猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

设计了一对特异性引物,对16头临床症状、病理变化和ELISA检测呈阳性的猪繁殖与呼吸障碍综合征疑似病例的肺脏、脾脏和淋巴结以及种公猪的精液进行了RT-PCR扩增。结果显示16头样品的相应组织及精液都扩增出特异性基因片段,阳性符合率为100%,8头猪繁殖与呼吸障碍综合征血清ELISA检测为阴性的对照样品中有2头扩增出阳性片段,检出率为25%。RT-PCR检测方法的建立为猪繁殖与呼吸障碍综合征的准确诊断提供了技术手段。     

猪圆环病毒2型与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断

2007年4月,龙岩市某存栏母猪达200头的规模化猪场,保育栏仔猪出现体温升高,呼吸困难,咳嗽,耳、鼻端、四肢及下腹部皮肤发紫,经临床剖检及病理观察大体判断为圆环病毒2型与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染,为进一步确诊,进行了实验室诊断.分别设计了PCv2及PRRSV的扩增引物,结果从病例中扩增出相应的产物.通过临床、病理诊断及实验室检测.确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒与圆环病毒2型混合感染.     

闽西地区猪繁殖与呼吸综合征的血清流行病学调查

从2005至2007年上半年.分别对闽西地区七个县市区和漳州、三明等地部分规模化猪场猪群采血,应用美国IDEXX公司生产的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)ELISA检测试剂盒,检测血清疫苗免疫抗体和PRRS野毒株感染抗体.调查结果显示:该地区母猪免疫抗体阳性率2005年为72.4%,2006年为69.3%,2007(1-6月)为68%;小猪PRRS免疫抗体阳性率为48.20%,生长猪免疫抗体阳性率为30.30%,差别较大,说明PRRS疫苗免疫猪群(母猪、仔猪和菜猪)效果不理想.非免疫猪群PRRS野毒株感染抗体2005母猪阳性率为44.3%,2006年为60%,2007(1-6月)为61.5%,生长猪为61.9%,对10个非免疫猪场母猪PRRS野毒株抗体检测,所有猪场均为阳性.调查结果表明:该地区无论是母猪还是生长猪,PRRS野毒株感染比较严重,应该引起足够的重视.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因原核表达产物的检测应用

利用猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达产物,分别建立了检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的间接ELISA方法及乳胶凝集试验．对200份血清样品分别应用建立的间接ELISA方法和乳胶凝集试验,及由IDEXX公司生产的EUSA检测试剂盒进行抗体检测,结果显示,乳胶凝集试验及间接ELISA方法与IDEXX公司试剂盒相比,检出符合率分别达78％和91％．建立的乳胶凝集试验还需改进,而N蛋白-ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,是一种有应用前景的检测方法．     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因疫苗的构建及在小鼠的免疫试验

从PRRSV野毒株细胞培养上清提取RNA，用RT-PCR的方法扩增出M蛋白基因片段（525bp），并将该基因克隆到pMD18-T载体，测序结果与PRRSV BJ-4等株同源性最接近．以pIRES-neo为载体，构建表达PRRSVM蛋白的基因疫苗，按100μg／只的DNA量免疫小鼠，二免后二周抗体水平显著高于同期免疫空载体pIRES～neo组，于免疫后14、28、42天后均能检测到较高的细胞免疫水平．这说明表达M蛋白的基因疫苗能够刺激机体产生免疫应答．     

猪繁殖与呼吸综合症的血清学调查

猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)是由PRRS病毒引起的一种传染病.文章报告了我市部分县市猪繁殖与呼吸综合症的血清学调查情况,发现阳性率为8.97%,为本地该病的防治提供了依据.     

沉默白细胞介素10基因对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染的影响

为了研究藏猪免疫细胞中IL-10基因表达抑制后对RNA病毒感染及其免疫应答的影响,本实验构建和筛选了抑制猪IL-10基因表达的shRNA干扰分子及其表达载体,并以新型的壳聚糖接枝聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰分子(CS-N-PEI-PEG)通过离子交联法进行分子包装,制备DNA-壳聚糖纳米分子,体外转染藏猪免疫细胞,观察猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)诱导免疫细胞IL-10基因的表达及其增殖感染水平.实验结果表明:与未转染纳米分子或者纳米分子不表达shRNA的空白对照组相比较,shRNA实验组的IL-10基因表达在24～72h内明显抑制(P<0.05),免疫细胞中PRRSV的增殖水平显著下降(P<0.05);同时IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ基因的mRNA水平明显升高(P<0.05).这些提示IL-10的shRNA转染能使免疫细胞的抗感染能力显著增强,甚至可完全抑制PRRSV的复制.     

