构建壳聚糖-磷酸钙/重组人骨形态发生蛋白2复合材料及在体内的异位成骨

背景：研究表明，重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖-磷酸钙支架复合体具有良好的细胞相容性，且材料内部的多孔结构和孔径也能满足于细胞长入和骨的再生，但要应用于临床还需证明能否体内成骨。 目的：构建壳聚糖-磷酸钙与重组人骨形态发生蛋白2的复合材料，并观察其植入兔肌袋模型后的异位成骨能力。 设计、时间及地点：观察性实验，于2007-06/08在暨南大学附属第一医院中心实验室、外科实验室及暨南大学理工学院材料科学与工程系实验室完成。 材料：将固相的磷酸三钙粉末及液相的壳聚糖溶液在室温下混合，制备壳聚糖-磷酸钙支架。再将壳聚糖-磷酸钙支架放入重组人骨形态发生蛋白2溶液中浸泡，真空抽吸后冷冻干燥，制备壳聚糖-磷酸钙材料/重组人骨形态发生蛋白2复合材料。 方法：测量改良后支架的孔隙率及抗压强度, 扫描电镜观察其超微结构；20只新西兰大白兔局部麻醉后在左后肢大腿外侧切口，暴露大腿肌肉，分离形成肌袋。随机分为3组，空白对照组5只不植入材料，单纯壳聚糖-磷酸钙材料组5只、壳聚糖-磷酸钙/重组人骨形态发生蛋白2复合材料组10只分别植入壳聚糖-磷酸钙材料、壳聚糖-磷酸钙/重组人骨形态发生蛋白2复合材料。 主要观察指标：在植入后4周，通过大体观察、X射线摄片、组织学检测其体内异位成骨能力及生物反应性。 结果：制备的复合重组人骨形态发生蛋白2后的壳聚糖-磷酸钙支架的孔隙率为87%，压缩弹性模量为20 MPa。扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构，孔径超过100 μm。空白对照组苏木精-伊红染色可见肌肉纤维间少量淋巴细胞浸润。单纯壳聚糖-磷酸钙材料组大体观察可见材料周围有薄层的结缔样组织包裹，材料与周围肌肉连接松散，苏木精-伊红染色可见材料植入区为圆形空腔。壳聚糖-磷酸钙/重组人骨形态发生蛋白2复合材料组大体观察可见材料周围有薄层的结缔样组织包裹，材料中间可见空洞，有降解现象及少量淡红色纤维样结构长入，X射线示左大腿内材料高密度影无明显改变，苏木精-伊红染色可见少量血管样组织长入，Masson三色染色可见编制骨岛中有胶原纤维形成。 结论：壳聚糖-磷酸钙/重组人骨形态发生蛋白2复合材料具有良好的孔隙率、抗压强度及超微三维结构，复合材料在兔体内具有异位成骨能力。     

缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导骨形成***☆

背景：重组人骨形态发生蛋白2在体内半衰期短、易降解代谢,达不到理想的骨再生效果。 目的：制备缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料,并观察其缓释性能、骨诱导活性。 方法：将重组人骨形态发生蛋白2与壳聚糖混合制备壳聚糖膜,涂覆于生物骨修复材料表面,ELISA方法检测其体外释药性能。茜素红染色检测缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料、单纯骨填充材料诱导C2C12细胞骨钙蛋白的形成,观察其诱导成骨细胞能力。同时将3种骨修复材料植入清洁级KM小鼠股部肌袋内,2周后检测新生骨Ca2+离子含量,评价其异位骨诱导能力。 结果与结论：材料表面的壳聚糖膜分布均匀,负载的重组人骨形态发生蛋白2呈团簇状。重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料体外释药存在突释,前4 d释放量达总药量的50%,持续至12 d,释药量达到90%,第18天时释放完全。与单纯骨填充材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料相比,缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导C2C12细胞向成骨晚期分化能力与异位骨形成能力显著增强(P < 0.05)。结果提示缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料缓释性能好,促进骨形成能力强。     

