反义人端粒酶RNA组分基因对胃癌细胞端粒酶活性的影响

目的 克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分（hTR）基因片段并构建其正交和反义真核表达载体，研究反义端粒酶RNA对人胃癌细胞株MKN－45端粒酶活性的影响。方法 采用RT－PCR方法从人胃癌细胞株MKN－45中扩增出人hTR部分cDNA序列，将该片段分别正向的反向插入PEF6V5－His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分（hTR）基因正，反义真核表达载体，随后采用脂质体转染法将该正，反义载体转染入人胃癌细胞株MKN－45，用TRAP法观察后端粒酶活性的改变。结果 所克隆的基因片段其碱基序列与献报导完全一致，且插入载体的方向完全正确。与正常对照，转染正义载体，空载体比较，转染反义载体端粒酶活性显下降。结论 本实验已成功克隆和人端粒酶RNA组分（hTR）基因的部分序列并成功构建hTR正反义真核表达载体，而且反义端粒酶RNA能有效降低人胃癌细胞株MKN－45端粒酶活性。     

反义人端粒酶RNA亚基对胆囊癌端粒酶活性及细胞生长的抑制作用

目的探讨反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对胆囊癌细胞生长增殖的作用。方法根据测定的胆囊癌人端粒酶RNA亚基(hTR)基因的序列结果，并根据真核表达载体多克隆酶切位点的物理图谱，体外合成反义RNA及正义RNA的基因序列，并构建入pTriEx-4真核表达载体，酶切鉴定正确后，采用脂质转染法导入胆囊癌细胞。TRAP法检测端粒酶活性。流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况，电镜观察细胞微观形态变化。结果实验组胆囊癌细胞的端粒酶活性较对照组明显减低，正义组、转染空载体及单纯脂质体转染的细胞端粒酶活性与未转染细胞比较则变化不明显。反义RNA基因作用后，G0／G1期细胞比例明显增高，S期细胞比例明显降低。细胞的分裂、增殖受到明显抑制。反义RNA基因转化后，10d凋亡率为11．10％。13d后凋亡率为29．02％。电镜下可见明显凋亡细胞。结论反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性有明显的抑制作用；并抑制胆囊癌细胞的生长，促进细胞的凋亡；且克服了反义寡核苷酸作用时间短的缺点。     

反义硫代寡核苷酸对人膀胱癌细胞端粒酶活性的影响

目的探讨端粒酶抑制剂对膀胱癌BIU-87细胞端粒酶活性的影响.方法用TRAP-ELASA法检测端粒酶抑制剂反义硫代寡核苷酸(asONS)对膀胱癌BIU-87细胞及其细胞裂解物端粒酶活性的影响.结果 asONS能够部分抑制人膀胱癌BIU-87细胞端粒酶的活性,呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性;asONS与细胞裂解物直接作用组同作用细胞组相比,端粒酶活性下降的更为明显.结论 asONS如何有效通过细胞膜将是保证疗效的关键.     

端粒酶反义寡核苷酸对乳腺癌端粒酶活性及细胞生长的影响

目的　探讨端粒酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞端粒酶活性的影响及抑制端粒酶活性以控制乳腺癌细胞生长的可能性。方法　采用 10 μmol/L与端粒酶催化亚基 (hTRT )mRNA互补的反义寡核苷酸处理乳腺癌细胞 ;于处理后 2 4、72h用端粒重复序列扩增及酶联免疫吸附方法检测细胞端粒酶活性 ;于处理后 72h以流式细胞术测定细胞周期 ;于处理后 12 0h采用原位末端标记法检测细胞凋亡。结果　经hTRT反义寡核苷酸作用后 ,细胞端粒酶活性明显受到抑制 ,至作用后 72h ,端粒酶活性较对照组降低 65 .6% (P <0 .0 5 ) ;细胞生长明显受到抑制 ;细胞周期发生显著变化 :G0 /G1期细胞数增多 ,S期及G2 /M期细胞数则减少 ;细胞增殖指数由 0 .46降低至 0 .2 5 ;并可观察到凋亡细胞的出现 ,凋亡发生率为 12 .5 % ;而无义组及空白对照组以上各指标均无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论　端粒酶反义寡核苷酸可明显抑制乳腺癌细胞端粒酶活性 ,抑制细胞生长和增殖 ,诱导细胞凋亡 ;表明应用反义技术抑制端粒酶活性治疗乳腺癌具有广阔的前景。     

