血脑屏障上的药物转运体P-糖蛋白

血脑屏障(Blood-brain Barrier,简称BBB)是维护脑内环境稳态的重要功能单位,它不仅可以阻止血液中的有害物质进入脑组织,而且能够清除脑内的有毒代谢产物。BBB上表达的转运系统在积极转运营养物质入脑和选择性外排药物的两个方面均发挥了重要作用。其中P-糖蛋白由于自身结构功能的特异性和作用底物的广泛性而备受关注。本文主要论述了BBB上P-糖蛋白的特性、表达、转运底物及其体内外研究的进展情况。P-糖蛋白作为BBB的重要组成部分在中枢神经系统治疗药物的摄取、分布和排泄中发挥了越来越重要的作用。因此,对P-糖蛋白的研究将有助于阐明药物脑部转运机制,为增加药物的BBB通透性、提高脑内靶点药物浓度提供新的研究思路。     

血脑屏障上P-糖蛋白与耐药性癫痫关系的研究进展

耐药性癫痫是癫痫治疗的瓶颈。P-糖蛋白通过跨膜外排泵作用阻止抗癫痫药物由血脑屏障入脑发挥期望效应是耐药性癫痫产生的重要原因。本文介绍了耐药性癫痫与血脑屏障上P-糖蛋白的相互关系,对目前提出的调节P-糖蛋白功能,改善耐药性癫痫预后应注意的问题进行说明。安全地调节P-糖蛋白功能到适度可能为耐药性癫痫的治疗带来希望。     

P-糖蛋白结构及作用机制

ABC (ATP-binding cassette) 转运蛋白广泛存在于各种生物体细胞中,例如细菌的内层细胞浆膜和真核生物的细胞膜和细胞器膜.其利用与ATP的结合和水解供能进行底物的跨膜转运,其中一部分ABC转运蛋白能转运多种疏水性分子.P-糖蛋白隶属于ABC转运蛋白超家族,是研究最为透彻的一员,主要功能是防止机体对外来有害物质的摄入.P-糖蛋白(P-glycoprotein)由4 个基本结构域组成,2 个跨膜区和2 个位于细胞浆内的核苷酸结合区.核苷酸结合区参与ATP的结合和水解,而各由6 个α 跨膜螺旋组成的2个跨膜区联合构成了底物跨膜转运的通道.P 糖蛋白能转运多种不同结构的底物,包括脂类、胆汁酸、多肽和外源性化学物质,这对机体的生存至关重要,但同时也存在不利的一面,包括干扰了药物的运输,从而导致了多药耐药现象的产生.本文就P-糖蛋白的分子结构和作用机制的最新研究进展进行综述.     

P-糖蛋白的细胞内转运及表达调控

肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)的发生多与P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)过度表达相关。作为一种糖蛋白,P-糖蛋白在内质网中合成、折叠,然后转运到高尔基体进行加工、修饰,最终定位于细胞膜,且只有定位于细胞膜的P-糖蛋白才与肿瘤多药耐药的产生相关。P-糖蛋白的表达与多种信号通路如MAPK、Wnt/β-catenin、PKC、NF-κB有关。研究证实,还有多种miRNA与肿瘤多药耐药的发生相关。本文综述了P-糖蛋白的细胞内转运过程及P-糖蛋白表达相关信号通路的研究进展,为以P-糖蛋白为靶标的肿瘤多药耐药逆转剂提供新的研究策略。     

跨血脑屏障药物转运的研究进展

血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)的存在成为人们治疗中枢神经系统疾病(Central nervous system,CNS)所面临的一道难题,因为基本上100%的大分子药物及大于98%的小分子药物均无法穿过血脑屏障.因此,如何使CNS药物跨越血脑屏障从血液进入脑内且发挥药效成为解决难题的关键所在.如今一些借助内源性BBB运载体使药物转运入脑的技术发展起来.并处于实验研究和临床试验阶段,例如借助载体介导的转运系统、受体介导的转运系统的药物治疗策略,以及纳米技术的运用等,都有着良好的应用前景.这些新发现及新技术将为跨血脑屏障药物转运的研究提供新思路.并有望实现对CNS疾病患者的成功治疗.     