骨形态发生蛋白2与壳聚糖神经支架复合体修复兔面神经损伤★

目的：应用生物可降解材料构成的导管通过载体与外源性骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP-2）相结合，构筑新型具有生物和人工合成材料优势的神经支架——组织工程复合体，探讨其对兔面神经损伤的修复。 方法：实验于2007-01/06在兰州大学动物实验中心完成。①自制BMP-2及壳聚糖神经支架和单纯壳聚糖神经支架。②暴露兔面神经上颊支，切除长2 mm神经，任其回缩，造成8 mm神经缺损的动物模型。③选择新西兰白兔24只，按随机数字表法分为2组，复合神经支架组和单纯壳聚糖神经支架组，每组12只。同时采用自身左右对照，设为对照组（自体神经离断后倒置，吻合于神经缺损处）。④一般观察：肉眼观察兔双侧颊肌萎缩程度及活动度。⑤形态学检查：术后16，30周，切取上颊支神经干，近侧吻合口纵切面行苏木精-伊红染色，观察神经再生情况；术后30周，透射电镜下观察再生神经超微结构；术后16，30周，用德国IBAS-I+Ⅱ型计算机图像处理系统作图像处理，计算神经纤维总数和纤维直径、轴突直径及髓鞘厚度。 结果：纳入动物24只，均进入结果分析。①大体形态：兔面神经上颊支损伤后2周面肌萎缩，复合神经支架组、单纯壳聚糖神经支架组、对照组分别于术后8，9，11周时开始逐渐恢复正常。②术后16周，单纯壳聚糖神经支架组与复合神经支架组光镜下可见神经外膜有新生血管，再生纤维呈束状分布，粗细不均匀，束间有新生血管。神经纤维排列整齐，无神经瘤形成。术后30周，光镜下可见复合神经支架组神经密集程度、血管化和髓鞘化程度优于单纯壳聚糖神经支架组。对照组形成的神经纤维束较为分散，不均匀，髓鞘处组织染色较差。③术后16,30周兔面神经再生神经图像分析结果：神经纤维的排列、血管化程度、直径和数目、髓鞘壁、轴突形状等各检测指标均优于单纯壳聚糖神经支架组。④术后30周，透射电镜下复合神经支架组神经再生超微形态学更接近对照组，优于单纯壳聚糖神经支架组。 结论：可吸收性BMP-2与壳聚糖神经支架复合体能有效地引导兔面神经再生并恢复其功能，优于单纯壳聚糖神经支架。     

含重组人骨形态发生蛋白2骨修复材料的体内成骨实验

背景：以往的骨修复材料都优先考虑生物材料对骨缺损的骨传导作用，而含重组人骨形态发生蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）的骨修复材料(骨优导)修复骨缺损的作用机制为骨诱导（诱导成骨）作用。 目的：采用两种动物模型观察骨修复材料(骨优导)的体内成骨活性。 设计：分组对比，多角度评估观察实验。 材料：rhBMP-2和载体材料制备的骨修复材料(骨优导)由杭州华东医药集团投资有限公司提供。 方法：①小鼠肌袋异位成骨实验：ICR小鼠72只随机分为rhBMP-2材料5，10，20，40，80，160，250 μg组、空白对照组和假手术组9组，后腿外侧肌肉间隙陷窝分别植入相应剂量的骨优导或空白材料，或做假手术。②犬桡骨骨缺损修复实验：30只犬随机分为rhBMP-2材料1，2，4 mg组、空白对照组、造模组5组，制备桡骨2 cm骨缺损模型，分别植入相应剂量的骨优导或空白材料，造模组不处理。 主要观察指标：①小鼠植入材料当天和植入后21 d拍X射线片观察，21 d后取材，测定新骨的湿重，干重，灰份含量、钙含量。②犬植入后当天、植入后1，2，3个月拍X射线片观察，并对骨愈合情况进行量化后评分。 结果：植入骨修复材料(骨优导)的小鼠在植入后21 d解剖发现植入部位有大量新骨形成，而新骨的干重、湿重、灰分含量、钙含量都和植入的rhBMP-2剂量成线形正比。在犬桡骨骨缺损模型中观察到植入骨优导后1个月，植入区域有明显的新骨形成，植入3个月后愈合良好，两个对照组均未能愈合。量化评分显示rhBMP-2可加速骨缺损修复。 结论：骨修复材料(骨优导)有较强的诱导成骨活性和修复骨缺损作用，具有很好的临床应用前景。     

