体外培养小鼠足细胞表达COX-2的实验研究

目的: 研究环氧合酶-2(COX-2)在小鼠足细胞中的表达情况,为进一步研究嘌呤霉素氨基核苷(PA)诱导足细胞凋亡过程中特异性COX-2的表达,以及特异性COX-2抑制剂对足细胞的保护作用建立实验基础.方法: 将体外培养的条件永恒的足细胞复苏并传代培养,采用Western blot法分析COX-2在足细胞中的表达.结果: 在33℃增殖状态下,足细胞呈鹅卵石状,在37℃分化状态下的足细胞呈分叉状.正常足细胞在37 ℃分化14 d后,用低血清培养液培养后,随着时间延长,COX-2表达逐渐增多,24 h达最高,以后逐渐减少.结论: COX-2在足细胞上的表达呈时间依赖性.     

星形胶质细胞条件培养液对体外海马神经元促生长作用的研究

目的：研究不同浓度的星形胶质细胞（AS）条件培养液对新生大鼠海马神经元生长活性的影响。方法：进行新生大鼠海马神经细胞的原代培养，AS条件培养液的制备，通过测量海马神经细胞胞体直径和轴突长度及应用MTT法观察AS条件培养液对海马神经细胞生长活性的影响。结果：AS条件培养液能明显促进海马神经细胞胞体直径及轴突长度的增加，增强海马神经细胞内琥珀酸脱氢酶的活性，而且以高浓度的AS条件培养液作用最为显。结论：AS条件培养液对体外培养的新生大鼠海马神经元有明显的促生长作用。     

体外培养大鼠皮层神经元和星形胶质细胞氧糖剥夺后DDR1的表达情况

目的:探讨DDR1蛋白在氧糖剥夺后的神经元细胞及星形胶质细胞中的表达情况,推测可能机制。方法:采用SD孕鼠的胚鼠皮层培养神经元,采用新生SD大鼠皮层培养星形胶质细胞。建立氧糖剥夺(OGD)损伤模型并随机分为神经元正常对照组、神经元OGD组、星形胶质细胞正常对照组和星形胶质细胞OGD组。噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活性;免疫荧光染色及Western blot方法检测各组DDR1的表达情况。结果:与正常对照组相比,OGD组细胞形态发生明显改变,MTT法测得细胞活性值降低;与神经元正常对照组相比,神经元OGD组的DDR1蛋白表达水平增加(P<0.05);与星形胶质细胞正常对照组相比,星形胶质细胞OGD组的DDR1蛋白表达水平无明显增加(P>0.05)。结论:OGD处理可诱导DDR1蛋白在大鼠皮层神经元中的表达,提示DDR1蛋白可能参与OGD后细胞凋亡等病理生理过程。     

大鼠海马神经元及星形胶质细胞的体外培养

目的：改进大鼠海马神经元、星形胶质细胞及两者混合状态的体外培养方法,获得高纯度的海马神经细胞。方法：选取孕期18~20 d 的SD 大鼠胎鼠作为原代海马细胞培养的材料来源。断头后于冰板上剥离双侧海马,去除表面血管及薄膜,利用眼科剪分离为小块。随后使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,将海马组织碎块移入酶消化液中。本方法选择Accutase 和0.1% DNase 作为酶消化液,37 ℃消化 15 min,期间轻柔振动。使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,终止消化。0.1% DNase 加入Neurobasal 和B-27 的混合液对消化后的海马组织碎块进行轻柔吹打,获得单细胞悬液。将悬液过200 目筛,进行细胞计数。将过筛的单细胞悬液移入DMEM 培养基（DMEM+10%胎牛血清）中,按照每平方厘米2.5×104 的细胞密度进行接种。经PDL 孵育的塑料片置于培养基底部。细胞于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。4 h 后,依据所需细胞种类的不同,更换相应培养基。海马神经细胞于培养后7~10 d 可用于实验。结果：通过本方法可得到高纯度的大鼠海马神经细胞,且根据实验需求,通过更换培养基,可得到纯神经元、纯胶质细胞及两者混合的三种培养状态。培养的神经元及星形胶质细胞纯度均>98%。结论：该文在传统海马神经细胞体外培养方法基础上,进一步降低了实验操作难度,方法稳定有效。     

