显微注射技术制备转基因豚鼠早期胚胎的初步探讨

目的：应用显微注射方法生成转基因豚鼠。方法：将外源DNA注射到用人工注射性激素超排卵诱导的豚鼠受精卵内，体外培养数小时后移植到假孕母鼠输卵管中使其体内发育，发育到第7天处死假孕母鼠，回收早期胚胎观察其存活情况。结果：显微注射成功率达85%；早期胚胎存活率低（15个中仅2个存活）。结论：显微注射技术是一种简便、可重复性的好方法。要常规生成转基因豚鼠还需进一步研究。     

SD大鼠超排及TALEN质粒显微注射构建基因敲除大鼠

目的 应用TALEN技术构建基因敲除大鼠,并探讨SD大鼠超数排卵、显微注射浓度、胚胎移植方式对构建大鼠出生率、阳性率的影响.方法 将SD雌鼠超数排卵后,取受精卵显微注射由TALEN质粒体外转录成的mRNA,注射后存活的受精卵输卵管移植,观察大鼠的出生率,并测序判定出生大鼠的基因敲除阳性率.结果 4～5周和5～6周的雌鼠超数排卵见栓率[（74±9）％vs（77±6％）％]、取卵数量[（25±2）枚vs （23±2）枚]以及卵的受精率[（85±2）％vs（93±2）％]差异均无统计学意义（P＞0.05）;结扎公鼠和受体雌鼠在8～10周时见栓率最高[（23.02±5.26％）％],使用12周后见栓率明显下降[（11.66±2.40）％];单侧和双侧输卵管移植大鼠出生率差异无统计学意义（37.88％ vs 36.49％）,但单侧移植大鼠存活率高于双侧移植（37.88％ vs 20.27％,P＜0.05）,且单细胞移植大鼠出生率显著高于双细胞移植.质粒注射浓度在20 ng/μl组大鼠基因敲除阳性率最高（7.5％）.结论 应用TALEN技术成功构建基因敲除大鼠,显微注射质粒浓度20 ng/μl时大鼠出生率不受影响且基因敲除阳性率最高.     

体外受精与卵细胞内单精显微注射后受精和胚胎质量的比较

目的 评估 ICSI与 IVF后的卵子受精和胚胎发育,了解不明原因不孕的病人在同一治疗周期中,通过 ICSI受精的胚胎是否较 IVF更好。方法 将 30例不明原因不孕的病人同一周期的卵子随机分为两组,分别行 ICSI和 IVF授精,比较各组间卵子的受精和胚胎质量。结果 不明原因不孕中 IVF授精后发生受精障碍 3例,占 10％ (3/30),而 ICSI授精后无受精障碍发生; ICSI授精组与 IVF授精组比较,卵子受精率无明显差异,而 a类胚胎率差异显著 (P     

SD大鼠超排卵及胚胎冷冻方法比较

目的优化超排卵效果及建立大鼠胚胎冷冻方法。方法腹腔注射三种不同剂量PMSG—HCG（15IU／只、20IU／只、25IU／只）超排5周龄SD大鼠，当日与正常雄鼠1：1合笼交配，比较三种激素剂量的超排卵效果。应用输卵管吹卵法收集2-细胞胚胎，采用小鼠胚胎冷冻方法对大鼠胚胎进行冷冻，通过胚胎复苏率比较不同冷冻时间（方法Ⅰ：5min，方法Ⅱ：1min）的冷冻效果。结果采用三种剂量进行超排分别获得13±12．7、31±14．2、41±25．4枚胚胎，其中激素剂量25IU／只超排效果最好；方法Ⅱ在操作简便性上明显优于方法Ⅰ，但冷冻效果无显著性差异（平均复苏率88．3％与85．0％）。采用方法Ⅱ冻存大鼠胚胎总计152枚，复苏后形态正常胚胎共计139枚（91．44％），培养20min后，对存活胚胎共计105枚（75．53％）进行胚胎移植，产仔39只（37．14％）。结论成功优化大鼠超排及建立大鼠胚胎冷冻方法。     

小鼠胚胎显微操作针的制备方法

本文结合我们自己制备用于小鼠胚胎显微操作的持卵针(holding pipette)和注射针(injection pipette)的经验,介绍其制备的一些方法和技巧.     

