基于实时荧光定量PCR技术的当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量测定方法的开发及比较

目的:对当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的变化情况进行定量分析。方法:建立了实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR),对不同产地、不同收集企业、不同储藏时间当归饮片中金黄色葡萄球菌进行定量分析。荧光定量反应体系为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10μL,正向引物、反向引物(10μmol·L~(-1))各0.8μL,模板/基因组DNA 1μL,双蒸水7.4μL。荧光定量反应条件为①扩增曲线:94℃预变性30 s,94℃变性10 s,60℃退火12 s,72℃延伸30 s,循环45次,72℃单点检测信号;②熔解曲线:72℃开始检测,以0.5℃为台阶温度停留15 s采集荧光。根据Real-time PCR的测定结果,分别从生当归、酒当归和土炒当归中选择具有代表性的样品进行平板计数法测定,并与Real-time PCR检测结果进行比较。结果:不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量排序为生当归土炒当归酒当归;在不同产地的当归饮片中均以甘肃渭源地区样品所含的金黄色葡萄球菌含量为最低;与零售企业相比,生产销售企业的生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量较低;不同储藏时间对生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量有一定的影响,随储藏时间的增加,金黄色葡萄球菌的含量增加。对部分代表性样品进行检测时发现,平板计数法检测结果数量级较Real-time PCR低3～4个数量级。结论:建立的Real-time PCR的特异性、灵敏度、准确性以及报告周期均优于平板计数法,可为当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的快速、准确定量检测提供有效技术手段。     

基于生物热动力学的拳参对大肠埃希菌抑制作用

目的:测定不同产地、不同颜色拳参对大肠埃希菌生长代谢的影响,从生物热力学角度研究拳参对大肠埃希菌的抑制作用。方法:用微量热法测定18批拳参作用于大肠埃希菌生长代谢的热谱曲线,取得达峰时间(t_1,t_2),最大产热功率(P_(max1),P_(max2)),生长速率常数(k_1,k_2),抑制率(I)4个主要参数。结果:河北、山东、安徽产拳参可延长大肠埃希菌第二指数生长期达峰时间(t_2),降低最大产热功率(P_(max2))及生长速率(k_2),湖北产拳参与其他产地样品趋势不同;各产地拳参对第一指数生长期的峰时间(t_1),降低最大产热功率(P_(max1))及生长速率(k_1)均无影响。不同产地拳参样品对大肠埃希菌抑制率不同(I),河北、山东、安徽产拳参抑制率在20%~50%,湖北拳参样品抑制率较低。同一批次不同颜色拳参样品抑制率有差异,9个批号样品中,7批棕红色饮片抑制率高于紫红色饮片。结论:不同产地棕红色及紫红色拳参对大肠埃希菌的生长代谢曲线均有不同程度的抑制作用,其差异原因有待进一步研究。     

千里光消除大肠埃希菌R质粒的实验研究

目的:评价千里光消除大肠埃希菌R质粒的效果。方法:对从本院尿路感染患者尿液中分离出的大肠埃希菌R质粒进行检测,随机选取60只小鼠,采用随机数字表法分为2组,对照组采取空白对照,小鼠经口感染大肠埃希菌,实验组小鼠经口感染大肠埃希菌后口服千里光浓缩液,观察并比较从2组小鼠大肠分离出的大肠埃希菌对抗生素的耐药性情况,与大肠埃希菌R质粒消除率。结果:实验组在含有四环素、氨苄青霉素、链霉素的药物平板上的消除大肠埃希菌R质粒菌落数均多于对照组(P<0.05)。实验组大肠埃希菌R质粒消除率高于对照组(P<0.01)。结论:中药千里光在消除大肠埃希菌R质粒方面具有良好的效果,在含有四环素、链霉素、氨苄青霉素的抗生素药物平板上仍可有效清除大肠埃希菌R质粒,安全、有效。     

