新型双相陶瓷材料复合成骨细胞构建人工骨及其体内成骨的观察

目的 观察骨髓来源的成骨细胞与新型双相陶瓷材料复合培养后细胞生长状况及其体内异位成骨能力。方法 将来源于兔骨髓的成骨细胞与新法制备的HA／TCP共培养2周，通过相差显微镜、扫描电镜观察体外细胞生长情况；然后将复合物自体异位植入体内，6周后观察体内成骨情况。结果 扫描电镜显示材料表面和孔隙内均有成骨细胞生长，有良好增殖活动性和稳定细胞表型，材料中心区未见细胞生长；植入体内6周后取材见内植物有新骨形成、多位于内植物表面，可见成骨细胞、骨细胞、髓腔样结构、板层样骨基质等正常骨组织结构。结论 新型双相陶瓷支架可用作组织工程骨的细胞外基质材料，骨髓来源的成骨细胞可用作骨组织工程的种子细胞。     

珍珠层聚乳酸人工骨复合成骨细胞体内异位成骨研究

目的探讨珍珠层聚乳酸(nacre／polylactic acid，N／P)人工骨与同种异体成骨细胞复合，植入体内后异位成骨的作用机制，以及作为骨组织工程支架材料的可行性。方法成年雄性新西兰大白兔18只，按2、4和8周3个时间点随机分成3组，每组6只。将体外培养的同种异体新西兰大白兔成骨细胞，种植到N／P人工骨材料上，并植入每只兔左侧背部皮下为实验组；以不复合成骨细胞的N／P人工骨材料植入右侧背部皮下作对照，分别于植入后不同时间点取材，经大体观察、组织学检查和免疫组织化学方法检测。结果实验组2周时材料周围有少许炎性细胞聚集，4周时有类骨质形成，8周时有成熟骨组织形成，其中可见骨髓腔；对照组2、4周时仅见大量纤维组织长入材料内，8周时材料内纤维组织增多，但无成骨发生。结论N／P人工骨可作为理想的骨组织工程支架材料。     

陶瓷样异种骨复合骨髓异位成骨的实验研究

目的了解陶瓷样异种骨（ＣＸＢ）与骨髓（ＢＭ）复合移植的成骨作用。方法将ＣＸＢ与ＢＭ复合及单纯ＣＸＢ植入兔的骶棘肌内,术后２、４、８、１２、１６及２４周取出植入材料作组织学及组织化学检查,观察植入材料的成骨作用。结果ＣＸＢ与ＢＭ复合植入后２周开始有软骨和新骨生成,以后软骨逐渐钙化成骨,８周时出现髓腔,并随植入时间的延长,新骨生成增多,成骨更为典型。而单纯ＣＸＢ植入后无新骨或软骨形成。结论ＣＸＢ与ＢＭ复合移植通过骨传导、骨诱导及提供成骨细胞或成软骨细胞而成骨,是一种理想的骨移植替代材料,可望在临床上用于骨缺损的修复。     

骨髓基质干细胞复合小肠黏膜下层体内异位成骨的研究

目的 观察骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建组织工程骨膜的异位成骨能力.方法 将常规方法培养的BMSCs与SIS复合(M1组)及进行成骨诱导培养BMSCs与SIS复合(M2组)植入兔(n=8)背部肌袋内作为实验组,以单纯SIS作为阴性对照.术后4、8、12周观察其成骨情况.结果 BMSCs在SIS支架上黏附、生长良好.植入体内4、8、12周,M2、M1、SIS组成骨量分别为(25.08±0.79)%、(18.81±0.42)%和(13.98±1.86)%,各指标M2组高于M1或SIS组(P<0.05),M1组高于SIS组(P<0.05).随着时间的延长,两实验组成骨量逐渐增加(P<0.05),SIS组的成骨量变化不明显(P>0.05). 结论 BMSCs与SIS复合构建组织工程骨膜在体内有异位成骨作用,而且经过成骨诱导的组织工程骨膜成骨作用更加明显.     

不同方法低温保存的组织工程骨异位成骨的实验研究

目的:探讨不同方法低温保存的组织工程骨异位成骨的差异。方法:以骨髓基质干细胞(marrowstromalcells,MSCs)复合部分脱蛋白骨培养制备组织工程骨,组织工程骨分别用添加或不添加冻存保护剂的保存液于-196℃的液氮中冻存3个月,3个月后复温冻存的组织工程骨。选择40只新西兰白兔,将材料植入动物脊柱旁的肌肉内,实验根据植入材料的不同分为A、B、C和D组,A组:植入添加冻存剂保存的组织工程骨;B组:植入未添加冻存剂保存的组织工程骨;C组:植入未行低温保存的组织工程骨;D组:植入部分脱蛋白骨。术后第4、8周分别取材,行组织学观察和计算机图像分析。结果:术后第4、8周,各组异位成骨组织学评估,A组与C组比较无显著性差异(P>0.05),A组或C组分别与B组比较,异位成骨能力为:A或C>B(P<0.001,P<0.05),D组材料无异位成骨。结论:选择适宜的冻存保护剂对组织工程骨的生物活性有一定的保护作用。     