重组人骨形态发生蛋白2对兔椎间盘成骨作用的诱导

背景: 重组人骨形态发生蛋白2作为一种新药已应用于临床，但在椎间盘内诱导成骨的研究报道很少。 目的：通过动物实验，观察重组人骨形态发生蛋白2对兔椎体间融合的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验多水平评估，于2003-02/07在青岛大学医学院附属医院完成。 材料：24只纯种成年新西兰大白兔，体质量3.5~4.5 kg，分离暴露L4~5、L5~6椎间盘；重组人骨形态发生蛋白2，1 mg/支，纯度≥95%，无菌包装，购自北京市百灵克生物制品有限公司。 方法：24只大白兔随机投币法分为实验组和对照组，每组12只。实验组向L4~5椎间盘的髓核中注射含200 μg重组人骨形态发生蛋白2的生理盐水溶液20 μL；向L5~6的髓核中注射等量的生理盐水作为自身对照；对照组动物L4~5椎间盘的髓核中注射生理盐水20 μL。 主要观察指标：术后10，30，60，90 d应用手法检查、组织学和影像学观察注射节段的形态变化。 结果：纳入新西兰大白兔24只，均进入结果分析。①实验组10 d L4~5节段活动范围无明显变化；30 d活动范围轻度受限；60 d 活动范围明显受限；90 d L4~5节段皆固定。作为自身对照的L5~6节段及对照组关节活动范围无明显变化。②实验组10 d L4~5椎体间隙变窄；90 d L4~5椎间隙消失，椎体间形成骨性融合。对照组及作为自身对照的L5~6节段椎间隙透光度无明显改变。③实验组10 d髓核细胞逐渐变小，90 d部分软骨终板已转化为成熟的编织骨；纤维环的胶原纤维结构逐渐消失，10 d和30 d均可见大量间充质细胞在纤维环外围聚集；90 d 纤维环靠近软骨终板处已形成成熟的编织骨。对照组各时间点组织学形态无明显变化。 结论：重组人骨形态发生蛋白2可诱导椎间盘成骨，达到椎体间融合的目的。     

骨形态发生蛋白2和音猬因子体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：研究表明，骨形态发生蛋白2和音猬因子联合诱导干细胞的定向分化存在理论上的可能性，但目前联合诱导间充质干细胞的方向纷繁复杂，且众说纷纭。 目的：观察骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外联合和单独应用促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。 设计、时间及地点：随机分组设计，对比观察，于2008-12在江苏大学临床医学院实验室完成。 材料：6周龄SPF级SD大鼠10只，体质量140~160 g，雌雄不拘，用于间充质干细胞的获得、培养和传代。重组人骨形态发生蛋白2、音猬因子为PeproTech公司产品。 方法：将SD大鼠的间充质干细胞分离培养后分为4组：重组人骨形态发生蛋白2组：加入100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2；音猬因子组：加入20 μg/L音猬因子；联合组：100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2联合20 μg/L音猬因子作用于SD大鼠间充质干细胞；对照组：不加任何干预措施。 主要观察指标：倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化；MTT法检测细胞培养第3，6，9，12天细胞增殖数和细胞碱性磷酸酶活性；以及成骨细胞表型的检测和Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹分析，以比较各组诱导成骨能力的差异。 结果：①间充质干细胞培养24 h后部分贴壁，贴壁细胞呈圆形或椭圆形，第7天左右细胞铺满瓶底，多为梭形。条件培养基培养3 d后，联合组细胞由长梭形转变为多角形。随后重组人骨形态发生蛋白2组细胞发生成骨样改变，音猬因子组细胞未见明显形态学改变。②相同时间点联合组、重组人骨形态发生蛋白2组、音猬因子组细胞吸光度均高于对照组(P < 0.05)。联合组和重组人骨形态发生蛋白2组在各时间点碱性磷酸酶表达量均高于音猬因子组和对照组(P < 0.05)。③间充质干细胞经诱导培养7 d后，碱性磷酸酶细胞化学染色联合组和重组人骨形态发生蛋白2组呈阳性，联合组可见胞质中棕黄色颗粒，音猬因子组和对照组阴性。诱导培养14 d后，Ⅰ型胶原免疫荧光染色音猬因子组和对照组均为阴性，联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性，但联合组细胞数量明显增多，细胞间融合较好，重组人骨形态发生蛋白2组细胞融合欠佳。矿化沉积茜素红染色音猬因子组和对照组仍为阴性，联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性，联合组细胞间可见红色的钙结节。④蛋白免疫印迹分析显示，与对照组相比，联合组和重组人骨形态发生蛋白2组Ⅰ型胶原蛋白表达增加，联合组尤其明显，音猬因子组与之接近。 结论：骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外能明显促进间充质干细胞向成骨细胞分化并且具有明显的协同相关性。     

