HRM法检测结直肠癌组织KRAS基因密码子12和13点突变

目的 建立HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突变的方法 .方法 采用HRM法对含不同比例KRAS基因突变型质粒的系列混合样本进行检测,以评价其灵敏度.应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况,并与直接测序法的结果 进行比较分析.结果 HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解,即可获得检测结果 .HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10%的突变,其检测灵敏度达10%.HRM法从60份大肠癌患者组织标本中,检出17份KRAS基因密码子12或13突变(28.3%);直接测序法检出15份(25.0%)突变,2份未检出KRAS基因突变.HRM法检测的敏感度为100%(15/15),特异度为96%(43/45).结论 HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时,具有操作简便、快速、灵敏,单管避免污染等优点,完全符合临床个体化治疗的要求,值得推广.     

基于下一代测序平台的结直肠癌KRAS基因检测

目的 基于下一代测序技术,检测和分析结直肠癌KRAS基因的突变情况,以及评估其应用于临床分子诊断中的可行性.方法 应用Ion Proton半导体测序仪,检测108例结直肠癌患者的石蜡包埋组织样本的KRAS基因突变情况,并与作为金标准的一代测序检测结果进行对比.结果 下一代测序检测结果与一代测序检测结果基本一致,符合率为94％,灵敏度高达100％.结论 通过对108例临床样本的检测分析后,该下一代测序检测方法可用于检测结直肠癌KRAS基因突变情况.     

肺癌患者EGFR及KRAS基因突变检测方法的建立和临床应用

目的 本研究拟在评估二代测序(next generation sequencing,NGS)技术在肺癌临床分子诊断中应用的可行性. 方法 本研究选取108例肺癌石蜡包埋样本(formalin fixed paraffin embedded,FFPE),同时进行一代测序(sanger sequencing)和NGS检测样本中EGFR和KRAS基因的突变情况. 结果 在108例肺癌样本中,一代测序检出突变在二代测序中均检出,另外NGS还检测出目标区域外其他突变. 结论 NGS的检测准确性可达到100％.NGS可以应用于肺癌临床分子诊断,同时NGS能给临床提供更详细的基因突变信息,为分子靶向治疗提供依据,更具有市场潜力及应用前景.     

高分辨率熔解曲线分析法检测非小细胞肺癌KRAS和BRAF基因突变

目的探讨高分辨率熔解曲线分析(HRM)法检测非小细胞肺癌(NSCLC)中KRAS和BRAF基因突变用于临床检测的可行性。方法用HRM法检测64例NSCLC患者KRAS基因第2外显子和BRAF基因第15外显子的突变情况,用直接测序法对结果进行验证。结果 HRM法检测结果表明有9例NSCLC患者发生KRAS基因突变(14.06%)、4例发生BRAF基因突变(6.25%),直接测序法证实两法的结果完全一致;共检测出4种KRAS基因突变类型,G12C(GGT>TGT)的突变率最高(44.4%),BRAF基因突变型均为V600E。结论用HRM法检测临床样本KRAS和BRAF基因突变,具有操作简便、结果准确、成本低的优点,适用于临床检测。     

胰腺癌中EGFR、KRAS、BRAF基因突变状况分析及意义

目的:检测胰腺癌组织EGFR、KRAS、BRAF基因突变状况,为胰腺癌EGFR靶向治疗研究奠定基础.方法:提取胰腺癌及胰腺良性病变石蜡组织切片中基因组DNA,PCR扩增EGFR 18、19、21外显子片段,KRAS2、3外显子片段,BRAF15外显子片段,采用直接测序法检测其突变状况.结果:32例胰腺癌患者中有24例患者存在KRAS基因突变,10例良性病变组织均未发现突变,两者差异具有统计学意义(x2=14.57,P=1.35× 10-4),其中22例12密码子突变(G12D14例,G12V8例);2例61密码子突变(Q61L).所有检测样本中未见BRAF突变.共3例EGFR突变,其中包括1例19外显子突变(de1746-750),2例21外显子突变(L858R),10例良性病变组织未见突变.结论:在胰腺癌中KRAS基因突变可能为EGFR通路失调的主要原因,其次是EGFR突变,BRAF突变未见.     

某地区结直肠癌患者KRAS基因及BRAF基因突变状态的检测分析

目的 检测某地区结直肠癌患者KRAS基因和BRAF基因的突变状态及其与年龄、性别的关系.方法 由某地区30例结直肠癌患者石蜡组织中提取DNA,通过直接测序法及荧光定量PCR法检测KRAS基因及BRAF基因突变状态.结果 KRAS基因突变率为43.3%,共发现6种突变类型,主要位于12、13密码子,其中以c.38G>A突变率最高(38.5%).单因素及多因素分析均提示KRAS突变与年龄或性别无相关性.BRAF基因突变率为0.结论 某地区结直肠癌患者KRAS基因突变率高,靶向治疗前进行突变状态检测具有重要临床价值.     