姜黄素通过下调P-糖蛋白和热休克蛋白70逆转耐热肝癌细胞的阿霉素耐受性

探讨姜黄素对耐热肝癌细胞 (HepG2/TT) 阿霉素耐受性的逆转作用及其机制．用MTT检测细胞活力,PI染色流式细胞术检测细胞凋亡,高效液相色谱法检测细胞内阿霉素的积累,Western blot检测细胞P-糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp)、热休克蛋白70 (heat shock protein 70, Hsp70) 和caspase-3 的表达．耐热肝癌细胞HepG2/TT能耐受阿霉素引起的细胞毒性和 凋亡;姜黄素在5、10和20 μmol/L时,能浓度依赖性地降低阿霉素对HepG2/TT 细胞的IC50,增强阿霉素对HepG2/TT 细胞的凋亡诱导作用．耐热肝癌细胞HepG2/TT 与非耐热肝癌细胞HepG2比较,其P-gp和Hsp70 的表达水平明显增高; 10 μmol/L姜黄素处理24 h 后,HepG2/TT细胞P-gp和Hsp70的表达水平显著下降．HepG2/TT 细胞内阿霉素的积累低于HepG2细胞;10 μmol/L姜黄素处理 3 h后,HepG2/TT 细胞内阿霉素的积累明显增加．HepG2/TT细胞能抑制阿霉素激活 caspase-3;10 μmol/L姜黄素处理24 h后,阿霉素对 HepG2/TT细胞caspase-3的激活作用增强．上述结果表明,姜黄素能逆转耐热肝癌细胞HepG2/TT的阿霉素耐受性,其机制可能与其下调P-gp和Hsp70的表达,进而促进阿霉素激活caspase-3 有关．     

大鼠脑组织中P-糖蛋白的免疫印迹检测方法

目的:确定蛋白免疫印迹检测大鼠脑组织中P-糖蛋白的最佳实验条件。方法:将成年雄性Wistar大鼠随机分为正常组和模型组。模型组分八个时间点,采用反复夹闭颈总动脉辅以硝普钠降压的方法制备脑缺血再灌注模型。正常组直接断头取脑分别进行组织匀浆和提取微血管,而模型组断头取脑均提取微血管,利用蛋白免疫印迹检测大鼠脑内P-糖蛋白的表达水平。结果:最佳实验条件是:提取微血管,用裂解液C冰上裂解30min,然后40000g离心30min留上清,蛋白定量后在5*上样缓冲液中25℃处理30min。而模型组各时间点P-糖蛋白的表达量随时间的延长逐渐增多。结论:利用提取脑微血管的方法在上述实验条件下进行P-糖蛋白的检测方便、可行,明显优于脑组织匀浆;并且在脑缺血再灌注这种病理状态下脑组织内P-糖蛋白的表达呈现一定的时序特征。     

P-糖蛋白的研究进展

P-糖蛋白是一类能量依赖性的转运蛋白,能将许多结构不同的化合物逆向转运出细胞.P-糖蛋白的过表达与肿瘤细胞的多药耐药性(Multidrug Resistance,MDR)密切相关,是导致肿瘤化疗失败的主要原因.随着对MDR机制认识的深入,已针对P-糖蛋白的结构设计出多种形式的MDR逆转药物.近年研究发现,P-糖蛋白广泛存在于正常的组织和器官,参与药物和内、外源毒素的吸收、分布和排泄,行使解毒和防御保护的功能.因此,通过转植P-糖蛋白基因可有效地降低经济鱼类、虾等水产品和经济作物中有毒污染物的积累,对保护人类健康将有着积极意义.     

剑尾鱼P-糖蛋白基因全长cDNA克隆、分析及组织分布

P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)为ABC转运体超家族的主要成员,分布于细胞膜,依赖ATP供能,可将细胞内的亲脂性毒物或药物逆浓度泵出胞外,在机体解毒上具重要功能。研究采用RT-PCR和RACE法对剑尾鱼P-gp基因进行克隆并获得了全长cDNA序列4301 bp,该基因编码1286个氨基酸残基,估算编码蛋白的分子质量为141.64 kD。生物信息学分析表明,剑尾鱼P-gp不含信号肽序列,具ATP转运家族蛋白的典型结构域,包括2个疏水性的跨膜区(Transmembrane domains, TMD)和2个位于细胞浆内的核苷酸结合区(Nucleotide-binding domains, NBD),为全转运子,每个跨膜区都有6个跨膜α螺旋,而每个NBD包含1个ABC转运体家族标记序列;跨膜性质预测结果显示该蛋白属膜蛋白,具P-gp的典型特征。序列同源性分析发现,不同进化地位动物P-gp存在高度同源性,显示P-gp在系统进化上高度保守。P-gp在剑尾鱼肝脏、肾脏、脑等不同组织均有表达,其中以肝脏的相对表达量最高,是P-gp检测的代表组织。QRT-PCR实验表明,苯并(a)芘胁迫可明显诱导P-gp mRNA的表达。剑尾鱼P-gp的表达水平或可作为一个生物标记物指标,应用于环境持久性有机污染物的监测研究中。     

小鼠肠道微生物群对血脑屏障通透性的影响

血脑屏障可控制循环系统和脑之间的物质进出及分子、营养物质交换,保障了中枢神经系统内环境的稳定。完善的血脑屏障是脑发育和功能的关键。但血脑屏障通透性改变的确切机制尚不清楚。近期,瑞典卡罗林斯卡学院的Braniste等研究者提出血脑屏障通透性可能受小鼠肠道微生物群的影响。紧密连接蛋白Occludin及Claudin-5在上皮组织调节屏障功能。研究人员将胚期的无菌的小鼠和携带有正常肠道菌群的     