自制人骨形态发生蛋白2复合骨修复材料诱导骨再生***

摘要 背景：骨形态发生蛋白是目前发现的一类惟一可独立诱导骨再生的细胞因子,临床应用前景广阔。但它们价格昂贵,限制了在中国的应用。 目的：探讨自主生产的重组人骨形态发生蛋白2的骨诱导活性及对骨缺损的修复作用。 方法：通过电泳及质谱的方法检测其复性后重组人骨形态发生蛋白2的纯度,通过C2C12细胞在重组人骨形态发生蛋白2诱导下向成骨细胞分化检测其骨诱导活性。将重组人骨形态发生蛋白2与以动物骨为原料加工制成的新型骨修复材料复合,植入新西兰兔桡骨缺损实验模型观察其对骨缺损的修复作用。 结果与结论：自主生产的重组人骨形态发生蛋白2纯度≥95%,能明显诱导C2C12细胞向成骨细胞分化,分化早期大量表达碱性磷酸酶,分化末期形成大量的矿化小节,诱骨活性良好。在兔桡骨修复试验中,X射线影像学及苏木精-伊红染色组织学检查结果表明,重组人骨形态发生蛋白2复合材料组在2个月时形成大量骨痂,4~6个月时载体与自体骨融合,材料大量降解,修复效果良好;单纯骨填充材料组4~6个月时只有少量新生骨桥与自体骨连接,降解量极少;空白对照组损伤部位为纤维化组织所填充。结果提示自主生产的重组人骨形态发生蛋白2促进骨修复作用明显,适合应用于临床。 关键词：自主生产;人骨形态发生蛋白;生物型骨填充材料;桡骨缺损;骨修复 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.21.002     

重组人骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米微球的制备及体外细胞毒性*☆

背景：通过各种微球负载骨生长因子使骨形态发生蛋白达到缓释效果逐渐成为研究热点,但关于载药壳聚糖纳米微球的生物相容性特别是细胞毒性的报道较少。 目的：对重组人骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米微球进行细胞毒性检测,评估应用壳聚糖纳米微球作为重组人骨形态发生蛋白2缓释载体的生物安全性。 方法：通过离子交联法制备空白壳聚糖纳米微球,应用透视电镜观察微球的形态,激光粒径分析其粒径分布;通过重组人骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米微球体外细胞毒性试验评估微球的生物安全性。 结果与结论：离子交联法制备的壳聚糖微球,球形规整,分散均匀,微球平均粒径为230 nm,分布较集中。载药及空白微球的反应分级为0或1级,均为合格。提示,离子交联法制备可成功制备出负载重组人骨形态发生蛋2的纳米微球,且微球细胞毒性检测合格,为进一步的骨组织工程研究提供理论实验基础。     