人胚大脑皮层神经元细胞体外培养方法的建立

目的 建立人胚大脑皮层神经元的培养体系,研究神经元细胞的生长发育过程。方法 取妊娠30余周合法流产死亡4h以内的胎儿之大脑皮层额部组织,用胰蛋白酶消化为单细胞悬液。以2×10~6/ml密度接种于96孔培养板,24h后加入DNA抑制剂阿糖胞苷,培养1～12d,用相差显微镜观察神经元生长情况。并以尼氏体染色鉴定神经元,以台盼蓝拒染法细胞计数估算细胞的存活率。结果 神经细胞生长良好,胞体折光性强,神经突起明显,细胞形态清晰。第5天形成较稠密的网络联系;细胞存活率逐步下降,第3至第5天显著下降。由92.3％降至76.9％,以后趋于稳定。第7天为74.26％。尼氏小体染色第7天阳性率为88.25％。结论 体外培养3～5d的神经细胞属发育期;第5天细胞稳定生长;第6天神经细胞基本发育成熟。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法改良

目的建立大鼠大脑皮层星形胶质细胞(As)的培养方法,以进一步对大脑皮层As进行体外实验研究。方法在M cCarthy方法基础上改用出生后5 d的SD大鼠的大脑皮层,制备单细胞悬液后,接种于培养瓶,培养箱中1 h后换瓶,3 d后换液,细胞融合成单层后传代,传3代后采用间接免疫荧光法监测As特异性标志胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。阳性细胞确认为As。结果体外培养的大脑皮层As经历了贴壁、去除成纤维细胞、纯化和传3代,GFAP阳性细胞达95%以上。结论大脑皮层As体外培养成功,并有较高的纯度,为进一步进行As的研究创造了条件。     

体外原代星形胶质细胞分离培养方法的优化

目的：通过对国内外原代培养星形胶质细胞的不同方法的比较运用,旨在优化现有的星形胶质细胞（AS）分离培养方法,建立稳定,高产的培养模式,为进一步研究奠定基础.方法：结合自有实验室条件采用优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法获取AS,进行形态学观察,绘制生长曲线,对培养的细胞进行GFAP免疫荧光鉴定.结果：体外培养的原代AS 7～10 d基本融合,胞体不规则,突起丰富如网状,生长曲线符合正常细胞生长特性;免疫荧光染色显示细胞纯度可达95％以上.结论：优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法对AS的培养更适宜自有实验室条件,可获得稳定纯度较高的AS,为中枢神经系统疾病相关研究提供了新的基础.     

星形胶质细胞对氨引起培养胚鼠大脑神经元形态改变的影响

研究所氨对培养神经元形态的影响及星形胶质细胞与神经元形态改变的关系。应用胚鼠神经元纯培养、神经元与星形产质细胞的混合培养及联合培养技术，结合ＨＥ和免疫组化染色，观察神经元的形态改变。应用定量分析比较不同培养条件下神经元的存活率。     

膀胱移行细胞癌组织中COX-2及VEGF的表达与分析

目的探讨膀胱移行细胞癌(BTCC)组织COX-2表达的临床意义及与VEGF的关系。方法免疫组织化学SABC法检测57例BTCC组织及12例正常膀胱组织COX-2及VEGF蛋白表达,分析COX-2表达与肿瘤临床分期、病理分级及复发的关系。结果正常膀胱组织中未见COX-2表达,BTCC组织中COX-2的阳性表达率为63.16%。COX-2的阳性表达率与肿瘤的病理分级、临床分期以及复发相关。BTCC组织中COX-2与VEGF表达密切相关(r=0.607,P<0.001)。结论COX-2在膀胱癌组织中表达上调,COX-2可能在BTCC发展中起着重要的作用。     