大肠埃希氏菌生物膜对山苍子精油的抗性研究

目的 研究大肠埃希氏菌生物膜对山苍子精油的抵抗力.方法 采用Brown平板改良法体外复制大肠埃希氏菌生物膜模型,扫描电镜确认后应用载体定量杀菌试验对其进行实验研究.结果 培养3d的大肠埃希氏菌生物膜对体积分数2.5%的山苍子精油耐受时间最短,作用20 min完全被杀灭;培养7d的金黄色葡萄球菌生物膜对体积分数0.75%山苍子精油耐受时间最长,作用150 min才被完全清除,用大肠埃希氏菌浮游菌滴染滤膜经体积分数2.5%山苍子精油处理后,均在10 min内被完全杀灭.结论 形成生物膜的细菌对山苍子精油的抵抗力比浮游菌强,随着生物膜形成时间延长,抵抗力明显增加.     

尿路感染大肠埃希菌耐药和基因型的流行病学分析

目的探讨尿路感染大肠埃希菌的耐药性及基因型,为抗感染治疗提供理论依据。方法收集56株尿路感染大肠埃希菌,采用多位点序列分型方法对细菌进行基因分型,采用琼脂平板倍比稀释法检测细菌的最低抑菌浓度,双纸片协同法检测超广谱β-内酰胺酶,采用PCR扩增ESBLs基因。结果 56株大肠埃希菌共分为21个基因型,其中ST405基因型最多占30.4%(17株),其次为ST301基因型。56株大肠埃希菌除对碳青霉烯类、阿米卡星敏感性较高外,对其他抗菌药物均具有较高的耐药性。ST405型菌株对青霉素类药物的耐药率显著高于其他分型菌株(P0.05)。大肠埃希菌ESBLs检出率为51.8%。PCR扩增结果显示CTX-M和OXA的阳性率分别为48.2%和19.6%,未扩增出其他耐药基因。结论尿路感染大肠埃希菌中对大多数抗菌药物具有较高的耐药性,ST405是最多的基因型。     

12种中药免煎颗粒剂体外抑菌活性研究

目的研究12种常见中药免煎颗粒对大肠埃希菌的抑制作用。方法采用96孔板倍比稀释法测定其最低抑菌浓度(MIC)。结果酒黄连免煎颗粒对大肠埃希菌的抑制作用最强,MIC为15.63mg/ml,黄芩MIC为31.25mg/ml,黄连片及大黄MIC均为62.5mg/ml,连翘抑菌作用弱,MIC为250mg/ml,黄柏、苦参、黄芪、牛膝、昆布、牡蛎、当归无抑菌作用。结论 :酒黄连、黄芩、黄连片、大黄免煎颗粒剂对大肠埃希菌有明显抑制作用,连翘抑菌作用弱,黄柏、苦参等无抑制作用;酒黄连的抑菌作用大约是普通黄连片的4倍。     

两面针根和茎的抗菌部位研究

目的:研究两面针根和茎不同极性部位对5种菌株的抗菌活性,为评价两面针根和茎的抗菌作用提供实验依据。方法:应用液体试管两倍稀释法测定两面针根和茎各部位对大肠埃希菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌进行最低抑菌浓度和样品Ⅵ的最低杀菌浓度测定。用平板菌落计数法测定茎的乙酸乙酯部位作用于大肠埃希菌和沙门氏菌不同时间的活菌落数,绘制菌落存活率与时间关系的杀菌曲线图(KCs)。结果:茎的乙酸乙酯部位抗菌活性最好,对所试验的5个菌株均有不同程度的抗菌活性,其中对大肠埃希菌的抗菌活性最强,其MBC和MIC分别为93.8和46.9μg/ml;其次是沙门氏菌,其MBC和MIC分别为750和187.5μg/ml,且杀菌作用迅速。根的正丁醇部位对白色念珠菌的抗菌活性最佳,其MIC为187.5μg/ml。结论:两面针根和茎不同极性部位的抗菌活性不同,可考虑综合应用两面针植物资源。     