大鼠脑微血管内皮细胞培养及其药物转运体Oatp2和P-gp的表达

贴块法培养脑微血管内皮细胞(BMECs),倒置显微镜动态观察细胞生长及形态,Ⅷ因子相关抗原、CD34免疫细胞化学联合鉴定细胞并确定纯度。免疫细胞化学和Western印迹法检测药物转运体有机阴离子转运多肽亚型2(Oatp2)及P-糖蛋白(P-gp)在培养内皮细胞上的表达。结果显示,获得的BMECs呈多角形或铺路石形,单层贴壁生长;培养细胞Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学、CD34免疫荧光染色均为阳性,细胞纯度90%;培养细胞有Oatp2及P-gp表达,且二者均主要表达于BMECs细胞膜。提示贴块法可获得原代培养BMECs,方法简便易行,细胞纯度较高。原代培养的BMECs上有药物转运体Oatp2及P-gp的表达,为血脑屏障上药物转运体的体外研究提供了可能途径。     

胶质细胞源性神经营养因子(△N39)-R9神经营养活性和透过血脑屏障的研究

为了研究胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在中枢神经系统疾病中的治疗应用,运用基因突变、蛋白质融合表达和蛋白质纯化技术获得分子质量较小的GDNF(△N39)活性片段.将HIV-1 Tat蛋白转导区(protein transduction domain,PTD)的9个碱性氨基酸49RKKRRQRRR57模拟物9个精氨酸(R9)与GDNF(△N39)活性片段融合表达,获得纯度达95%以上的GDNF(△N39)-R9融合蛋白.将GDNF、GDNF(△N39)、GDNF(△N39)-R9分别加入原代培养的中脑多巴胺能神经元和转染GDNF受体GFRαl和Ret的PC12细胞中,观察它们的神经营养活性和毒性.运用脑微血管内皮细胞株B-Endo 3,观察GDNF(△N39)-R9蛋白穿越血管内皮细胞膜的功能;运用脑血管内皮细胞和Matrigel铺板模拟血脑屏障,Transwell法检测Tat-GDNF(△N39)蛋白穿越脑血管内皮细胞和外周胶质膜的能力.结果显示:GDNF(△N39)-R9蛋白具有类似GDNF的神经营养活性,促进原代培养的中脑多巴胺能神经元和稳定表达GFRα1和Ret受体的PC12-GFRα1-Ret细胞株的存活,没有显示毒性,并且能很好地穿过脑微血管内皮细胞层和模拟的血脑屏障.     

胶质细胞源性神经营养因子(ΔN39)-R9神经营养活性和透过血脑屏障的研究

为了研究胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF) 在中枢神经系统疾病中的治疗应用,运用基因突变、蛋白质融合表达和蛋白质纯化技术获得分子质量较小的GDNF(ΔN39)活性片段. 将HIV-1 Tat 蛋白转导区 (protein transduction domain,PTD) 的9个碱性氨基酸⁴⁹RKKRRQRRR⁵⁷模拟物9个精氨酸(R9)与GDNF(ΔN39)活性片段融合表达,获得纯度达95%以上的GDNF(ΔN39)-R9融合蛋白. 将GDNF、GDNF(ΔN39)、GDNF(ΔN39)-R9分别加入原代培养的中脑多巴胺能神经元和转染GDNF受体GFRα1和Ret的PC12细胞中,观察它们的神经营养活性和毒性. 运用脑微血管内皮细胞株B-Endo 3,观察GDNF(ΔN39)-R9蛋白穿越血管内皮细胞膜的功能;运用脑血管内皮细胞和Matrigel铺板模拟血脑屏障,Transwell法检测Tat-GDNF(ΔN39)蛋白穿越脑血管内皮细胞和外周胶质膜的能力. 结果显示：GDNF(ΔN39)-R9蛋白具有类似GDNF的神经营养活性,促进原代培养的中脑多巴胺能神经元和稳定表达GFRα1和Ret受体的PC12-GFRα1-Ret细胞株的存活,没有显示毒性,并且能很好地穿过脑微血管内皮细胞层和模拟的血脑屏障.     

基质金属蛋白酶与中枢神经系统感染

基质金属蛋白酶(MMPs)是一组合锌的能降解细胞外基质的中性蛋白酶家族.目前认为MMPs尤其是明胶酶(MMP-2,MMP-9)与中枢神经系统感染关系密切.通常它们以酶原的形式存在,一旦活化,则迅速攻击血脑屏障,降解基底膜的一些基质蛋白,破坏内皮细胞的紧密连接蛋白,促进脑水肿的形成和炎细胞的浸润.近年来研究发现,中枢神经系统感染后MMPs表达增加.导致血脑屏障损害及血管源性脑水肿,并参与中枢神经系统免疫反应,促进感染的病理生理过程.