AP-2α对人肺腺癌细胞COX-2表达的作用研究

目的探讨核转录因子激活蛋白2α（AP-2α）对A549细胞环氧合酶2（COX-2）表达的作用。方法将AP-2仅腺病毒载体转染入A549细胞，观察AP-2仅对A549细胞COX-2表达及白介素1β（IL-1β）诱导A549细胞COX-2表达的影响。将AP-2突变质粒载体转染入A549细胞，观察AP-2突变体对IL-1β诱导A549细胞COX-2表达的影响。用Western印迹检测COX-2蛋白的表达。结果AP-2仅增加A549细胞COX-2表达及IL一1β诱导的A549细胞COX-2表达。AP-2突变体降低IL-1β诱导的A549细胞COX-2表达。结论AP-2仅上调A549细胞COX-2的表达。     

Expression of Cyclooxygenase-2 in Ovarian Cancer Cell Lines

Summary： To investigate the expression of cyclooxygenase-2 （COX-2） in ovarian cancer cell lines, RT-PCR and immunocytochemistry were used to detect the expression of COX-2 in 5 ovarian cancer cell lines. The expression of COX-2 mRNA and protein was detected in all 5 cell lines. It is suggested that COX-2 is expressed in ovarian cancer cell lines, which provides a Basis for the chemoprevention of ovarian cancer.     

尼美舒利、阿司匹林对COX-2不同表达水平的食管鳞癌细胞株的抑制作用

目的比较选择性和非选择性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂对不同COX-2表达水平的食管鳞癌细胞的抑制作用。方法选取食管鳞癌细胞株EC109和TE-1,采用Western blotting法测定COX-2蛋白表达、MTT法检测细胞增生以及流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡(PI标记),观察阿司匹林及尼美舒利对2株细胞增生、凋亡的作用。结果 Westernblotting结果显示,EC109细胞表达COX-2,TE-1细胞不表达COX-2。选择性COX-2抑制剂———尼美舒利可抑制EC109细胞的增生,抑制率为(17.5±3.3)%~(80.1±3.9)%。尼美舒利仅在0.4 mmol/L时对TE-1细胞有抑制作用,抑制率为(16.2±7.0)%。尼美舒利可使EC109细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期,并诱导细胞凋亡,但对TE-1细胞无上述作用。非选择性COX-2抑制剂———阿司匹林在0~4 mmol/L浓度区间对EC109和TE-1均有抑制作用,并呈剂量依赖关系。阿司匹林作用后,EC109与TE-1的细胞周期均被阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率分别为(10.55±0.01)%及(8.52±6.65)%。结论食管鳞癌(esophagealsquamous cell carcinoma,ESCC)细胞株中COX-2的表达水平影响了选择性COX-2抑制剂的抑制作用,而对非选择性COX-2抑制剂影响较小。阿司匹林可能通过非COX-2依赖途径从而发挥对肿瘤的抑制作用。     

双氯芬酸抑制肝癌细胞增殖和促进环氧合酶-2 mRNA作用的表达

目的 观察环氧合酶抑制剂双氯芬酸钠对体外培养的肝癌细胞HepG2、Hep3B和正常肝细胞系QSG-7701增殖的作用以及药物对环氧合酶-2（COX-2）mRNA表达的影响,探讨COX-2与肝癌细胞增殖的关系。方法 采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞计数法测定药物作用24、48、72h后细胞增殖活性,半定量逆转录聚合酶链反应检测各种细胞系COX-2 mRNA的表达水平以及药物作用对基因表达的影响。结果双氯芬酸在10～200μmol/L浓度依赖性地抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖,50μmol／L作用48h后抑制率分别为40．47％和54．49％,半数抑制浓度分别为70．54和48．39μmol／L。双氯芬酸对正常肝细胞株QSG-7701的抑制作用较弱,作用48h的半数抑制浓度为189．91μmol／L。HepG2、Hep3B细胞均表达COX-2 mRNA,QSG-7701细胞几乎不表达COX-2 mRNA。双氯芬酸和化疗药5-氟尿嘧啶均可增强HepG2和Hep3B细胞COX-2 mRNA的表达。结论 双氯芬酸特异性地抑制表达COX-2的肝癌细胞HepG2和Hep3B的增殖,并且诱导COX-2 mRNA表达上调,提示COX-2在肝癌细胞增殖中具有重要意义。     