国内外猪繁殖与呼吸综合症诊断、防制的研究现状

应用实验室检验诊断、预防接种免疫、可以有效的控制猪每繁殖与呼吸综合症疫情的发生和流行。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征RPA-LFD诊断方法的建立及初步应用

高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)给我国养猪业带来了巨大的损失.为快速、便捷诊断该病,建立重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术(RPA-LFD)的HP-PRRS诊断方法.针对HP-PRRSV Nsp2基因特异序列,设计生物素(Biotin)标记的特异性引物和FAM荧光素标记的探针,对RPA-LFD的反应体系和条件进行优化,结果显示,HP-PRRSV RPA-LFD最佳反应体系为：上下游引物(0.42 pmol/μL)各2.1μL,探针(0.3 pmol/μL)0.6μL,Rehydration buffer 29.5μL,cDNA模板1μL,ddH₂O 12.2μL,MgOAc 2.5μL,共50μL;最佳反应条件为：37℃,20 min.该方法同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒VR2332株(PRRSV VR2332)和NADC30-like株等10种常见感染猪的病原,结果显示,该方法除对HP-PRRSV检测呈阳性外,对PRRSV VR2332株、NADC30-like和其它9种感染猪的病原检测均为阴性,特异...     

一种马铃薯病毒RT-PCR诊断新方法

对传统的植物病毒RNA苯酚提取法进行改进;同时设计并优化单管RT-PCR(O ne-tube RT-PCR)方法,使传统的RT-PCR两步反应在一个反应体系中同时进行,依据马铃薯Y病毒和马铃薯S病毒的基因组RNA保守序列设计2套特异性引物,采用上述新建立的检测方法对染病的马铃薯叶片组织进行病毒检测,结果与G eneB ank中报道的这两种马铃薯病毒核苷酸序列进行B last比较,同源性达到96%以上,用这种新型诊断方法对马铃薯病毒核酸进行了浓度检测,实验结果证明,这种新型马铃薯病毒诊断方法具有可靠、快速、简便等特点.     

猴副流感病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为对易感动物以及相关生物材料和生物制品进行猴副流感病毒(SV5)的快速病原检测,根据SV5病毒SH基因序列,设计了1对引物,建立了检测SV5的RT-PCR方法,通过优化确定了RT-PCR体系的最佳工作条件。核酸序列分析显示,所扩增片段与GenBank数据库中报道的SV5病毒株WR-21005序列同源性达到97%,证明该方法特异。敏感性分析显示,该方法可检测的最小RNA浓度为2.1 ng/μL,能检出的最小病毒滴度为3.98CCID50/0.1 mL。初步将该方法运用于猴、地鼠、常用传代细胞和猴源生物制品的检测,在所检测的样品中均未检出猴副流感病毒核酸序列。结果表明,所建立的RT-PCR方法可用于猴副流感病毒(SV5)的诊断和分子流行病学调查。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

根据Barrett发表的犬瘟热病毒 (CDV)Onderstepoort弱毒株融合蛋白 (F)基因序列 ,设计合成了一对寡聚核苷酸引物 ,并以南京农业大学惠赠的Onderstepoort标准株反转录产物为模板 ,建立了CDV的RT PCR方法 ,并应用于CDV的诊断。结果表明 ,以该对引物 ,只能从CDV ONP标准株反转录产物中扩增出大小为 32 4bp的核苷酸片段 ,与理论设计值大小一致 ,而正常Vero细胞和同为副粘病毒科的新城疫病毒 (NDV)作为对照 ,病毒扩增结果为阴性。RT PCR可检出 1μl作 10 6倍稀释的CDV ONP标准株反转录产物 ,说明其具有很高的敏感性。应用试验结果 ,可从感染CDV犬的组织病料中提取RNA ,反转录产物中也扩增出 32 4bp的核苷酸片段。通过本研究不仅建立了敏感性、特异性好的CDV的RT PCR检测方法 ,也为F基因的克隆和序列测定及表达奠定了基础。     

用RT-PCR方法检测达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)白色脂肪组织中瘦素的基因表达

达乌尔黄鼠（Spermophilus dauricus）作为研究冬眠的优良模式动物,已经在医学、生理学以及生态学领域得到广泛的应用。但是目前尚未见使用分子生物学手段对达乌尔黄鼠（Spermophilus dauricus）进行冬眠机理方面的研究。瘦素在调节摄食、能量平衡和入眠方面都有非常重要的作用。尝试使用RT-PCR这一分子生物学技术对达乌尔黄鼠的瘦素和β-actin进行特异性扩增,并对其进行克隆测序,得到了达乌尔黄鼠的瘦素和β-actin基因片段的序列,为研究达乌尔黄鼠冬眠的分子机制提供基础数据。同时总结了用RT-PCR方法检测未知基因序列物种有关基因表达时需要注意的一些问题。     