小鼠受精卵显微注射影响因素的体外研究

目的:利用体外培养探讨受精卵显微注射的影响因素的作用。方法:获取小鼠受精卵,在其他条件固定的情况下,分别比较不同的注射基因浓度,在CZB(加HEPES)操作液中显微操作时间以及注射前受精卵的质量对显微注射后的胚胎体外培养结果的影响。结果:基因浓度越高,受精卵发育越差,操作时间不同的卵发育无明显差异,质量好的受精卵发育较好,质量差的几乎不发育。结论:选用较低的基因浓度,良好的操作介质CZB(加HEPES),使用质量好的受精卵,会提高显微注射的效率。     

转基因显微注射的剂量控制与效果分析

为了分析转基因显微注射的注射剂量对胚胎发育效果的影响，用尖端直径为0.5～1.0um的显微注射针在不同气压和不同时间的条件下进行微注射测试，并对133枚小鼠受精卵分别注射不同剂量，观察注射后胚胎发充情况。实验采用的气压电控式显微注射器，具有注射时间短(msec)，注射的可控性和可重复性好的特点，在相同条件下重复注射时，误差小于0.004pl。结果表明．小鼠受精卵原核内注射剂量在2～4pl时．胚胎体外发育不受影响，当大于10pl时，胚胎在注射后1h内全部死亡．也证明了注射针尖端直径小于1．0um时，导致细胞损伤和影响胚胎发育的主要因素是注射剂量的大小。因此，对于小鼠肛胎原核内注射剂量2-4pl是较为合适的“安全剂量”.     

SD大鼠超排卯及胚胎冷冻方法比较

目的 优化超排卵效果及建立大鼠胚胎冷冻方法.方法 腹腔注射三种不同剂量PMSGHCG(15 IU/只、20 IU/只、25 IU/只)超排5周龄SD大鼠,当日与正常雄鼠1:1合笼交配,比较三种激素剂量的超排卵效果.应用输卵管吹卵法收集2-细胞胚胎,采用小鼠胚胎冷冻方法对大鼠胚胎进行冷冻,通过胚胎复苏率比较不同冷冻时间(方法Ⅰ:5min,方法Ⅱ:1 min)的冷冻效果.结果 采用三种剂量进行超排分别获得13±12.7、31±14.2、41±25.4枚胚胎,其中激素剂量25 IU/只超排效果最好;方法Ⅱ在操作简便性上明显优于方法Ⅰ,但冷冻效果无显著性差异(平均复苏率88.3%与85.0%).采用方法Ⅱ冻存大鼠胚胎总计152枚,复苏后形态正常胚胎共计139枚(91.44%),培养20min后,对存活胚胎共计105枚(75.53%)进行胚胎移植,产仔39只(37.14%).结论 成功优化大鼠超排及建立大鼠胚胎冷冻方法.     

显微注射法建成HLA-B27转基因大鼠

目的 构建带HLA-B27基因的转基因大鼠,进一步研究HLA-B27 与强直性脊柱炎(AS)的发病原因及其机理.方法 应用转基因技术,把已克隆的人类AS基因HLA-B27基因组DNA导入Wistar大鼠受精卵中,并移植到假孕母鼠输卵管内,21 d后,出生27只原代大鼠.结果 经过PCR检测阳性后,再继续进行Southern印迹分析,确认3只大鼠为带HLA-B27基因转基因大鼠,整合率为11.11 %,其中1只转基因大鼠出现外周关节炎及脊柱强直表现.结论 本研究进一步表明HLA-B27 与AS的强相关性,为研究AS病因病理及治疗打下了基础.     

卵母细胞第一极体形态与卵胞浆内单精子显微注射受精率和胚胎质量的关系

目的:了解人卵母细胞第一极体形态与卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)后正常受精率、卵裂率和优质胚胎率的关系。方法:选择行ICSI治疗的110个周期中1017枚人卵母细胞。将卵母细胞第一极体分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种类型,采用3种来源的精子[手淫取精精子、附睾穿刺/睾丸活检(PESA/TESA)取精精子、冷冻精液精子]授精。ICSI操作后,了解各型第一极体卵母细胞受精率、卵裂率和优质胚胎率。结果:手淫取精患者:各型第一极体卵母细胞正常受精率和卵裂率比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中Ⅲ、Ⅳ型正常受精率低于Ⅰ和Ⅱ型,Ⅱ型卵裂率低于Ⅰ和Ⅲ型。PESA/TESA取精患者:各型第一极体卵母细胞正常受精率和取卵后第3天优质胚胎率比较,差异有统计学意义(χ2=8.488和6.789,P=0.044和0.034),Ⅰ型正常受精率低于Ⅱ和Ⅲ型,Ⅰ和Ⅲ型第3天优质胚胎率高于Ⅱ型。冷冻精液取精患者各指标比较,差异无统计学意义。结论:排除精子来源对受精的影响,正常受精可能和卵母细胞第一极体形态有关。     