重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料的骨诱导活性

背景：已有将重组人骨形态发生蛋白2应用于骨再生及修复的报道,但由于其在生物体内半衰期短而导致诱导骨形成的能力受到限制。 目的：制备具有较好缓释效果的重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料,并检测其缓释性能及骨诱导活性。 方法：通过高效液相色谱法检测重组人骨形态发生蛋白2-肝素复合物对于酶解的保护作用。将重组人骨形态发生蛋白2与肝素溶液混匀后复合于人工骨材料表面,ELISA方法检测其体外释药性质,茜素红染色法检测其诱导成骨细胞的能力,应用小鼠体内实验评价其异位骨诱导能力。 结果与结论：成功制备了具有良好缓释效果的重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料,具有较强的诱导骨钙蛋白及异位骨形成能力。     

骨形态发生蛋白2基因复合纤维蛋白凝胶/ 聚乳酸-聚己内酯双相支架修复节段性骨缺损★

背景：骨形态发生蛋白2基因转染骨髓基质干细胞后，可促进其增殖分化并诱导异位骨形成。但这种方法操作复杂，体外细胞扩增需时较长，不便于临床应用。 目的：将人工骨经骨形态发生蛋白2腺病毒载体与纤维蛋白凝胶和聚乳酸/聚己内酯处理，移植修复骨缺损。 设计：随机对照动物实验。 单位：实验于2003-09/2004-12在吉林大学中日联谊医院中心实验室完成。 材料：聚乳酸/聚己内酯生物可降解材料块由中国科学院长春应用化学研究所提供，孔隙直径150~250 μm，孔隙率90%以上；实验动物为3月龄新西兰大耳白兔60只。 方法：于新西兰大耳白兔双侧桡骨中段造成1.5 cm骨缺损，分别植入4种经不同方法处理的人工骨：①Ad-BMP-2组：骨形态发生蛋白2腺病毒载体＋纤维蛋白凝胶＋聚乳酸/聚己内酯。②重组BMP-2组：重组骨形态发生蛋白2＋纤维蛋白凝胶＋聚乳酸/聚己内酯；③对照基因组：β-半乳糖酐酶基因腺病毒载体＋纤维蛋白凝胶＋聚乳酸/聚己内酯。④PLA/PCL组：纤维蛋白凝胶＋聚乳酸/ 聚己内酯。 主要观察指标：术后4，8，12组周摄双侧前肢正位X射线片测定骨痂灰度（代表新骨密度）；苏木精-伊红染色观察骨缺损修复情况，爱辛蓝和Vankossa染色观察软骨形成及矿化；电镜观察骨细胞成熟、支架降解吸收情况；术后12周行生物力学检测评价新骨抗弯强度。 结果：术后12周Ad-BMP-2组缺损区在成骨活跃程度、骨再生量和再生髓腔结构等方面均显著优于重组BMP-2组，其骨缺损得到了较彻底的修复。对照基因组和PLA/PCL组均不能产生骨性愈合。 结论：聚乳酸/聚己内酯协同纤维蛋白凝胶运载骨形态发生蛋白2基因修复节段性骨缺损可达到较好的效果。     