膀胱移行细胞癌COX-2的表达及其意义

目的 研究环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在膀胱移行细胞癌（transitional cell carcinonla，TCC）组织中的表达及其意义。方法 采用免疫组化技术，对49例膀胱TCC石蜡切片和18例正常膀胱黏膜组织进行COX-2蛋白检测。对阳性表达率与肿瘤分级及侵袭性间的相关性与TCC分级及侵袭性进行分析。结果 COX-2蛋白在膀胱TCC中表达率为63．2％，正常膀胱黏膜无表达（P〈0．01）。低分级TCC阳性率36．4‰高分级为92．8％（P〈0．05）。表浅TCC阳性表达率38．9％，浸润TCC为77．4％（P〈0．05）。结论 COX-2在高分级和侵袭性膀胱TCC中阳性表达率显著上升，可能会成为膀胱肿瘤患者恶性度和判断预后的重要生物学指标，并有可能成为治疗人类TCC的作用靶点。     

塞来昔布对肺癌细胞的增殖抑制、环氧化酶-2表达的影响和化疗敏感性

目的：探讨环氧化酶（COX）-2抑制剂塞来昔布（celecoxib）对肺癌A549细胞的增殖抑制、COX-2表达和化疗敏感性的影响。方法：用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTY法）检测塞来昔布单药及联合顺铂（DDP）对COX-2高表达的人肺腺癌细胞A549的增殖抑制，流式细胞术分析塞来昔布联合DDP对细胞周期及细胞凋亡的影响,Westernblot法分析不同浓度塞来昔布干预后对A549细胞内COX-2蛋白表达的影响。结果：MTT法检测显示，塞来昔布（0-100μmol／L）对肺腺癌A549细胞的抑制作用呈时间依赖性、剂量依赖性效应。联合用药组与单药组相比差异有显著性（P〈0．001）。流式细胞术分析显示，塞来昔布12．5μmol／L与25μmol／L联合DDP0．5ms／L时，A549细胞明显阻滞于c,o-Gl期，S期细胞比例减少，联合用药组的凋亡率明显高于单药组（P〈0．001）。Westem blot法分析显示，塞来昔布浓度超过50μmol／L时，COX-2蛋白的表达受到了抑制。结论：塞来昔布的抗肿瘤作用机制涉及到COX．2依赖性途径。塞来昔布能增加DDP的化疗敏感性，塞来昔布与DDP联用对人肺腺癌A549细胞有明显协同抗肿瘤效应，该作用可能是通过增强对A549细胞的增殖抑制、诱导凋亡来实现的。     

Expression of cyclooxygenase-2 mRNA in drug-sensitive cell and drugresistant strains of ovarian cancer cell lines

Objective： To investigate the expression of cyclooxygenase-2 （COX-2） mRNA in drug-sensitive cell and drugresistant clones of ovarian cancer cell lines. Methods： RT-PCR and immunocytochemistry were used to investigate the expression of cyclooxygenase-2 in 3 clones drug-sensitive and 5 clones drug-resistant ovarian cancer cell. Results： Strong COX-2 mRNA expressions were detected in 3 clones of drug-sensitive cell and weak expressions were detected in 5 clones of drug-resistant cell. The protein expression of COX-2 in drug-sensitive cell was strongly positive reaction in immunocytochemistry stain and there was a weak positive reaction in 5 clones of drug-resistant cell. Conclusion： The expression of COX-2 mRNA in drug-sensitive cell strains is much higher than that in drugresistant strains of ovarian cancer cell lines, providing a basis of the chemoprevention for ovarian cancer.     