同时性结直肠癌原发灶和肝转移灶中KRAS基因突变的一致性分析

目的:比较KRAS基因突变率在结直肠癌原发灶和肝转移灶之间的差异,并探索KRAS突变对初始可切除同时性结直肠癌肝转移患者同期切除术后预后的影响。方法:回顾性分析同期切除的139例同时性结直肠癌肝转移患者的临床病理资料。运用Pyrosequencing焦磷酸测序法检测原发灶和转移灶中KRAS基因的突变情况,比较两者之间KRAS突变率的差异;同时采用Kaplan-Meier生存分析和Cox回归模型分析KRAS突变对预后的影响。结果:139例患者的围手术期死亡率为0%,并发症发生率为28.1%。28.8%(40/139)的患者原发灶中KRAS发生了突变;KRAS突变和临床病理因素无明显相关性。KRAS突变率在原发灶中为29.5%(28/95),在转移灶中为31.6%(30/95),两者间差异无显著统计学意义(P=0.157)。KRAS突变与总生存时间无相关性,与较短的无疾病生存时间相关(P=0.041),且是短的无疾病生存时间的独立预后因素(P=0.012)。结论:KRAS突变率在原发灶和转移灶中存在高度一致性,且与短的无疾病生存时间相关,在决定同期手术决策时需要考虑KRAS状态。     

KRAS基因突变高分辨率熔解曲线检测技术参数的优化

目的建立KRAS基因突变高分辨率熔解曲线分析法(high resolution melting,HRM)检测方法,确立最佳反应体系和反应条件,为将此技术用于临床基因突变的快速检测奠定基础。方法根据引物Tm值设立退火温度梯度,确定适宜的退火温度。利用正交实验,对影响实时荧光定量PCR(qPCR)-HRM反应体系的模板DNA、Mg2+、引物等3种主要因素进行优化。通过对SW480和MDA-MB-231细胞基因组DNA进行HRM分析检测突变,并直接测序验证,观察反应体系和反应条件的可行性。结果引物最适退火温度为60.8℃。KRAS基因突变qPCR-HRM最佳反应体系为:20μl qPCR-HRM反应体系中,引物浓度为0.5μmol/L,Mg2+为2.5mmol/L,模板DNA为40ng。优化的qPCR-HRM反应体系和反应条件能检测基因突变,和直接测序结果一致。结论采用正交实验优化的qPCR-HRM反应体系,操作简便,电泳条带清晰,熔解曲线峰型单一,特异性好,结果准确可靠,可为进一步建立HRM技术检测基因突变的临床应用提供借鉴。     

HRM筛查PROC基因突变方法的建立和应用

目的 利用高分辨率熔解曲线(HRM)结合PCR技术,建立遗传性蛋白C缺陷症患者的蛋白C基基因(PROC)突变筛查方法.方法 收集仁济医院2010年4月～2011年6月收治的9例蛋白C缺陷的静脉血栓患者(经测序PROC基因均已知)及其6例确认有PROC基因缺陷的患者家属DNA标本,通过设计HRM引物,用已知PROC突变的DNA标本进行构建,建立PROC基因外显子1,2,3,7,8突变HRM筛查方法.同时对3例疑似PROC基因缺陷患者,进行该方法的验证.结果 PROC基因外显子1,2,7,8区,突变体与野生型通过HRM图形可进行区分.对3例疑似PROC基因缺陷标本,HRM均筛查出突变,经测序2例为相同外显子7区杂合突变c.565C＞T,合并外显子2区杂合同义突变c.66T＞C,另1例为外显子7区杂合缺失c.577～579del,合并外显子1区多态性位点rs1799810 A＞T.综合统计15例已知标本和3例验证标本,HRM对于PROC基因外显子1,2,7,8区准确度分别为100％,94.4％,100％和91.7％.外显子3区由于缺乏突变病例,无法构建,改为直接测序法.结论 该研究建立了HRM结合直接测序法筛查PROC基因变异的方法.该方法能较快速、方便、经济地筛查PROC变异,适用于遗传性PC缺陷症基因诊断.     

甲基化敏感性高分辨率熔解曲线检测结直肠癌组织及外周血MGMT基因甲基化

目的用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法(MS-HRM)定量检测结直肠癌组织及外周血中MGMT基因甲基化水平,并结合结直肠癌病理参数分析探讨MGMT基因甲基化的临床意义。方法以33例结直肠癌组织和配对的正常黏膜组织以及其中16例患者的外周血为研究对象,用MS-HRM进行MGMT基因甲基化检测,分析MGMT基因甲基化与结直肠癌临床病理特征的关系和MS-HRM的方法特点。结果 MS-HRM从33例结直肠癌患者的癌组织中检测到12例(36.4%)MGMT基因启动子不同程度的甲基化(甲基化5%1例,5%~10%3例,10%~25%3例,25%~50%2例,50%~75%3例),对应的正常结直肠组织中仅检测到甲基化5%1例(3.0%)。16例外周血中检测到甲基化小于5%3例(18.8%)。MGMT基因甲基化与患者的年龄、性别、肿瘤部位无相关性(P0.05),但与结直肠癌的病理分期和分化程度的相关性有统计学意义(P0.05)。结论 MS-HRM可定量检测结直肠癌MGMT甲基化水平。MGMT基因甲基化与结直肠癌的进展评估有关。     