端粒酶反义RNA基因转染抑制裸鼠人膀胱癌移植瘤生长的研究

目的　观察端粒酶反义RNA基因转染对裸鼠膀胱癌移植瘤细胞生长的影响。方法将脂质体介导的端粒酶反义RNA真核表达载体 (pBBS hTR)、空载体 ( pBBS 2 12 )及生理盐水注入移植瘤体内 (每天 3 0 0 μl,共 7d) ,应用端粒酶活性聚合酶链反应 酶联免疫吸附试验 (PCR ELISA)、苏木素 伊红 (HE)染色、透射电镜等连续观察 6周移植瘤组织细胞端粒酶活性和生长变化。结果　注射转染pBBS hTR组和空载体组瘤体积抑制率分别为 48.7%和 2 .8% (P <0 .0 5 )。转染pBBS hTR组端粒酶活性降低 ,细胞生长受抑制。电镜观察见典型凋亡特征。 结论　端粒酶反义RNA基因瘤体内注射转染有效地抑制裸鼠人膀胱癌细胞生长 ,具有潜在临床应用价值。     

反义寡核苷酸对胆囊癌细胞端粒酶活性作用的实验研究

目的：探讨反义寡核苷酸对胆囊癌细咆端粒酶活性的影响及对胆囊癌细咆生长增殖的作用。方法：设计针对端粒酶RNA亚基模板序列并经硫代磷酸修饰的反义、正义和随机序列寡核苷酸，并以正常人成纤维细胞作对照，观察其对人胆囊癌细胞（GBC—SD）端粒酶活性和细胞生长增殖的影响作用以及对正常人成纤维细胞的作用。结果：反义寡核苷酸可有效地抑制胆囊癌细胞的端粒酶活性，呈剂量依赖性，并明显的抑制胆囊癌细胞的生长，对正常人成纤维细胞生长无明显作用。结论：硫代反义寡核苷酸（PS-ODN）对胆囊癌端粒酶活性有明显的抑制用并促进细胞凋亡。     

反义人类端粒酶 RNA逆转录病毒载体构建及其对结直肠癌细胞的抑制作用

目的 研究反义人类端粒酶RNA逆转录病毒载体对结直肠癌HT29细胞端粒酶活性及细胞生长的抑制作用。探讨以端粒酶为酸点的结直肠癌基因治疗的可能性。方法 将端粒酶hTR的cDNA反向插入逆转录病毒载体pLXRN中，转染包装细胞PT67后获得反义重组病毒，感染结直肠癌HT29细胞，采用RT-PCR检测hTR表达。端粒酶重复扩增法（telomerase repeat amplification protocol,TRAP)检测端粒酶活性，绘制生长曲线了解细胞生长状态，倒置显微镜观察和DNA片段电泳检测细胞凋亡。结果 反义hTR作用后的结直肠癌细胞hTR表达下降，端粒酶活性和细胞生长受到明显抑制，细胞出现凋亡。结论 反义hTR对结直肠癌HT29细胞的生长和端粒酶活性具有明显的抑制人舰艇可能以hTR为靶点对结直肠癌进行基因治疗。     