EDTA纸片-头孢西丁平板试验检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒介导的AmpC酶

目的建立并评价检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒介导的AmpC酶的ED-TA纸片-头孢西丁平板试验(E-CAM)。方法以阴沟肠杆菌029M和大肠埃希菌ATCC25922作质控,用E-CAM和酶粗提物三维试验(TDEM)同时检测临床分离的头孢西丁不敏感大肠埃希菌(14株)和肺炎克雷伯菌(13株)的AmpC酶,对2种方法进行比较。结果E-CAM试验应用4 mg/L头孢西丁平板和750μg EDTA纸片进行检测,其结果与TDEM试验基本一致,总符合率为96%。结论该方法操作简便、结果易于判读,在一块平板上可同时进行多株菌的检测,适于各级临床微生物实验室应用。     

蟾酥逆转大肠埃希菌耐药性的研究

目的：探讨蟾酥对耐药大肠埃希菌的体外抗菌效果及其逆转细菌耐药的部分机理。方法：分别检测水提蟾酥和醇提蟾酥对耐药大肠埃希菌的最小抑菌浓度（MIC）,采用PCR方法分别检测与低于一个MIC浓度梯度的水提蟾酥和醇提蟾酥作用前、作用1、5、10天的耐药大肠埃希菌耐药基因（TEM、SHV、DHA、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-9、OXA-2、OXA-10、oprD2）,同时采用RT-PCR方法检测阳性耐药基因mRNA的表达情况。结果：水提蟾酥和醇提蟾酥对耐药大肠埃希菌的最小抑菌浓度分别为1：4,1：8,耐药大肠埃希菌的TEM和CTX-M-9基因在蟾酥作用前后均为阳性,其余耐药基因在蟾酥作用前后均为阴性,蟾酥作用前及作用1天后,耐药大肠埃希菌的TEM和CTX-M-9的mRNA为阳性,而作用5天后,TEM和CTX-M-9的mRNA检测阴性。结论：耐药大肠埃希菌携带多种耐药基因,蟾酥具有逆转耐药大肠埃希菌的耐药性,其逆转机理可能与其抑制耐药基因表达有关。     

大肠埃希菌院内感染特点和临床耐药性分析

目的探讨产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌医院内感染的临床特点及临床耐药性。方法回顾分析173例大肠埃希菌院内感染患者的临床资料。结果大肠埃希菌感染以呼吸道为主,主要分布在泌尿外科、ICU和呼吸内科,临床耐药率以哌拉西林最高。结论临床应尽可能缩短各种留置管留置时间,合理规范使用现有抗菌药物,提高抗感染治疗效果,降低大肠埃希菌所致院内感染的发病率。     

基于HS-SPME-GC-MS分析阿胶、龟甲胶、鹿角胶3种动物胶蛤粉烫炮制前后挥发性成分变化

目的 分析探讨蛤粉烫对阿胶、龟甲胶、鹿角胶3种动物胶挥发性成分的影响.方法 采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)对阿胶、龟甲胶、鹿角胶3种动物...     