纳米壳聚糖-胶原纤维支架的生物相容性

背景：新型仿生纳米壳聚糖-胶原支架在纳米水平上与细胞外基质结构相似，其是否可促进骨髓间充质干细胞的黏附及生长，并显示良好的相容性？ 目的：评价新型纳米壳聚糖-胶原支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性。 设计：单一样本观察。 单位：暨南大学附属第一医院骨科。 材料：实验于2007-03/2007-07在暨南大学附属第一医院实验中心完成。选取10只4周龄雌性SD大鼠， SPF级，体质量200 g，由广东省实验动物中心提供(许可证号为SCXK(粤)2003-0002)。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。纳米壳聚糖-胶原纤维支架由理工学院生物材料研究室提供。 方法：①分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞，流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测。②聚电解质共凝聚技术制作纳米壳聚糖-胶原纤维支架。③取生长良好的P3代，与纳米壳聚糖-胶原纤维支架体外联合诱导培养，以单纯纳米壳聚糖支架材料为对照，通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力及周期、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞分离培养后进行流式细胞表面抗原标志鉴定。②纳米材料及细胞复合2，4，8 d后扫描电镜观察细胞与材料相容情况。③细胞对材料黏附率的测定。④细胞与材料复合5 d检测细胞周期及活力。 结果：①细胞表面抗原标志检测结果：CD29表达为90.86%，CD106表达为73.38%，CD44表达为82.61%，CD34表达为0.76%，CD45表达为0.60%。②细胞与材料相容情况：扫描电镜可见纳米壳聚糖-胶原纤维支架为多孔的三维立体结构，材料内部形成大小不一的大孔和互连的小孔，彼此相互交通。应用质量法测得的孔隙率为85%~90%，孔径为50~300 μm，平均150 μm。骨髓基质干细胞复合到纳米壳聚糖-胶原纤维支架后2 d，细胞呈球形散在分布；4 d 后细胞呈梭形，延展爬行且有伪足与材料表面锚靠；8 d 时细胞增殖，相互间融合，并有大量的细胞外基质分泌，大部分材料颗粒被覆盖。③细胞对材料黏附率：细胞-支架复合物共培养2及6 h，骨髓基质干细胞在纳米壳聚糖-胶原纤维支架的黏附率均高于单纯纳米壳聚糖支架。④纳米壳聚糖-胶原纤维支架与单纯纳米壳聚糖支架的细胞、细胞周期特点比较：纳米壳聚糖-胶原纤维支架细胞活力为96.67%，细胞周期G0-G1为90.81%，G2-M为0.52%，S为8.66%，G2/G1为1.81。单纯纳米壳聚糖支架细胞活力为95.27%，细胞周期G0-G1为87.14%，G2-M为9.69%，S为4.16%，G2/G1为1.80。 结论：纳米壳聚糖-胶原支架与骨髓基质干细胞有良好的组织相容性，可用来做组织工程生物材料。     

生物玻璃活性陶瓷复合人骨形态发生蛋白2基因修饰骨髓间充质干细胞

摘要 背景：目前已有将体外培养的骨髓来源间充质细胞与支架复合后修复骨缺损的临床报道,但是由于该类复合材料中缺乏骨生长因子作用,其原位的成骨作用并不十分理想。 目的：观察人骨形态发生蛋白2基因修饰的骨髓间充质干细胞与生物活性玻璃陶瓷复合材料在修复兔颅骨缺损中的原位成骨作用。 方法：复苏冻存的人骨形态发生蛋白2基因修饰的骨髓间充质干细胞,与生物活性玻璃陶瓷复合培养获得人工植骨材料;制备兔双侧颅骨全层骨缺损模型,实验组将人工植骨材料植入骨缺损区,并设置空白质粒转染的骨髓间充质干细胞+生物活性玻璃陶瓷、骨髓间充质干细胞+生物活性玻璃陶瓷、空白组作对照,术后第4,8,12周对植骨区进行大体观察、X射线摄片、组织化学检测和生物化学检测。 结果与结论：转染人骨形态发生蛋白2 的骨髓间充质干细胞与生物活性玻璃陶瓷复合培养的人工植骨材料植入后第4周,骨缺损外周骨质与复合材料之间大部分被高密度阴影充填;第12周,完全被高密度阴影充填;第8周,骨小梁大部分相连成片;第12周,骨小梁粗大,骨髓再生。生物化学检测结果与组织化学检测结果一致,并且成骨效果及成骨活性明显优于对照组。说明携带人骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞与生物活性玻璃陶瓷复合构成的人工植骨材料基本符合骨组织工程学的要求,在骨缺损区原位具有良好的成骨作用。 关键词：骨髓间充质干细胞;基因转染;生物活性玻璃陶瓷;骨缺损;移植;兔;生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.42.005     

