经纤维支气管镜刷检人支气管上皮细胞的原代培养

目的:建立经纤维支气管镜(纤支镜)刷检人支气管上皮细胞的原代培养方法.方法:采用无血清支气管上皮细胞培养液,对经纤支镜刷检获得的人支气管上皮细胞进行原代培养并传代,并通过倒置相差显微镜、细胞角蛋白免疫组化染色观察原代培养细胞的特性.结果:刷检获得的细胞成活率在70%以上,7 d后细胞开始增殖,21 d时汇合率可达90%.细胞扁平、多角形,呈铺路石样分布.细胞角蛋白表达阳性.结论:本实验建立了经纤支镜直视下刷检原代培养支气管上皮细胞的方法,无血清培养液可提供较为满意的生长条件,为进一步研究不同疾病中气道黏膜的功能提供了良好的模型.     

牙龈上皮细胞与脱细胞真皮构建组织工程牙龈的初步研究

目的:体外培养人牙龈上皮细胞,并与脱细胞真皮构建组织工程牙龈.方法:将体外培养的人牙龈上皮细胞接种于无细胞真皮支架上,液面下培养7 d后,分别进行气-液界面培养7,14和21d,并在光镜下进行组织形态学观察.结果:牙龈上皮细胞在体外具备良好的生长增殖能力,且在无细胞真皮支架上形成了复层上皮样组织结构,表层上皮细胞出现部分角化.结论:利用体外培养的牙龈上皮细胞和脱细胞真皮,可以在体外联合构建具有复层上皮细胞结构的组织工程牙龈.     

人支气管上皮细胞体外不同培养基培养效果比较

目的：比较胎牛血清培养基，小牛血清培养基对经纤维支气管镜（纤支镜）刷检人支气管上皮细胞培养存活率的差异。方法：采用不同细胞培养液，对经纤支镜刷检获得的人支气管上皮细胞进行原代培养，并通过倒置相差显微镜观察原代培养细胞，比较细胞的存活率。结果：胎牛血清培养基细胞成活率比其他培养基高。结论：胎牛血清培养液可提供较为满意的生长条件。     

人食管上皮细胞培养、冻存及复苏方法的实验研究

目的比较K-SFM无血清培养基及DMEM有血清培养基在人食管上皮细胞培养中的作用,并比较不同冻存方法对人食管上皮细胞复苏后存活率的影响,探讨适合应用于组织工程食管研究的人食管上皮细胞培养、冻存及复苏方法。方法人食管上皮细胞来源于食管癌患者手术切除的食管。采用组织块法和消化法培养,两种方法均分别加入K-SFM无血清培养基及DMEM有血清培养基。采用直接观察、锥虫蓝染色活力鉴定及细胞计数法绘制细胞生长曲线,对比细胞在不同培养基中的生长情况。分别以两种培养基配制的冻存液进行冻存,复苏后的细胞采用锥虫蓝染色法鉴定其存活率。结果细胞呈典型“铺路石”状排列,免疫组织化学检测细胞角蛋白呈阳性结果,证明培养的细胞为人食管上皮细胞。人食管上皮细胞在K-SFM无血清培养基中生长快,细胞形态好,不易被成纤维细胞污染。以K-SFM培养液配制的冻存液冻存的细胞复苏后的存活率明显高于以DMEM配制的培养液。结论应用K-SFM无血清培养基培养和冻存人食管上皮细胞的方法简便、培养效果好,适合推广应用。     

人羊膜上皮细胞的原代及传代培养

目的 建立体外培养人羊膜上皮细胞的方法,观察体外培养的羊膜上皮细胞的生物学特性.方法 取足月剖宫产术后羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获取的羊膜上皮细胞接种于含10%胎牛血清培养基中进行原代和传代培养,探索其合适的培养条件,用倒置显微镜观察培养的人羊膜上皮细胞体外生长的特征.用苏木精-伊红染色、扫描电镜和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定.结果 人羊膜上皮细胞可以在体外成功的培养传代,体外可连续传8～10代.体外培养细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观.扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛.细胞角蛋白keratin单克隆抗体染色阳性.结论 人羊膜上皮细胞在体外可成功进行原代和传代培养,体外培养的人羊膜上皮细胞在一定时间内可维持增殖能力.     