端粒酶反义RNA影响人肝癌细胞系HepG2生长的初步报告

目的探讨抗端粒酶在肝细胞癌治疗中的意义。方法将反义hTR真核表达载体经脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化及致瘤性。结果形态学观察,转染后HepG2细胞出现典型的凋亡现象。FCM检测发现G1期前出现凋亡峰,凋亡率为4·2%。在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。HepG2/pBBS212细胞的瘤体抑制率为2·4%,与HepG2/pBBS212-hTR细胞的25·6%相比,差异有显著性(P<0·05)。结论转染端粒酶反义RNA能抑制肝癌HepG2细胞的恶性表型,促进其凋亡。     

反义端粒酶RNA抑制肿瘤细胞的研究进展

端粒酶具有很高的肿瘤特异性,迄今发现约90％的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性,而大部分正常细胞不表达端粒酶.抑制端粒酶活性是目前肿瘤治疗的一个新靶点.端粒酶RNA组分中含有与端粒DNA序列互补碱基模板序列,针对该模板序列设计的反义核甘酸可阻断其模板作用,从而使端粒酶合成端粒DNA序列.如此既能高特异性杀死、杀伤肿瘤细胞,对正常组织又不会造成大的毒副作用,因而成为一个很有吸引力的基因治疗靶点.     

乙型肝炎病毒X基因转染人胆管癌细胞系及对端粒酶逆转录酶mRNA表达的影响

目的了解乙型肝炎病毒X(HBx)基因转染对胆管癌细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达影响,阐明HBx基因调节hTERT基因转录表达在胆管癌发生中的意义。方法体外培养胆管癌细胞QBC939,应用脂质体介导的基因转染技术,将含HBx基因的真核表达载体转染到胆管癌细胞中;转染36h后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达判定转染成功率,流式细胞仪检测转染率;收集细胞提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析转染后细胞内hTERT mRNA的表达变化,并通过细胞免疫化学和Western Blotting了解转染后胆管癌细胞内有无HBx蛋白的表达。结果转染含HBx基因表达载体和空载体的QBC939转染率为29．6％;转染HBx基因后hTERT mRNA表达量比未经转染或转染空载体的hTERT mRNA表达量明显增加;细胞免疫组化和Western Blotting也证实只在转染了HBx基因的胆管癌细胞有HBx蛋白表达。结论HBx基因转染能上调胆管癌细胞hTERT mRNA的转录表达。     

反义MBD1基因片段真核表达载体的构建及鉴定

目的构建反义MBD1基因片段真核表达载体,为研究MBD1基因功能提供工具.方法根据MBD1基因cDNA序列中编码序列,设计PCR引物,在引物5＇端分别添加Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点,将PCR片段反向插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）的多克隆位点上,构建反义MBD1基因片段真核表达载体,并用PCR、酶切法和DNA测序鉴定.结果PCR鉴定得到322 bp特异性条带,双酶切得到327 bp目的基因片段和5.4kb载体片段,DNA测序说明插入片段序列是正确的.结论采用基因克隆技术,成功构建了反义MBD1基因片段真核表达载体,为研究MBD1基因在DNA甲基化和肿瘤发生中的功能提供了实验工具.     

短发夹状RNA对PC-3M细胞端粒酶逆转录酶基因表达和端粒酶活性的影响

目的:研究短发夹状RNA(shRNA)对PC 3M细胞中端粒酶逆转录酶(hTRT)基因表达及端粒酶活 性的影响。方法:构建针对hTRT基因的shRNA表达质粒psilencer TRT,在质脂体介导下转染人前列腺癌PC 3M细胞,应用RT PCR及免疫组织化学检测hTRTmRNA及蛋白表达水平,应用SYBR Green染色法检测端粒 酶活性的变化。结果:重组体psilencer TRT转染细胞24h和48h后显著下调hTRTmRNA及蛋白水平,作用 48h后,其抑制率分别为85.39%和79.17%,较空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。同时,随着时间的延 长,端粒酶活性亦有明显下降(P<0.01)。结论:利用短发夹状RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为前 列腺癌的基因治疗提供新思路。     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.