纳米晶羟基磷灰石胶原复合骨髓间充质干细胞修复骨缺损

背景：临床上对大范围骨缺损还没有很有效的治疗手段,而纳米晶羟基磷灰石胶原复合材料与天然骨骼的结构类似,具有较好的生物相容性,可能为修复骨缺损提供新的途径。目的：观察纳米晶羟基磷灰石胶原材料复合骨髓间充质干细胞在修复骨缺损中的作用。方法：分离培养人骨髓间充质干细胞,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养;通过大体观察、组织学分析及电镜观察了解成骨情况,进一步临床应用于修复骨缺损。 结果与结论：人骨髓间充质干细胞在体外可以大量扩增,复合细胞的材料植入骨缺损处后,X射线摄片动态观察可见骨缺损处连接良好。说明骨髓间充质干细胞具有成骨细胞作用,纳米晶羟基磷灰石胶原材料是一种很好的构建组织工程骨的支架材料。关键词：骨髓间充质干细胞;羟基磷灰石;纳米材料;组织工程;骨     

兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体构建软骨组织工程支架*

背景：软骨组织工程的核心是利用少量的细胞经体外培养、扩增后,在一定环境下附着在三维多孔支架上,再将细胞/支架复合体移植到体内形成新的组织。 目的：拟构建兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体,探讨该支架作为软骨组织工程支架的可行性。 设计、时间及地点：细胞-支架学体外观察,于2008-03/2009-02在武警医学院生物化学教研室完成。 材料：日本大耳白兔6只用于分离培养骨髓间充质干细胞。医用壳聚糖粉末为山东奥康生物科技有限公司产品。Ⅰ型胶原为Sigma公司产品。 方法：取3%的壳聚糖和2%的胶原混合的醋酸溶液,倒入72孔板内,-20 ℃预冷冻10 h,冻干机冷冻抽干24 h制作成壳聚糖-胶原支架。取第3代兔骨髓间充质干细胞,以1×109 L-1密度接种于支架内,构建细胞/支架复合体。 主要观察指标：傅里叶红外光谱、扫描电镜、液体置换法测定支架的理化性质,观察三维培养后细胞在支架上的生长情况。 结果：壳聚糖-胶原支架孔径为160~380 μm,平均为270 μm,孔相通性好,支架孔隙率为(86.00±5.12)%。傅里叶红外光谱仪测定数据表明复合支架组成物有典型的壳聚糖、胶原峰,未发现有聚乙二醇峰。细胞/支架共培养24,48,72 h后,骨髓间充质干细胞可渗入支架多孔结构内,并黏附在支架上成簇生长,部分细胞已与支架融合。 结论：壳聚糖-胶原支架基本符合软骨组织工程支架要求,能够作为种子细胞的承载体。 关键词：壳聚糖-胶原支架;骨髓间充质干细胞;冻干法;软骨组织工程     

兔骨髓间充质干细胞复合壳聚糖支架的构建研究

背景：组织工程的研究重点是利用少量的细胞经体外培养、扩增后, 在一定环境下附着在三维多孔支架上并良好生长为后期的组织器官重建修复做好基础。 目的：对不同浓度兔骨髓间充质干细胞复合至壳聚糖支架用于组织工程再生修复进行评价。 方法：取50万,脱乙酰度为95％ 的壳聚糖粉末通过冷冻干燥法制备壳聚糖支架,取1*103,1*104,1*105,1*106浓度细胞复合至壳聚糖支架后1.3.5.7.9天以光镜,扫描电镜,MTT法观察骨髓间充质干细胞的生长与分裂增值情况。 结果与结论： 1. 壳聚糖海绵状多孔支架为5mm*5mm*3mm,孔径190 - 380μm平均孔径290μm,孔相通性较好,空隙率为（84.00?.62）%。 2．细胞/支架共培养72h后各浓度细胞组均可渗入壳聚糖支架多孔结构内粘附生长。1*104,1*105,1*106浓度细胞组在支架上成蔟生长,部分细胞与支架融合。 3.1*104,1*105浓度细胞组更利于骨髓间充质干细胞在壳聚糖支架的黏附生长,用于组织再生修复。     