人扁桃体隐窝上皮细胞的分离、原代培养与鉴定

目的：建立高效、稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代培养方法。方法：收集80例3~5岁儿童手术切除的扁桃体组织,分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法提取扁桃体隐窝上皮细胞并比较两种方法的提取效果;应用无血清角化细胞培养基进行细胞纯化及原代培养;用相差显微镜观察细胞形态和生长特点、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞来源。结果：Ⅱ型中性蛋白酶联合消化法在分离扁桃体隐窝上皮细胞成功率、细胞密度以及细胞融合时间方面均高于组织块贴壁法（P < 0.05）,细胞接种后第2天开始贴壁,外观呈现多边形,岛状生长,培养12 d左右,细胞连成单层,呈现铺路石样生长。免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性,波形蛋白阴性;免疫荧光鉴定角蛋白8/18染色阳性。结论：应用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法以及无血清角化细胞培养基可建立高效稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代分离方法和体外培养体系。     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

哈萨克族食管正常上皮细胞的原代培养方法

目的：培养哈萨克族（哈族）成人食管正常上皮细胞,建立能够在体外长期培养的哈族食管上皮细胞系,为上皮细胞的体外研究提供实验材料。方法取哈萨克族食管癌患者正常食管上皮,用0．25％中性蛋白酶（DispaseⅡ）和0．05％胰蛋白酶/0．03％ EDTA 联合消化获取哈族食管上皮细胞,使用 EpiCM-2无血清培养基培养,通过细胞形态学和角蛋白免疫组织化学法鉴定培养的食管正常上皮细胞的来源。结果首次培养的原代哈萨克族正常食管上皮细胞经8～10 d 后可融合成片,融合率为80％～90％,细胞呈“铺路石”样生长,细胞角蛋白表达阳性,可连续传代,传代的细胞经3～5 d 可达到80％～90％融合。结论建立的体外分离培养哈族成人食管正常上皮细胞的方法方便可行。     

人表皮细胞在三种无血清培养基中的生长与增殖

对人原代表皮细胞在无血清培养基 A、B和 C中的生长过程进行动态观察 ,并于培养第 5 d用 MTT法和3H- Td R掺入法分别测定其生长和代谢情况。结果表明 :人原代表皮细胞在无血清培养基 A中生长 (OD值 :0 .6 38± 0 .0 33)和代谢 (COM:92 8± 46 .6 9)优于无血清培养基 B(OD值 :0 .5± 0 .0 37,CPM:740 .11± 43.2 9) ,差异有极显著意义 (MTT法 :P<0 .0 1,3H - Td R掺入法 :P<0 .0 1)。在无血清培养基 B中人原代表皮细胞在培养第 12 d仍未汇合联接成片 ;而在无血清培养基 C中细胞的生长增殖与无血清培养基 A相似 (P>0 .0 5 ) ,细胞在这二种培养基中于培养第 12 d均可汇合联接成片。     

人羊膜上皮细胞的分离、纯化及其生物学特性研究

目的 体外分离人羊膜上皮细胞并纯化,对体外培养的人羊膜上皮细胞的生物学特性进行相关研究.方法 取足月剖宫产的人羊膜组织,经胰蛋白酶、胶原酶和Dnase酶消化后,采用差异黏附法获得纯度高的羊膜上皮细胞,接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用HE染色法对培养细胞进行形态学观察,并采用免疫组化法检测细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在体外培养的人羊膜上皮细胞中的表达.结果 经不同的消化酶消化和差异黏附法筛选后能获得纯度较高的人羊膜上皮细胞,在体外培养条件下人羊膜上皮细胞呈上皮细胞特有的铺路石样外观,并能连续传代8～10次,细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在其胞浆中呈阳性表达.结论 人羊膜上皮细胞能在体外成功分离、纯化、培养并增殖,为人羊膜上皮细胞的进一步研究及其在细胞移植和组织工程中的应用奠定了实验基础.     