成骨细胞与诱导剂对骨髓基质干细胞的增殖与成骨分化的影响

目的探索一种新的骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)增殖与成骨分化的体外诱导培养体系. 方法乳大鼠颅骨来源的第3代成骨细胞与诱导剂(1 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50μg/ml抗坏血酸)对大鼠股骨、胫骨来源的MSCs生长的影响.于8块24孔板上培养MSCs,每孔接种5×104个第3代MSCs.按培养成分不同分为4组,每组2块.DMEM培养为对照组;诱导剂培养为诱导剂组;成骨细胞培养为成骨细胞组;联合使用成骨细胞与诱导剂培养为联合诱导组.计数诱导1～8 d各组MSCs的数量并绘制细胞生长曲线,检测诱导10 d的MSCs的碱性磷酸酶活性,采用RT PCR检测诱导2周时MSCs骨钙素mRNA的表达水平.结果原代及传代MSCs形态正常.细胞生长曲线示MSCs数量均随时间延长增加.成骨细胞组增殖最快,诱导剂组增殖最慢,5～8 d成骨细胞组及诱导剂组细胞数量与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).联合诱导组碱性磷酸酶活性为2.01±0.56 U与对照组0.68±0.14 U、诱导剂组1.27±0.43 U及成骨细胞组0.77±0.19 U比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).对照组不表达骨钙素mRNA,诱导剂组为0.783±0.094、联合诱导组为0.814±0.071与成骨细胞组0.302±0.026比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论联合使用成骨细胞和诱导剂诱导MSCs,不影响MSCs的正常增殖而促进MSCs的成骨分化,诱导效果较好,可望成为一种新的骨组织工程种子细胞的体外培养体系.     

人脱细胞骨复合骨髓基质细胞成骨活性的实验研究

目的 研究人脱细胞骨(HAB)复合经诱导的骨髓基质细胞的实验效果,观察细胞的黏附和生长情况,并对其成骨活性进行检测。方法 用15％的过氧化氢和乙醚去除人髂骨块内的结缔组织和细胞成分,消毒后制备人脱细胞骨。取材活体或新鲜尸体的骨髓行骨髓基质细胞培养,细胞纯化后加入β-甘油酸钠,地塞米松和抗坏血酸等向成骨方向诱导,并进行对照培养。通过碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)检测来确定骨髓基质细胞的增殖和分化情况,将诱导的骨髓基质细胞浓缩后复合到制备好的脱细胞骨块内进行复合培养。8d后通过光镜和电镜等形态学观察以及生化指标检测来确定细胞的成骨活性。结果 人髂骨块内细胞清除干净,骨基质保存良好;诱导后的骨髓基质细胞ALP和OCN水平明显高于对照组(P<0.05);复合后的人脱细胞骨培养液中ALP和OCN检测呈阳性;骨髓基质细胞在HAB支架内附着紧密,生长良好。结论 人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞在体外具有有效的成骨功能,是一种较为理想的骨组织工程材料。     

冲击波诱导人骨髓基质细胞成骨分化及机制的研究

目的 观察出生后人骨髓基质细胞(hIMSCs)在体外培养条件下增殖与分化的特点；研究适宜能量冲击波对出生后hMSCs成骨分化的作用及机制。方法 抽取健康自愿者髂骨骨髓，采用密度梯度离心法进行hMSCs体外培养。设冲击波组(SW组)与对照组，应用不同能量级冲击波对SW组原代细胞进行处理，根据细胞活力测定与集落形成数量确定适宜的冲击波能量值。应用适宜的冲击波能量处理hMSCs原代细胞并传代培养，采用倒置显微镜观察、细胞增殖活力测定、ELISA法检测细胞分泌TGF-81、茜素红染色、钙钴法染色、四环素荧光标记、细胞分泌碱性磷酸酶测定和逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨钙素mRNA表达等方法，对SW组和对照组的各代细胞形态、增殖与分化及其机制进行探讨。结果冲击波处理体外原代培养hMSCs的适宜能量为10kV(500)。SW组细胞在冲击波处理后早期分泌TGF-B1显著高于对照组(P＜0．001)。SW组与对照组细胞在形态学方面第3代前无明显差别；SW组各代细胞分泌碱性磷酸酶显著高于对照组(P＜0．01)；茜素红染色、钙钴法染色、四环素荧光标记等显示SW组细胞的成骨作用明显优于对照组；SW组细胞经冲击波处理后第10天应用RT-PCR方法可以检测到骨钙素mRNA的表达，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．001)。结论 冲击波对体外培养的出生后人骨髓基质细胞具有促进成骨分化的作用，适宜能量为10kv(500)，其机制之一为TGF-B1介导的促hMSCs成骨分化作用。10kV(500)能量级的冲击波对体外培养的hMSCs增殖无影响，大于该能量的冲击波具有抑制细胞增殖的作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞复合n-HA/PLA支架异位成骨的实验研究