家族性腺瘤性息肉病中COX-2的表达分析

目的:分析环氧化酶2(COX-2)在家族性腺瘤性息肉病(FAP)中的表达,探讨COX-2在腺瘤形成以及癌变过程中的可能作用.方法:收集我科2001年1月至2003年6月10例FAP患者手术切除标本,分别取≤0.5 cm、≥1 cm的腺瘤性息肉以及癌变腺瘤组织,采用EnVision免疫组化方法观察COX-2在这些病灶中的表达.结果:COX-2主要在上皮细胞内表达,在部分间质细胞中也表达.COX-2在≤0.5 cm腺瘤上皮细胞中的表达强于正常上皮,但相差并不显著;在≥1.0 cm腺瘤中表达显著强于正常上皮(P＜0.01);在不同大小腺瘤之间的表达差异显著,≥1.0 cm腺瘤中表达强于≤0.5 cm腺瘤(P＜0.01);癌变腺瘤中的COX-2表达显著高于正常上皮(P＜0.01);癌变腺瘤中表达强于≥1.0cm的腺瘤组织,但相差并不显著.结论:COX-2可能是FAP发展中的重要促进因子,参与了腺瘤早期形成以及癌变过程;选择性抑制COX-2是预防治疗FAP的有效靶点.     

Effects of aspirin on atherosclerosis and the cyclooxygenase-2 expression in atherosclerotic rabbits

Background Atherosclerosis is a complex vascular inflammatory disease. Aspirin is a mainstay in the prevention of vascular complications of atherosclerosis. In this study, the effectiveness of aspirin in suppressing atherosclerosis and the inflammation process was evaluated in rabbits fed with a high fat diet.Methods　Eighteen male New Zealand rabbits were randomly divided into 3 groups: control group, untreated cholesterol-fed group, aspirin treated cholesterol-fed group, which were fed for 12 weeks. After 12 weeks, the aorta was harvested for pathologic morphology observation. Immunohistochemical analysis of cyclooxygenase-2 (COX-2), macrophage and vascular smooth muscle cell (VSMC) was performed. The statistical analysis was performed by the statistical program SPSS10.0.Results　The aorta plaque/intima size (P/I) by pathologic morphology observation was 0%, (59.6±13.7)% and (36.3±16.5)% in the control, untreated cholesterol-fed group and aspirin treated group, respectively. The maximum plaque thickness, the degree of artery stenosis and the proportion of the intimal circumference occupied by atheroma of the 3 groups were significantly different from each other (P&lt;0.01). The expression of COX-2 and macrophage in plaque of the aspirin treated group were decreased compared with that in untreated cholesterol-fed group. However, no difference was found in the expression of VSMC between the aspirin treated and the untreated cholesterol-fed group. Conclusion The mechanism of atherosclerosis suppression by aspirin in cholesterol-fed rabbits is related to the inhibition of COX-2 expression together with the reduced inflammation followed by, but not related to the hypolipidemic effects.     

体外培养新生大鼠海马神经元突起的形态学

目的研究体外培养过程中，神经元的形态学。方法用扫描电镜观察体外培养的新生大鼠海马神经元在体外发育过程中，神经突起的形态学。结果培养海马神经元呈现梭形、三角形、锥体形等多种形态；神经突起随着培养时间延长，逐渐出现长度增加，突起分支增多；扫描电镜下，突起上显示串珠样膨大的膨体样结构，垂直分出呈鼓槌状的树突棘，突起来梢有矛头样和泪滴状生长锥，并见突起之间有连接存在。结论体外培养的海马神经元，在形态学上经历了与在体相似的变化，并且具有执行神经元功能的基本形态学基础。