显微注射法制备转基因小鼠的技术研究

应用形态学方法,观察１９例太行山猕猴颅骨的非测量性状,观察形态指标达８０项。结果表明,颅形以楔形为主（出现率为５２．９４％）,其次为盾形（３５．２９％）;眼眶多为圆形（６３．１６％）;枕骨大孔的形状变异较大;矢状缝各段均以愈合形出现率较高,冠状缝和人字缝各段主要形态为微波形;额中缝出现率较低（２６．３２％）。     

两种早期心衰大鼠模型的建立和心功能的比较

目的比较两种不同方法建立大鼠心衰模型心功能的特点,寻找大鼠模型早期心衰阶段。方法用冠脉结扎法及腹主动脉结扎法建立不同的心衰模型,用血流动力学及心脏称重的方法比较其心功能的各项指标。结果冠脉结扎组术后2周没有心功能的改变,2周后收缩和舒张功能均下降,4周达最低。腹主动脉结扎组术后14周没有心功能的下降,16周出现了舒张功能的衰竭。结论冠脉结扎法及腹主动脉结扎法均可以造成早期心衰,冠脉结扎法术后2周为早期心衰阶段,2周后同时出现收缩和舒张功能衰竭,腹主动脉结扎法术后14周为早期心衰阶段,14周后出现了舒张功能衰竭。     

蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细胞毒性的实验研究

目的研究不同蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细袍的毒性及其影响细胞增殖的因素。方法采用组织块培养法体外原代培养鼠胚表皮细胞，用直接接触法和浸提液法体外培养鼠胚表皮细胞，MTT比色法检测其在不同蚕丝蛋白材料上的增殖活力和细胞相对增殖率，进行毒性分析；并用活细胞计数法观察不同蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细胞生长的影响。结果鼠胚表皮细胞在1、2、4、5、7、8、10号各型蚕丝蛋白材料上生长，其增殖活力与细胞对照组相当（P〉0.05）；在3、6、9号化学交联或HY-823交联型蚕丝蛋白材料上生长，其增殖活力均低于细胞对照组（P〈0．05）；而在11号蚕丝蛋白材料其增殖活力显著低于细胞对照组（P〈0．01）。1、7号丝胶材料细胞毒性分级为0级（无毒），2、3、4、5、6、8、9、10号各型蚕丝蛋白材料细胞毒性分级为1级（轻微毒），而11号蚕丝蛋白材料细胞毒性分级为2级（中度毒）。活细胞计数结果与MTT检测结果基本相一致。结论除11号蚕丝蛋白材料外，1～10号各型蚕丝蛋白材料无明显细胞毒性，能支持鼠胚表皮细胞正常生长，具有良好的细胞相容性。     

不同方式构建宫腔粘连大鼠模型的比较

目的 通过采取不同的处理方式构建宫腔粘连大鼠模型,以筛选出更稳定的宫腔粘连大鼠模型,为进一步研究宫腔粘连的发生机制以及为新的治疗方式提供理论依据。方法 将48只雌性发情期的SD大鼠随机分为4组,即对照组、脂多糖棉线组（带线组）、脂多糖注射组（注射组）、脂多糖明胶组（明胶组）,每组12只。分别于建模7 d、14 d、28 d每组各处死4只大鼠并取子宫内膜组织检测,使用HE染色观察大鼠子宫内膜腺体数量变化情况,使用Masson染色观察大鼠子宫内膜纤维化面积变化情况,使用免疫组织化法检测纤维化蛋白TGF-β1的表达情况。使用Western Blot检测纤维化蛋白Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1的蛋白表达情况。结果 （1）HE染色结果显示,建模7 d、14 d、28 d,各组腺体数量均较对照组减少（P <0.05）。其中建模14 d、28 d,注射组的腺体数量比带线组及明胶组均减少更明显（P <0.05）,且建模28 d时,注射组腺体数量几乎为0。（2）Masson染色结果显示,带线组、注射组、明胶组在建模7 d、14 d、28 d大鼠的子宫内膜...     