高分辨熔解曲线技术在筛查21羟化酶缺乏症患者热点基因突变中的临床应用价值

目的 探讨利用高分辨熔解曲线技术对21羟化酶缺乏症患者中致病基因热点突变筛查的可行性及临床应用价值.方法 针对CYP21A2基因上的4个热点突变c.293-13A/C>G(I2G)、c.518T>A(p.I173N)、c.955C>T(p.Q319X)及c.1069C>T(p.R357W)设计相应的特异性引物,应用高分...     

非小细胞肺癌EGFR和KRAS基因突变和临床病理特征分析

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中表皮生长因子受体(EGFR)和鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)突变状态及其与临床病理特征的关系.方法 回顾性收集2019年1月至2021年6月首都医科大学大兴教学医院183例病理确诊NSCLC患者临床病理资料,采用扩增阻滞突变系统(ARMS)法检测肿瘤组织中EGFR和KRAS基因的突...     

MS-HRM检测结直肠癌患者外周血AKAP12基因及其临床意义

目的 探讨MS-HRM法定量检测结直肠癌患者外周血中AKAP12基因甲基化程度及其临床意义.方法 采用MS-HRM法定量检测80例结直肠癌患者和20名健康人外周血中AKAP12基因的甲基化水平,并分析评价其与病理分期分级的关系.同时对MS-HRM法的重复性和与传统MSP法检测的灵敏度和检出率进行比较.结果 MS-HRM法从80例结直肠癌患者中检测到38例(47.5%)AKAP12基因启动子区域不同程度的甲基化患者(甲基化1%～20%的24例,20%～60%的12例,60%～100%的2例),20名健康人中仅检测到甲基化<10%的2名.MS-HRM法检测AKAP12基因甲基化的灵敏度(1%)优于传统的MSP法(10%).AKAP12基因甲基化水平与结直肠癌患者的年龄、性别的差异无统计学意义(x2分别为3.13、1.70,P均>0.05),但与结直肠癌的Dukes分期和分化程度的差异均有统计学意义(x2分别为5.93、8.41,P均=0.01).结论 外周血MS-HRM定量检测AKAP12基因甲基化程度的方法比传统MSP法灵敏度更高,AKAP12基因甲基化有望成为结直肠癌进展评估的分子指标.     

Cetuximab in the treatment of patients with colorectal cancer

Introduction: Cetuximab is a chimeric mAb with avidity for the EGFR higher than that of the natural ligands of the receptor. Preclinical studies showed that cetuximab demonstrated synergy with topoisomerase I inhibitors in the treatment of human colorectal cancer (CRC) cell lines in vivo. Subsequent clinical trials have shown that cetuximab can reverse resistance to topoisomerase I inhibitors in addition to having modest monotherapy activity. These studies led to accelerated provisional FDA approval of the drug for the treatment of patients with irinotecan-refractory metastatic CRC. Its clinical utility has been improved with the discovery of negative predictive biomarkers; these have shown that there is a lack of cetuximab benefit for patients whose tumors generally harbor a KRAS mutation, thus sparing these patients the toxicity of the agent which would not be of treatment benefit.

Areas covered: This review covers the last decade of clinical trials that have determined the toxicity and efficacy of cetuximab when given to patients with CRC, as well as some of the molecular subgroups tumors from patients with CRC who appear to not derive benefit from this mAb.

Expert opinion: Cetuximab has modest single-agent efficacy in the treatment of patients with metastatic CRC whose tumors do not harbor a KRAS mutation. In combination with irinotecan, it is associated with an overall survival (OS) and progression-free survival (PFS) advantage in first-line therapy in patients with KRAS non mutant metastatic CRC; it can be combined with irinotecan to overcome resistance in patients with KRAS non mutant CRC who have previously progressed on prior irinotecan chemotherapy. Future studies of putative biomarkers are likely to give additional information to clearly define which patients with metastatic CRC receive therapeutic benefit from cetuximab and other monoclonal anti-EGFR therapies.     

高分辨率熔解曲线技术及其在分子诊断中的应用进展

高分辨率熔解曲线是根据核酸的特性,无需使用序列特异性探针,利用一种饱和染料,对PCR反应产物进行基因分析的一种技术。由于该技术操作简单、快速,所以广泛应用于基因分型、重复序列分析、甲基化分析、点突变筛查和RNA编辑等。与现有的基因分析方法相比,具有便宜、灵敏、特异性高、高通量的优势。在该文中,对高分辨率熔解曲线近年来在临床应用和研究进展进行了综述。