西昌某牛场疑似牛支原体肺炎RT-PCR方法的诊断

应用RT-PCR方法对西昌市某牛场采集的2份疑似牛支原体肺炎鼻腔拭子进行检测,结果显示,两份样品均扩增出预期大小(300bp)的DNA片段。将其纯化回收、克隆、测序,结果表明,两份样品均与GenBank中牛支原体(Mycoplasma bovis)16SrRNA序列(GenBank登录号:AF332754)同源性为99%;牛支原体可能是导致牛发生肺炎的原因之一。     

半定量RT-PCR法在检测基因表达水平中的应用

半定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR法)是近年来常用的一种快速、简捷、特异的RNA检测方法,也是探讨基因转录水平的有效手段.该文就半定量RT-PCR法的检测步骤及技术的关键因素(总RNA提取、引物设计、循环数的确定和内参的选择等)进行综述.     

用微量单管RT-PCR快速检测及定型脊髓灰质炎病毒

介绍一种逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的简单快速检测和定型脊髓灰质病毒（ＰＶ）的方法，无需提取ＰＶＲＮＡ共用一种缓冲系统，将ＲＴ和ＰＣＲ试剂混合在２０μＬ反应体系中，整个操作可置于一不间断温度循环程度程序中完成，一步法ＲＴ－ＰＣＲ与常ＲＴ－ＰＣＲ及中和抗体试验对ＰＶ的检测结果完全一致，它的检测敏感度可达５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ，该法需要时间，费用和污染的都大大减少，而且特别适于临床常规诊断和鉴别     

利用RT-PCR法对木槿病叶初步检测

本试验利用不同方法对木槿病叶进行总RNA提取效果比较 ,同时用RT PCR方法 ,用广谱性植物病毒TMV、CMV、PXV和PVY的外被蛋白基因设计的引物对染病木槿的花叶病和皱缩病检测 .结果显示 :磁珠式固态样本总RNA快速分离纯化的方法提取的RNA比较完整 ,而Sangon(上海生工 )Trizol法提取总RNA和BioDev(博大泰克 )高效Trizol试剂提取总RNA相比较较差 ;不同模板浓度对PCR反应产物的影响较大 ;探讨了四种病毒对木槿的感染情况 ,分析得知 ,木槿的花叶病和皱缩病可能不是由于其中的病毒引起的 .本文虽然没有证明了木槿是由何种病毒引起的 ,但是对木本植物病毒的检测工作翻开了新的一页 ,并且对我国更多的木本植物的病毒检测将有更重要的意义 .     

ELISA 抗原检测与荧光 RT-PCR快速诊断猪瘟的比较研究

为找出临床上猪瘟快速、有效的诊断方法,对荣昌县2个猪场出现的40头临床症状疑似猪瘟的病猪进行病理剖检,结果证实有8头病猪出现猪瘟典型症状.采集40头病猪的血样,进行ELISA猪瘟抗原检测和荧光RTPCR猪瘟核酸检测,结果显示ELISA抗原检测检出7份血样为猪瘟抗原阳性,阳性检出率为87.5%;荧光RTPCR核酸检测出4份血样为阳性,阳性检出率为50%.该结果证实,ELISA猪瘟抗原检测的阳性检出率比荧光RT-PCR核酸检测更高,建议临床上采用ELISA抗原检测的方法进行猪瘟的快速诊断.     

用RT-PCR方法检测血液及尿液中肾综合征出血热病毒

目的应用逆转录聚合酶链反应方法(RT-PCR)对临床诊断或拟诊为肾综合征出血热(HFRS)的患者的血液及尿液标本进行检测.方法对临床拟诊断或拟诊HFRS患者198名(Ⅰ型为147例,Ⅱ型为51例)的血清、尿液标本进行RT-PCR方法抗体检测,并设置对照血清.结果紫外灯下,165例在237 bp处出现橙黄色带,阳性率为83.3%,对尿液进行检测,其结果均为阳性.标准病毒株、阳性对照血清为阳性.阴性对照、健康人血清、尿液标本均为阴性;免疫荧光抗体检测,血清抗体阳性173例,阳性率为87.2%.尿液阳性仅为116例,阳性率为58.4%.结论用RT-PCR方法检测HFRSV具有灵敏度高、特异性好、快速等优点,方法简便,适于临床应用.