocampal neural stem cells in rats with vascular dementia. METHODS:Totally 30 Sprague-Dawley rats were randomly divided into vascular dementia, sham operation and treatment groups. The vascular dementia and treatment groups were for preparing vascular dementia model, and the treatment group was given subcutaneous injection of basic fibroblast growth factors. Subsequently, at 4 weeks, the learning ability of rats and the number of nestin-positive hippocampal neural stem cells was detected by the Morris water maze test and immunohistochemical staining, respectively. RESULTS AND CONCLUSION:Compared with the vascular dementia group the latency period was significantly shorter in the sham operation and treatment groups, and the number of times crossing the target quadrant was significantly higher in the sham operation and treatment groups (P < 0.05). But there was no significant difference between the sham operation and treatment groups (P > 0.05). Under fluorescence microscope, yellow-green fluorescence stained neurons positive for basic fibroblast growth factor could be found in the CA1, CA2 and CA3 of the treatment group. Additionally, the number of nestin-positive neurons in the CA1 area of the hippocampus was the most in the treatment group, followed by the sham operation group, and the least in the vascular dementia group. These results suggest that the subcutaneous injection of basic fibroblast growth factors can migrate to the hippocampus, , and improve the learning ability of rats by inducing proliferation of nestin-positive hippocampal neural stem cells.     

雌二醇对大鼠海马神经干细胞增殖的影响

目的观察雌二醇对大鼠海马神经干细胞增殖的影响及其作用机制。方法取20只孕17d的SD大鼠海马组织,进行神经干细胞的培养和增殖,添加不同浓度的雌二醇(E2)。通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)免疫荧光、MTT方法检测神经干细胞的增殖;通过免疫荧光技术和巢蛋白(Nestin)双标观察神经干细胞球中雌激素受体ERα和ERβ的表达情况。结果 BrdU与MTT检测结果显示,随着雌二醇浓度从10-10mol/L增加至10-8mol/L,神经干细胞数量逐渐增加。雌二醇在10-8mol/L时,细胞增殖数目最多而且细胞活力最好。随着雌二醇浓度进一步增加至10-6mol/L,神经干细胞增殖能力逐渐下降。免疫荧光技术检测显示神经干细胞均表达ERα和ERβ两种受体。结论在一定浓度范围内,雌二醇能促进海马神经干细胞的增殖,并可能是通过ERα和ERβ介导促进神经干细胞增殖。     

脑源性神经营养因子体外诱导神经干细胞向神经元分化

目的观察脑源性神经营养因子(BDNF)对新生SD大鼠海马神经干细胞在体外分化为神经元的作用。方法取新生SD大鼠海马组织,以无血清培养技术培养获得神经干细胞,在BDNF诱导下让其在体外分化,7d后,通过免疫荧光技术结合图像分析技术来观察分化所得神经丝(neurofilament,NF)抗原阳性神经元的比率及其最长突起的长度。结果BDNF组分化所得细胞NF阳性率为13.66%,神经元突起长度为(146.27±26.30)μm,对照组分化所得细胞NF阳性率为9.38%,神经元突起长度为(117.00±23.98)μm,两组结果有显著性差异。结论BDNF能提高新生SD大鼠海马神经干细胞体外定向分化为神经元的比率,并且能刺激新生神经元突起的生长。     

VEGF转基因神经干细胞移植对大鼠急性放射性脑损伤后脑组织中NSE表达的影响

目的： 探讨血管内皮生长因子（VEGF）转染的神经干细胞(NSC)对放射性脑损伤的影响。方法：将Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为对照组、放射性脑损伤组、NSC和转染VEGF的NSC治疗组, 放射性脑病模型成功制备后1周脑内移植转染VEGF的NSC,移植后1周、2周、3周、4周和6周末取其脑组织,用免疫组织化学法测定神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞数,Western blotting法检测NSE蛋白表达情况。结果：与对照组相比, 放射性脑损伤组大鼠脑组织中NSE阳性细胞数显著下降(P<0.05);与放射性脑损伤组相比,NSC治疗组和转染VEGF的NSC治疗组在移植3周后NSE阳性细胞数明显增加(P<0.05), 与NSC治疗组比较,在移植6周末转染VEGF的NSC治疗组NSE的阳性细胞数增加更明显(P<0.05)。与放射性脑损伤组比,NSC治疗组和转染VEGF的NSC治疗组在移植3周末NSE蛋白表达量明显增加(P<0.05), 与NSC治疗组比较,在移植6周末转染VEGF的NSC组NSE蛋白表达量增加更明显(P<0.05)。结论：转染VEGF的NSC移植可提高放射性脑损伤组织中NSE的含量。     