[目的]研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸(n-HA/PLA)支架材料体内异位成骨情况.[方法]取SD大鼠股骨胫骨骨髓,进行贴壁培养BMSCs,将第3代BMSCs接种到n-HA/PLA支架材料上,加入成骨诱导液,3d后置人大鼠体内,设为实验组;将单纯支架材料置入组为对照组.4、8、12周时取材进行大体和组织学观察.[结果]8、12周时实验组可见类骨质成分形成,并且支架材料维持置入时形状,对照组无类骨质形成.[结论]BMSCs复合n-HA/PLA构建组织工程骨有很好的异位成骨能力,且能在体内维持良好塑型.     

成人间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞的研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值.方法 抽取健康成年骨髓,Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法经连续传代后改用含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的条件培养基培养,在相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪细胞表面分子标志鉴定,免疫组化和RT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋门的表达,同时测定细胞内碱件磷酸酶的含量.结果 BMSCs原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养后细胞形态向成骨细胞转化,经RT-PCR、流式细胞仪、细胞碱性磷酸酶活性、糖原染色鉴定为成骨细胞.结论 BMSCs经合理的体外诱导培养后符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源.     

骨髓基质干细胞在骨内示踪方法的研究

目的探讨狗骨髓基质干细胞（MSCs）的骨内示踪技术。方法体外培养、增殖骨髓基质干细胞,并在体外以Brdu、PKH-26标记,将标记好的细胞移植回狗股骨头内,观察细胞的示踪情况。结果Brdu、PKH-26均能有效的标记骨髓基质干细胞,其标记率分别为85％、93％;移植细胞1个月后狗股骨头内可见到明显的Brdu着色的成骨细胞,PKH-26标记法可见股骨头内明显的PKH-26着色,但有染料外渗现象发生。结论Brdu是外源性细胞体内示踪理想的标记方法,PKH-26如能注意要点,也是一种比较有效、实用的标记方法。     

骨髓基质细胞促进引导性骨再生的研究

目的观察骨髓基质细胞增强引导性骨再生（GBR）修复骨缺损的能力。方法30只兔造成双桡骨干15mm骨缺损，以硅胶管桥接骨断端，实验组在硅胶管内注射自体骨髓基质细胞（MSC）1ml；对照组注射等量生理盐水。在不同时间内作X线片、大体、组织学观察及生化捡测。结果实验组成骨活跃，10周骨缺损完全修复，对照组各时间点骨修复均较实验组差，10周时仍无1只兔骨性愈合。术后4周实验组钙及碱性磷酸酶含量明显高于对照组（P〈0．01），术后8及10周实验组骨缺损区新生骨骨痂密度与相邻尺骨密度比值亦明显高于对照组（P〈0．01）。结论自体骨髓基质细胞可明显增强GBR修复骨缺损的能力。     

辛伐他汀在骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中的作用

目的 通过对小鼠骨髓干细胞体外培养的观察，研究辛伐他汀在骨髓基质干细胞向成骨细胞定向分化过程中的作用。方法 取雄性6周ICR小鼠股骨骨髓基质细胞进行原代和传代培养，应用组织化学及yon Kossa方法检测细胞碱性磷酸酶染色和细胞外基质矿化；在细胞培养早期加入辛伐他汀(实验组)或保持基础培养条件(对照组)，应用半定量RT-PCR方法分别检测两组Ⅰ型胶原蛋白(COL1)、碱性磷酸酶(ALP)、转录因子CBFA1和Osterix(OSX)在成骨细胞分化过程中的表达。结果 小鼠骨髓基质细胞经体外诱导后分化为具备碱性磷酸酶活性和矿化细胞外基质的成熟成骨细胞。实验组COL1、ALP和CBFA1表达在细胞培养第3，5天均高于对照组，OSX表达差异不明显。结论 辛伐他汀在成骨细胞分化过程中促进其相关基因的表达。     