无血清培养基分离培养脐带间充质干细胞的研究

目的探讨应用无血清培养体系分离培养脐带间充质干细胞,明确其成骨生物学特性,为临床应用奠定实验基础。方法在无血清干细胞培养体系下,利用组织块贴壁培养法分离培养,扩增脐带间充质干细胞,在倒置显微镜进行形态学观察,流式细胞检测鉴定其表面标记CD34、CD44、CD90及CD45的表达,成骨诱导液培养2～3周后观察其细胞形态学变化,茜素红染色鉴定其成骨情况。结果脐带组织块接种后第1次更换培养液12h后,有少量梭形的细胞从脐带组织边缘爬出,培养5～6d左右成单层状生长,12d左右梭形状细胞呈现复层生长趋势,细胞表面标记CD44、CD90均呈阳性为间充干细胞来源,CD34、CD45均呈阴性为非造血干细胞来源;细胞经成骨诱导2～3周后具有良好的分化成骨能力。结论利用无血清的人间充质干细胞专用培养基培养体系,脐带组织培养法能够分离培养出大量的脐带间充质干细胞,避免了培养中异种蛋白的混入而降低临床排异反应。     

血清含量对HaCaT细胞生长特性及迁移能力的影响

[目的] 考察不同血清含量以及培养不同时间对人永生化角质形成细胞(HaCaT)细胞的生长及迁移特性的影响,为HaCaT细胞划痕实验条件优化提供实验数据支撑。[方法] 培养HaCaT细胞,按10%血清浓度全培基(全培基阳性对照组)、2%低浓度血清培基(低血清培基组)及无血清培基(对照组)分组,通过进行细胞划痕实验,CCK-8细胞活力检测、Brdu细胞增殖实验,分析HaCaT生长特性。[结果] 在24 h内,低血清培基组HaCaT细胞与全培基组相比,细胞增殖能力无明显差异,细胞活力有增高的趋势。细胞孵育48 h后,全培基组细胞增殖能力及活力明显升高。24~48 h,全培基组细胞增殖能力及细胞活力的提升速度明显高于低血清培基组。[结论] 培养基中血清含量对HaCaT细胞生长特性及迁移能力具有重要影响,培养24 h内低血清培养条件有利于划痕实验的观察与测定。     

人牙龈结合上皮细胞和口腔龈上皮细胞生物学特性的比较

目的：从人口腔龈上皮细胞中分选出P-钙黏蛋白（P-cadherin）阳性表达和阴性表达的细胞,并将之与人牙龈结合上皮细胞的黏附、增殖和迁移的生物学特性进行比较。方法：分离培养人口腔龈上皮细胞,通过磁珠从中分选出P-钙黏蛋白阳性表达和阴性表达的细胞;分离培养人牙龈结合上皮细胞;测定人牙龈结合上皮细胞、口腔龈上皮细胞及从中分选出的P-钙黏蛋白阳性表达和阴性表达细胞的黏附、增殖和迁移能力。结果：P-钙黏蛋白阳性表达细胞占全部口腔龈上皮细胞的20%。P-钙黏蛋白阳性表达的口腔龈上皮细胞和人牙龈结合上皮细胞表现出较强而相似的黏附和迁移能力,但前者增殖较旺盛（0.72±0.06）, 后者增殖较慢（0.60±0.05,P<0.05）; 而P-钙黏蛋白阴性表达的口腔龈上皮细胞与牙龈结合上皮相比,表现出的黏附（48%±6% vs. 87%±11%,P<0.05）、增殖（0.36±0.04 vs. 0.60±0.05,P<0.05）和迁移能力［（10.3±2.7）个 vs. （23.4±4.8）个,P<0.05］均较弱。结论：P-钙黏蛋白阳性表达的口腔龈上皮细胞与牙龈结合上皮细胞在生物学特性方面有一定相似性而又有区别,提示口腔龈上皮细胞转化为牙龈结合上皮细胞的过程中,可能不仅仅是部分细胞的简单迁移,其中可能牵扯到更为复杂的基因、蛋白表达方面的改变。     

成年牛晶状体上皮细胞培养及超微结构的观察

目的 建立成年牛眼昌状体上皮细胞的培养方法,研究其在不同培养液中的生长特性并观察其超微结构。方法 组织块静置贴壁培养,应用细胞计数法和噻唑蓝（MTT）法检测细胞的生长情况,透射电镜观察所培养细胞的超微结构。结果 晶状体上皮细胞在高糖和低糖的DMEM培养液中的原代及传代培养生长均良好,在低糖DMEM中能更快速贴壁,电镜观察可见细胞内微丝丰富,高铛达,溶酶体多少不等,粗面内质风丰富和线粒体少,结论 组织场合胸置培养是合适的晶状体上皮细胞体外培养方法,细胞生长状况与培养液中含糖量关系不大,其较强的贴壁能力可能与所含丰富的微丝有关。     