EGF培养条件下NGF与BDNF对大鼠海马神经干细胞向神经元分化的差异

目的探讨在表皮生长因子(EGF)培养条件下,相同浓度神经生长因子(NGF)与脑源性神经生长因子(BDNF)对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化比例的差异。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、EGF、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单细胞克隆后行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1周,行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养液中所加营养因子的不同将单细胞克隆传代细胞分为5组培养:EGF组、NGF组、BDNF组、EGF+NGF组、EGF+BDNF组,此5组细胞培养1周,进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果:单细胞克隆培养后克隆球细胞表达Nestin,诱导分化1周,细胞表达NSE、GFAP;与EGF组、NGF组、BDNF组相比,EGF+NGF组和EGF+BDNF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+BDNF组细胞的比例最高。结论在EGF培养条件下,BDNF促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的能力高于NGF。     

丹酚酸B对骨髓间充质干细胞增殖和血管内皮生长因子表达的影响

目的 体外分离、培养和纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSC),并研究中药单体丹酚酸B对MSC增殖和分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法 用贴壁培养法分离、培养和纯化MSC.免疫荧光法检测细胞抗原CD44和CD34.用含不同浓度丹酚酸B的低糖DMEM培养液培养MSC 24 h后,用MTT法检测细胞增殖水平.RT-PCR检测培养24 h、48 h、72 h 后VEGF mRNA的表达.结果 获得纯化的MSC,免疫荧光检测细胞表面标记CD44呈阳性,CD34呈阴性.MTT结果 显示,0.3 mg/L和3 mg/L丹酚酸B均可促进MSC的增殖,与空白对照组差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05),而003 mg/L和30 mg/L丹酚酸B组细胞的增殖与空白对照组差异均无统计学意义(P>0.05).随着培养时间的增加,0.03、0.3、3和30 mg/L丹酚酸B均可明显促进VEGF mRNA的表达,与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),而空白对照组的VEGF mRNA表达无明显变化.结论 用贴壁培养法可获得纯化的MSC.丹酚酸B可促进MSC增殖和VEGF mRNA的表达.     

细胞因子对神经干细胞增殖和分化的影响

目的　建立人胎大脑神经干细胞 (NSCs)分离培养的体外培养系统 ,鉴定其干细胞原始特征 ,观察上皮细胞生长因子(EGF)、碱性纤维母细胞生长因子 (FGF2 )和脑源神经生长因子 (BDNF)对NSCs分裂和分化的影响。方法　在含EGF和 (或 )FGF2的培养体系中分离培养NSCs。用定量RT PCR法检测干细胞巢蛋白表达丰度 ,用PCR ELISA法检测端粒酶活性 ,PC NA用免疫细胞化学染色检测干细胞增殖特征以及不同代数分裂的干细胞的比率。免疫细胞化学法证实NSCs分化后神经元和星形胶质细胞的比例趋势 (NF 2 0 0、MAP 2、synaptophysin、NeuN和GFAP染色 )。 结果　NSCs大量增殖呈球体状 ,PCNA阳性率高达 (71 6± 4 9) %、干细胞巢蛋白阳性、端粒酶活性为 6 3%。不同诱导因子对NSCs球体内细胞增殖数差异有显著性(P <0 0 5 )。证实EGF和 (或 )FGF2在培养基质存在下均能诱导NSCs分化 ,脑源神经生长因子 (BDNF)能维持神经元的存活和生长。分化后的神经元比例可达 (18 6± 2 5 ) %。结论　EGF和 (或 )FGF2可诱导NSCs分裂增殖并保持原始特性 ,在培养基质存在条件下 ,这些细胞因子可诱导NSCs分化。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养及向血管内皮样细胞分化的研究

目的:研究人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外分离培养方法及在特定微环境下分化为血管内皮样细胞的潜能,可能为银屑病研究提供实验基础.方法:密度梯度离心法结合贴壁法分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),体外扩增培养并进行鉴定.加入血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导hMSCs向血管内皮细胞分化,流式细胞仪进行细胞表型鉴定,Dil-ac-LDL摄取实验鉴定血管内皮细胞功能.结果:经流式细胞仪测定分离培养的hMSCs CD71、CD44阳性表达,CD54、CDl06、CD45弱阳性表达,CD34、CD31、VWF、KDR、HLA-DR阴性表达;经bFGF、VEGF诱导后的hMSCs可见类似内皮细胞样改变,经流式细胞术检测,与对照组相比内皮细胞特异表面标志CD34、CD31、VWF、KDR表达转为阳性(P＜0.01),而HLA-DR、CD54、CDl06、CD45表达明显上调(P＜0.01);诱导分化后的内皮样细胞具有摄取Dil-ac-LDL的能力.结论:密度梯度离心法结合贴壁法可获得较纯的MSCs;在bFGF、VEGF诱导作用下,hMSCs具有向内皮细胞分化潜能,产生功能性内皮细胞.     