不同载体上人体脱落细胞富集方法的比较

目的 对不同载体上人体脱落细胞的富集方法进行比较研究.方法 选取使用过的口罩、衣服、手套, 分别采取负压吸附、粘取、剪取和擦拭4种方法富集脱落细胞.用QIAGEN QIAamp DNA Investigator Kit提取DNA, 用AB Identifiler系统进行PCR扩增, 用AB 3130 XL自动遗传分析仪进行扩增产物的电泳分离, 用Genemapper ID v3.2软件进行STR分型.结果 口罩、手套类体积小的载体, 采取负压吸附、粘取、剪取、擦拭的方法, 均能得到完整的STR分型图谱;而对于大件的衣服载体, 采用负压吸附和直接剪取明显斑迹处可得到完整的STR分型图谱.结论 对于纺织类渗透性载体, 体积较大时可采用负压吸附法富集人体脱落细胞;对于有明显斑迹的, 可直接剪取可疑斑迹进行检测;体积较小的载体, 可采用脱落细胞富集器粘取, 富集尽可能多的人体脱落细胞.     

甲泼尼龙不同用药方案治疗甲状腺相关眼病的对照研究

甲状腺相关眼病(TAO)是临床常见且治疗棘手的眼病,主要见于Grave病(GD)和桥本甲状腺炎患者.近年来,有关TAO病因和发病机制的研究取得了显著进展,但在治疗方面仍然存在许多困难.糖皮质激素用于TAO的治疗已有近50年的历史,是目前公认的疗效最为确切的治疗方法[1].目前临床报道较多的是甲泼尼龙冲击治疗比单用泼尼松疗效好且不良反应小,但是甲泼尼龙治疗剂量如何把握,究竟何种治疗方案疗效相对较好而不良反应又比较小,目前没有指南规范TAO治疗.本文对比分析了3种临床常用的甲泼尼龙治疗TAO的方案的疗效,以期找到疗效确切,且患者耐受性好的方案.     

急性甲基苯丙胺中毒不同药物临床治疗研究

目的观察不同药物方案治疗急性甲基苯丙胺中毒的临床临床治疗效果。方法选取武汉大学基础医学院2008年8月至2013年5月收治的急性甲基苯丙胺中毒患者150例。根据治疗方案不同分为甲、乙、丙组3组,每组50例。甲组患者采用酸化尿液治疗,乙组患者采用利尿、排便治疗,丙组患者采用利尿、纳洛酮、醒脑静治疗,3组患者均连续治疗2周。比较3组患者不同治疗方法治疗后意识、运动、心率恢复时间及后遗症发生率。结果甲、乙、丙组的意识恢复时间、运动恢复时间、心率恢复时间比较差异均有统计学意义(P<0.05),且丙组患者意识恢复时间、运动恢复时间、心率恢复时间均短于甲组和乙组(P<0.05)。治疗后,3组患者后遗症发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论治疗急性甲基苯丙胺中毒的最佳治疗方案为在常规中毒治疗基础上采用纳洛酮和醒脑静治疗,其能缩短患者临床症状的恢复时间,取得较理想的治疗效果。     

侧脑室注射5-羟色胺对大鼠胃运动的影响

采用定点记录大鼠胃运动的方法,观察了侧脑室内注入微量5-羟色胺(5-HT)对胃运动的影响。结果:①分别向侧脑室内注入5-HT12.5μg/10μl,25μg/10μl,50μg/10μl,可显著增强胃收缩幅度;②预先侧脑室内注入赛庚啶15μg/10μl,切断双侧隔下述走神经,阿托品0.2mg/kg,皮下注射(i.H)或 5μg/10μl侧脑室内注射(icv),均可完全阻断这一增强效应;③酚妥拉明2.5μg/kg肌肉注射(im)或5μg/10μl,icv,心得安5mg/kg,im或50μg/10μl,icv,对侧脑室内注入5-HT增强胃运动的作用均无影响(P>0.05)     

一种改进的显微注射用DNA片段的纯化方法

目的显微注射用DNA的纯度是影响转基因动物制备成功与否的重要因素,本文建立一种可行的适用于普通实验室的纯化DNA方法,替代普遍使用的试剂盒纯化方法。方法分别使用酚-氯仿多次抽提法及常规的凝胶提取试剂盒纯化含有蚓激酶基因的DNA片段,通过显微注射技术将纯化的DNA片段导入小鼠受精卵的原核,制备转基因小鼠。根据转基因实验的结果对两种方法进行比较。结果使用两种方法纯化DNA均能获得转基因小鼠。在DNA纯度及注射卵的存活率上,两种方法无明显差别;在移植卵的出生率及转基因阳性率上,抽提法优于试剂盒法。结论本实验建立的抽提方法可以替代试剂盒方法纯化显微注射用DNA片段,在降低实验成本、简化实验条件及提高转基因阳性率方面具有优势。