骨髓基质细胞体内成骨分化研究

目的探讨将自体骨髓基质干细胞（BMSCs）移植到股骨头缺损坏死部位后能否成活、增殖,并向成骨分化,促进骨修复。方法取狗犬髂骨骨髓,体外培养扩增BMSCs,经5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记,移植到股骨头骨缺损模型。术后5周取材。行大体组织观察,组织化学染色,免疫组化检测骨钙素、骨桥素。结果BMSCs能增加骨缺损区内的成骨量、提高骨基质矿化的程度和骨成熟度,提高成骨细胞分化特异性标记物骨钙素、骨桥素的表达。新骨形成越活跃的地方,BrdU阳性细胞数目越多,很多成骨细胞BrdU阳性,新骨形成区的很多血管壁也分布着BrdU阳性细胞。结论移植的骨髓细胞在股骨头内能成活,并能停留在骨坏死、缺损部位生长增殖。移植的BMSCs能分化成为多种细胞,包括成骨细胞、血管壁细胞等。BMSCs不但能直接通过分化成成骨细胞参与成骨,也能通过参与血管形成而促进成骨。     

改良法体外诱导骨髓基质干细胞分化为类许旺细胞

目的　探讨一种较为有效的诱导方法将骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为类许旺细胞。　方法　用Dezawa所述方法 (称为传统诱导法 )加以改良成将所有诱导剂一起联合半量间隔诱导两次的方法 (称为改良诱导法 ) ,诱导后的细胞从形态学、抗S 10 0和抗GFAP细胞免疫化学染色的阳性率、MTT细胞活性测定及流式细胞仪检测细胞DNA含量来比较此两种方法对细胞的综合作用。　结果　改良法诱导的细胞在形态上更具有许旺细胞的长梭形外观 ,抗S 10 0及抗 GFAP阳性率分别由5 8 1%和 60 3 %提高到 79 4%、81 2 % (P <0 0 5 ) ;MTT法细胞活性测定表明改良法对细胞活性影响小(P <0 0 1) ;流式细胞仪DNA含量测定显示S期DNA含量较高 (P <0 0 5 )。　结论　改良法体外诱导骨髓基质干细胞为类许旺细胞具有诱导效果更好 ,对细胞损害小的优越性。     

人骨髓基质细胞支持脐血单个核细胞体外扩增

目的探讨人骨髓基质细胞(HBMSC)对脐血(CB)单个核细胞(MNC)体外扩增的支持作用及寻找最佳的收获时机。方法将从CB标本中分离出的MNC接种于已建立的无血清培养体系(含或不含HBMSC及细胞因子支持),在0、6、10及14d检测MNC数、CD34 细胞数及集落形成单位(CFU)数。结果在体外培养过程中,各时间点相同条件下,有HBMSC层支持组的各项测量指标均较其他组高(P<0.05),其中HBMSC联合外源性细胞因子组扩增效果最佳。体外培养6～10d时,以上各项指标基本上达到最高值。结论HBMSC联合外源性细胞因子能实现CB在体外的有效扩增,此体系可能是扩增造血干、祖细胞的较理想方案。体外培养6～10d是收获的最佳时间。     

Effect of serum on human bone marrow stromal cells: ex vivo expansion and in vivo bone formation

BACKGROUND: Bone marrow stromal cell (BMSC) transplantation may offer an efficacious method for the repair of bone defects. This approach has been developed using BMSCs expanded ex vivo in medium with fetal bovine serum (FBS). For clinical applications, however, contact of BMSCs with FBS should be minimized. We studied the effect of FBS substitutes on both human BMSC proliferation in vitro and subsequent bone formation in vivo. METHODS: BMSC proliferation was measured by colony forming efficiency (CFE) and by cell numbers at consecutive passages. Bone formation was studied in 6- to 8-week-old transplants of human BMSCs in immunocompromised mice. RESULTS: Medium with FBS was more effective in stimulating BMSC proliferation than medium with either human serum (HS) or rabbit serum (RS). Compared to bone formed by BMSCs cultured continuously with FBS, bone formed by cells cultured with HS, or with FBS switched to HS, was considerably less extensive, while bone formed by cells cultured with FBS switched to serum-free medium (SFM) was considerably more extensive. The increase in bone formation was due to neither the SFM components nor to the proliferation status of BMSCs prior to transplantation. CONCLUSIONS: Our data demonstrate that for ex vivo expansion of human BMSCs, medium with FBS remains most effective. However, incubation of human BMSCs in SFM prior to in vivo transplantation significantly stimulates subsequent bone formation. This finding increases the practicality of using culture-expanded BMSCs for autologous human transplantation and suggests the presence of osteogenic inhibitors in serum.     

腺病毒介导hVEGF编码基因转染骨髓基质干细胞的实验研究

目的应用携带hVEGF基因的重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),观察hVEGF的表达情况。方法体外培养大鼠骨髓基质干细胞,含hVEGF基因的重组腺病毒转染骨髓基质干细胞,转染后在荧光显微镜下观察并采用ELISA法检测hVEGF的表达水平。结果 rAd-hVEGF转染骨髓基质干细胞后,ELISA检测发现转染组上清液中hVEGF蛋白分泌量明显高于对照组(P<0.01)。结论 rAd-hVEGF转染大鼠骨髓基质干细胞能够表达并分泌hVEGF,为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供可行性研究。