肝细胞生长因子促进人胚胎干细胞向神经前体细胞分化

目的:研究肝细胞生长因子(HGF)诱导人胚胎干细胞(hESCs)定向分化为神经前体细胞(NPs)的作用。方法:诱导拟胚体(EBs)生成,随机将EBs分为正常对照组、G5 supplement组、HGF组和HGF+G5 supple-ment组,悬浮培养诱导7d,转移至多聚赖氨酸/层黏连蛋白(20mg/L)包被的24孔培养板中继续培养7-10d。免疫荧光染色鉴定NPs和体外分化能力,流式细胞仪检测各组巢蛋白(nestin)阳性细胞的比例,RT-PCR检测音猥因子(Shh)对NPs的脑区标记基因表达的影响。结果:HGF+G5可诱导hESCs定向分化为NPs,HGF+G5组的nestin阳性的NPs比例(87.3%±3.9%)显著高于其它组(P0.05),NPs具有分化成神经元、少突和星形胶质细胞的能力;HGF+G5诱导时间对于NPs的分化有影响,7d时nestin+细胞比例达到最大;Shh可使NPs表达腹侧化基因,后脑标记表达上调,而前脑标记表达下调。结论:含HGF和G5的无血清神经分化体系可有效诱导hESCs神经分化,是研究神经诱导的良好体系。     

激活的星形胶质细胞分泌聚集素蛋白及其对海马神经干细胞向神经元分化的促进作用

目的 探讨切割穹隆海马伞的侧海马提取液“激活”的星形胶质细胞分泌聚集素蛋白（CLU）及体外CLU诱导海马神经干细胞分化为神经元的情况。
方法 分别用切割穹隆海马伞的海马提取液、正常海马提取液、DMEM/F12 培养基培养星形胶质细胞,制备切割12h、24h、48h组,正常组和对照组条件培养基;ELISA检测比较不同条件培养基中CLU蛋白的浓度;体外细胞培养采用CLU诱导海马神经干细胞分化,设诱导组和空白对照组,7d后通过微管相关蛋白2（MAP-2）免疫荧光及Hoechst标记观察海马神经干细胞向神经元的分化情况。 结果 正常组和对照组条件培养基中CLU浓度较低,约为（0.1037±0.0119）ng/L和（0.1170±0.0078）ng/L;切割组12h、24h、48h条件培养基中其浓度明显增高,分别为（0.1940±0.0364）ng/L、（0.4250±0.0724）ng/L和（0.2903±0.0472）ng/L,以24h组最高,约为正常组和对照组的4倍。CLU诱导组中MAP-2阳性细胞数明显高于空白对照组（P<0.05）,其占总细胞数的百分比分别为(11.67±2.57)%和（4.52±1.54）%,且诱导组中MAP-2阳性细胞突起更长、更丰富。 结论 切割穹隆海马伞侧海马提取液“激活”的星形胶质细胞可分泌更多的CLU,体外细胞培养中CLU可促进海马神经干细胞向成熟的神经元分化。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及血管内皮生长因子对其体外诱导分化作用

目的：分离和培养人骨髓间充质干细胞(mcsenchymal stem cells，MSCs)并检测其免疫学表型，探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VECF)对其体外诱导分化作用。方法：利用Pcreoll梯度分离、贴壁筛选法及单克隆培养法分离、培养、扩增MSCs；采用免疫荧光和流式细胞术检测MSCs免疫学表型；通过VFGF-165基因转染分析MSCs的表型变化。结果：体外分离、培养出高度同源性的MSCs；MSCs具有独特的细胞免疫学表型，即CD44，CD29，c-kit阳性，CD34，CD31，CD54阴性；VEGF-165诱导后CD44表达明显降低，CD31显著升高，MSCs向内皮分化。结论：成功建立人MSCs分离培养方法，探讨了MSCs细胞免疫学表型及VEGF对它的内皮诱导分化作用，为MSCs的应用提供理论基础。