基于斑马鱼模型的补骨脂不同炮制品水提物急性毒性及肝毒性差异比较

目的 根据历代医籍和本草记载的炮制方法,对比补骨脂Psoraleae Fructus不同炮制品水提物的急性毒性和肝毒性差异,为补骨脂的炮制方法使用提供参考。方法 采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱和标准曲线法对补骨脂生品和补骨脂不同炮制品水提物进行补骨脂素和异补骨脂素的含量测定,并以AB野生型斑马鱼、Tg(lfabp:EGFP)肝脏细胞绿色荧光标记转基因斑马鱼和Tg(lysc:DsRed2)中性粒细胞红色荧光标记转基因斑马鱼为实验动物模型,给予补骨脂生品和补骨脂不同炮制品的水提物通过观察补骨脂不同炮制品对斑马鱼的半数致死浓度（median lethal concentration,LC50）、最小致死浓度（minimum lethal concentration,LC1）、斑马鱼形态变化、畸形评分等的影响,比较补骨脂不同炮制品的急性毒性差异。通过观察不同给药组对斑马鱼肝脏荧光强度、肝脏面积和体积、肝脏病理切片情况、肝脏区域中性粒细胞数量的影响,以及检测炎症相关基因的m RNA水平变化情况,综合评价补骨脂不同炮制品的肝毒性差异。结果 补骨脂不同炮制品水提物中补骨脂素和异补骨脂素含量存...     

水提取法和仿生提取法研究水蛭不同炮制品的体外抗凝活性

为确定水蛭传统炮制的科学性,分别采用水提取法和仿生提取法提取水蛭清水吊干品、滑石粉烫制品、酒浸闷烘品中的抗凝活性成分,以活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、抗凝血酶活性作为活性指标进行抗凝测定,并采用考马斯亮蓝法,测定各炮制品提取物中的蛋白含量以初步解释抗凝活性变化原因。对比发现,采用水提取法时,APTT,PT,TT,抗凝血酶活性4种指标结果均显示,滑石粉烫制或酒浸闷烘后水蛭的抗凝活性降低,活性顺序为清水吊干品酒浸闷烘品滑石粉烫制品,此结果与水蛭不同炮制品水提物蛋白含量顺序一致;而采用仿生提取法时,除滑石粉烫制后APTT缩短外,其他结果均显示炮制使水蛭抗凝活性升高,且活性顺序为酒浸闷烘品滑石粉烫制品清水吊干品。仿生提取法与水提取法相比更符合水蛭口服后在人体内的吸收过程,结果更具科学性。所以,传统的炮制方法不仅可以矫味矫臭,还可增强水蛭的抗凝活性作用。     

芍药Actin基因在大肠杆菌中的高效表达

目的构建芍药Paeonia lactiflora Actin(Pl Actin)基因原核表达载体,优化Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。方法基于Pl Actin基因c DNA序列及原核表达载体p ET-32a(+)多克隆位点序列,设计一对5’末端分别插入Bam H I和Hind III酶切位点的特异性PCR引物,基于RT-PCR技术亚克隆Pl Actin基因;用Bam H I和Hind III双酶切重组质粒p MD18-T-Pl Actin和原核表达载体p ET-32a(+),胶回收纯化目的基因和空载体,连接、转化后应用菌落PCR、质粒PCR和双酶切鉴定出重组子p ET-32a(+)-Pl Actin,转化BL21(DE3)菌株获得基因表达工程菌;分别设置诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度梯度、诱导的菌体起始密度梯度及表达时间梯度,诱导Pl Actin基因在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝R250染色后制备干胶并比较重组Actin蛋白的表达量。结果亚克隆测序结果表明Pl Actin与目的序列完全一致,且其编码区序列(CDS)上下游成功插入了Bam H I和Hind III酶切位点;成功构建了芍药原核表达载体p ET-32a(+)-Pl Actin;诱导剂IPTG的最佳浓度为0.1 mmol/L,诱导的菌体起始密度(A600)为0.4~0.6,最佳表达时间为4 h。结论构建了Pl Actin基因原核表达载体p ET-32a(+)-Pl Actin,建立了Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。     

黔产铁苋菜不同炮制品中活性成分含量比较

目的:比较铁苋菜不同炮制品中没食子酸、总黄酮的含量,探讨炮制方法对铁苋菜活性成分的影响。方法:采用HPLC测定没食子酸含量,流动相乙腈-0.05%磷酸(4∶96),检测波长270 nm;以芦丁为指标成分,运用UV测定总黄酮含量,检测波长515 nm。比较铁苋菜炒黄品、炒焦品、炒炭品、酒炙品、醋炙品、生品中没食子酸和总黄酮的含量差异。结果:铁苋菜炮制前后没食子酸和总黄酮的含量发生了变化。各炮制品中没食子酸含量排序为炒黄品酒炙品醋炙品炒焦品生品炒炭品;总黄酮含量排序为醋炙品酒炙品炒焦品炒黄品生品炒炭品。结论:炮制方法对黔产铁苋菜中没食子酸和总黄酮含量具有一定影响,炒炭品中这2种成分含量最低。     