β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸支架复合骨髓基质细胞修复节段性骨缺损

背景：组织工程β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸支架材料具有良好的生物相容性。 目的：评估骨髓基质细胞与β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸复合体修复兔桡骨大段骨缺损成骨的效果。 方法：取新西兰大白兔40只,建立桡骨双侧大段骨缺损模型,其中35只右侧植入自体骨髓基质细胞与β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸复合物作为实验组,左侧植入β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸支架材料作为对照组;另5只作为空白对照不作任何处理。植入后4,8,12,16周拍摄X射线片观察骨缺损修复情况。 结果与结论：实验组术后2周可见缺损处有散在的、少量模糊状骨痂生成,术后4周可见明显骨生成影像,成云雾状,均匀分布在骨缺损区,术后8周整个缺损区均可见骨痂生成,成骨现象更加明显,部分髓腔已通,术后12~16周,缺损区已完全被新生骨组织充填,骨髓腔已完全再通,修复区较正常桡骨细,骨缺损修复效果明显优于对照组与空白对照组(P < 0.01)。说明自体骨髓基质细胞与β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸复合移植可较完全修复大节段骨缺损。     

胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状修复体负载骨髓间充质干细胞体外培养*★

目的：观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对经诱导骨髓间充质干细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为关节软骨工程支架的可行性。 方法:实验于2007-09/2008-03在广东省组织工程构建与检测实验室进行。①实验方法：以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架，孔隙率≥ 90%，孔径100 μm；体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞并成骨诱导3 周，经检测诱导成功后，使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养4周。②观察指标：通过倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测修复体三维立体培养对成骨细胞的表型、增殖及功能的影响。 结果：①骨髓间充质干细胞经成骨诱导，检测碱性磷酸酶染色阳性，钙结节染色阳性，证实诱导成功。②胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙复合支架亲水性好，经诱导的骨髓间充质干细胞吸附于支架表面24 h后,顺孔隙迁徙至支架内部，倒置显微镜和扫描电镜观察显示细胞在孔壁贴附良好。③组织学及免疫组织化学检测表明成骨细胞在复合支架上增殖和表型维持稳定，能分泌细胞外基质，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性。　 结论：胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体与经成骨诱导的骨髓间充质干细胞相容性良好，为修复关节软骨下层骨的进一步研究提供了实验依据。     

体外构建腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石的植骨材料

背景：随着组织工程和基因工程技术迅速发展,基因增强的组织工程骨为临床治疗骨缺损带来美好的前景。 目的：观察经腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2表达载体(Ad-BMP-2)转染后的兔骨髓间充质干细胞在纳米羟基磷灰石植骨材料上的黏附、增殖及骨形态发生蛋白2的表达情况。 方法：用Ad-BMP-2转染兔骨髓间充质干细胞,免疫组化、蛋白印迹法检测转染后细胞内骨形态发生蛋白2的表达情况。将转染48 h的细胞均匀接种到纳米羟基磷灰石植骨材料上,扫描电镜观察细胞黏附状况,并采用MTT比色法测定骨髓间充质干细胞的增殖情况;消化收集黏附植骨材料上第3,5,7天的细胞,蛋白印迹检测黏附材料上细胞骨形态发生蛋白2的表达。 结果与结论：转染后,骨髓间充质干细胞内骨形态发生蛋白2有高表达;扫描电镜见转染细胞在纳米羟基磷灰石材料孔隙周围及孔隙内黏附生长良好并大量增殖,MTT分析结果显示,纳米羟基磷灰石对骨髓间充质干细胞的体外增殖无抑制作用,复合后骨形态发生蛋白2有较高表达。结果表明经Ad-BMP-2转染后的骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石植骨材料生物相容性好,细胞在材料上能稳定长效地分泌骨形态发生蛋白2。