GC-IMS法比较不同方法炮制酒当归特异气味成分差异

目的比较酒洗、酒浸、酒炙等不同方法炮制酒当归挥发性特异气味成分差异,为建立当归不同炮制品鉴别方法和进一步研究当归传统方法炮制作用机制提供研究思路。方法气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)对不同浓度酒洗当归及不同方法炮制当归样品挥发性成分进行检测并比较成分变化;结合SIMCA 14.1软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)分析和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)分析其挥发性成分的差异。结果 GC-IMS指纹图谱显示不同浓度酒洗当归的挥发性成分存在差异,明确定性的挥发性成分有55种单体及部分物质的二聚体和聚合物;2-辛醇、E-2-庚醛、丙酮、2-戊酮和5-甲基-2-呋喃甲醇等可作为酒洗当归的特征挥发物质;醋酸乙酯、3-甲基-1-戊醇、2-己醇和2-甲基丁酸乙酯等可作为酒浸当归的特征风味物质;糠醛二聚体、3-甲基丁醇和苯甲醛等可作为酒炙当归的特征挥发性物质;PCA结果显示,各组样品分离度良好;PLS-DA分析结果显示,2-十一烯醛、2-丁酮、丙酮等为不同浓度酒洗当归样品差异成分;OPLS-DA分析结果显示,2-十一烯醛、辛酸乙酯及二聚体、丙酮等为不同方法炮制的当归样品主要差异成分。结论 GC-IMS技术结合化学计量学方法证明当归酒洗、酒浸与酒炙挥发性成分存在差异,为进一步挖掘经方中传统炮制方法的研究提供参考。     

麦芽炒制过程中炒制温度和时间对糖类成分的影响

目的建立麦芽中D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、D-麦芽糖4种糖类成分高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)检测方法,探索麦芽炒制过程中还原糖和非还原糖的动态变化规律,为阐明麦芽消食作用机制提供科学依据。方法收集不同炒制温度、不同炒制时间的麦芽,采用HPLC-ELSD方法测定生麦芽、炒麦芽样品中D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、D-麦芽糖4种糖类成分的量,采用聚类分析(HCA)法、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)法分析炒制过程中各成分的动态变化规律。结果麦芽中D-果糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖3种还原糖的量随温度增加整体表现为下降趋势,而非还原糖蔗糖表现为先升高后降低的趋势;HCA可将不同温度下炒制的麦芽分为3类,PLS-DA表明炒制温度主要影响蔗糖的量,而对还原糖D-果糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖影响较小且程度相当;随着炒制时间的延长,4种糖的量均呈降低趋势,16 min后基本不再变化。HCA可将不同炒制时间的麦芽分为4类;标准化A420值随炒制时间的增加而增加,在16 min基本达到峰值。结论麦芽在炒制过程中还原糖、非还原糖与氨基酸等成分直接或间接发生美拉德(Maillard)反应而导致其量的下降,其产物可能与麦芽消食作用有关。     

千金子制霜前后提取物对大鼠肠道菌群的影响

目的研究千金子制霜前后提取物对正常大鼠肠道菌群的影响,为进一步阐明千金子制霜减毒机制提供参考。方法大鼠ig高、中、低剂量的千金子生品和霜品提取物,采用平板菌落计数法考察千金子制霜前后大鼠粪便中4类代表性肠道菌群双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌的数量变化。结果平板菌落计数实验结果表明,ig千金子生品与霜品提取物后大鼠出现菌群失调现象,且千金子霜品较生品引起的菌群紊乱程度低,在低剂量给药时可使条件致病菌肠球菌和大肠杆菌的数量减少。结论千金子制霜前后提取物均会影响肠道菌群的生物多样性,影响肠道菌群平衡,且千金子制霜后对4类肠道菌群的作用减弱,引起肠道菌群紊乱程度减小,这与千金子霜品泻下作用缓和的研究结果相一致,表明从肠道微生态角度考察千金子制霜前后对肠道菌群的干预作用,可揭示制霜与肠道菌群数量变化可能存在相关性。     

鸢尾糖基转移酶编码基因ItUGT349和ItUGT419克隆及特性研究

目的 克隆获得鸢尾Iris tectorum糖基转移酶基因ItUGT349和ItUGT419,并对其进行生物信息学分析、基因差异表达检测和蛋白原核表达等特性分析。方法 以鸢尾转录组中筛选到的ItUGTs基因全长开放阅读框(open reading frame,ORF)设计特异性引物,进行PCR扩增,经测序后获得基因序列并进行生物信息学分析;通过荧光定量PCR(real-time PCR,qRT-PCR)进行基因差异表达检测;最后构建pET-32a(+)原核表达载体在大肠杆菌中表达蛋白。结果 PCR扩增ItUGT349和ItUGT419的ORF长度分别为1461、1488 bp,编码蛋白相对分子质量大小分别为53 830、54 910。荧光定量PCR显示,ItUGT349的表达量在叶片中最高,而ItUGT419在花器官中表达最高。进化树表明,ItUGT419与三萜类糖基转移酶聚类在一起,ItUGT349与三萜、黄酮和木质素等多种类型的糖基转移酶聚类到一支。ItUGT349和ItUGT419在大肠杆菌中均成功的表达出可溶性蛋白。结论 通过ItUGT349和ItUGT419基因全长ORF克隆,并对其进行序列分析,基因差异表达检测及原核表达等研究,为后续进一步鉴定其催化功能奠定基础。     

基于毛蕊花糖苷含量分析陈皮和砂仁在熟地黄炮制中的影响性研究

[目的] 针对熟地黄的药性特点，深入研究熟地黄炮制过程中，陈皮与砂仁对其炮制过程中毛蕊花糖苷含量的影响，并建立超高压液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）法检测熟地黄中毛蕊花糖苷含量的方法，并根据其含量变化，验证其炮制方法的科学性与合理性，为丰富熟地黄的炮制品种并建立其质量控制标准提供参考。[方法] 参考熟地黄在全国各省市《中药炮制规范》中的炮制方法，采用其中具有临床实用特色的方法，即：陈皮制熟地黄、砂仁制熟地黄（酒蒸法和拌制法），并以2015版《中华人民共和国药典》中熟地黄的质量标准为参照指标，采用UPLC-MS检测技术对其炮制过程中毛蕊花糖苷的含量变化进行研究，并结合性状评分，进行综合评价及统计学分析。[结果] 检测的线性范围为（1~1 000 ng/mL，r=1），其精密度、重复性、稳定性、准确度均较好（RSD<3%）。本实验中炮制后的熟地黄其毛蕊花糖苷的含量均超过药典标准，在炮制过程中当性状达到药典及传统标准时，其毛蕊花糖苷的含量能保持在较高水平，以陈皮制熟地黄后的毛蕊花糖苷含量最高，炮制过程中含量变化最显著。[结论] 陈皮制熟地黄可明显稳定和控制毛蕊花糖苷在熟地黄炮制过程中的下降趋势。这对通过相应的炮制方法，在有效保存熟地黄指标性成分的同时，扩大熟地黄临床使用范围有积极意义。同时UPLC-MS法由于操作简便、速度快、准确度高，可用于熟地黄炮制过程中毛蕊花糖苷含量的检测。