碱性成纤维细胞生长因子和地塞米松联合诱导骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和地塞米松联合对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法:以第三代BMSCs为实验材料,分别给予10%FBS的DMEM培养基,含80μg/LbFGF的10%FBS的DMEM培养基,含bFGF80μg/L+地塞米松10-8mol/L+β-甘油磷酸钠10mmol/L+维生素C50mg/L的10%FBS的DMEM培养基处理,通过计数BMSCs细胞数评价其增殖能力,同时行碱性磷酸酶(ALP)活性检测及茜红素染色评价其成骨分化的能力。结果:与对照组相比较,bFGF可以显著提高骨髓间充质干细胞的增殖能力,bF-GF和地塞米松联合不仅促进了骨髓间质干细胞的增殖,而且促进碱性磷酸酶的表达和钙结节的形成。结论:bFGF和地塞米松联合促进了骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。     

外源性神经节苷脂对神经干细胞增殖、分化作用的初步研究

目的 探讨外源性神经节苷脂(GM1)对从胎鼠大脑分离培养的神经干细胞(NSCs)增殖及分化的作用.方法 ①利用无血清培养技术从胎鼠大脑皮层和海马分离培养原代细胞,加血清诱导其分化.②在NSCs培养基和DMEM/F12培养基中加入不同浓度的GM1,观察GM1对NSCs增殖和分化的影响.结果 ①与不含GM1的NSCs培养基相比,在NSCs培养基中加入低浓度的GM1,NSCs的生长无明显改变,随着GM1浓度的增加,NSCs克隆球体积逐渐减小,细胞逐渐死亡;②在DMEM/F12培养基中单独加GM1而不加血清,NSCs克隆球均未见继续生长,也未见分化,而是迅速的死亡.结论 在NSCs培养基中,低浓度(12.5 μg/mL)GM1对NSCs的增殖无明显影响,但较高浓度的GM1对NSCs的增殖有抑制作用;在无血清的DMEM/F12培养基中,GM1不能诱导NSCs分化.     

人Tenon’s囊成纤维细胞的离体培养及生长特性观察

目的离体培养人Tenon’s囊成纤维细胞,观察其生长特性。方法将人Tenon’s囊成纤维细胞进行离体培养及生长抑制实验,采用含10％胎牛血清的DMEM培养基,细胞计数法及MTT法描述细胞生长曲线。并通过免疫组织化学法对细胞进行鉴定。站果人Tenon’s囊成纤维细胞离体培养48h至7d处于对数生长期。细胞角蛋白染色阴性,波蛋白染色阳性。结论人Tenon’s囊成纤维细胞在体外易于生长,是细胞离体实验研究的良好材料。     

富血小板血浆对人牙龈成纤维细胞增殖和迁移的影响

目的:体外研究不同浓度的机采富血小板血浆(PRP)对人牙龈成纤维细胞(HGFs)的增殖和迁移的影响?方法:不同浓度PRP(1%?5%?10%?20%?30%?50%),加入到原代培养的人牙龈成纤维细胞,无血清培养液为阴性对照,10%新生小牛血清为阳性对照,培养时间为3?5?7天,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞增殖效果,Transwell系统测定细胞迁移效果?结果:PRP有明显促进增殖作用,不同浓度PRP与阴性对照组均有明显差异(P < 0.01),且随着时间递增,增殖效果也明显增强(P < 0.01)?在细胞迁移效果中,各浓度组均比阴性对照组效果好?结论:PRP对HGFs功能有明显促进效果,在一定浓度范围有浓度依赖性?     

不同浓度胎牛血清对原代心肌成纤维细胞增殖及分化的影响

目的: 探讨不同浓度胎牛血清体外培养对原代心肌成纤维细胞增殖和分化的影响。方法: 用酶消及差速贴壁法分离并培养SD乳鼠心肌成纤维细胞;采用不同浓度胎牛血清（1%、5%、10%和20%）培养心肌成纤维细胞并观察细胞形态,免疫荧光共聚焦法检测α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）蛋白表达,划痕实验检测心肌成纤维细胞的迁移能力,CCK8实验检测心肌成纤维细胞的增殖能力。结果: 随着胎牛血清浓度升高,细胞形态逐渐变圆,细胞表面积增加,α-SMA阳性细胞比例增加,心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化增多,细胞迁移能力增加。高浓度胎牛血清（20%）培养时心肌成纤维细胞增殖能力最旺盛,低浓度胎牛血清（1%）培养时心肌成纤维细胞增殖能力最低,5%和10%胎牛血清培养时心肌成纤维细胞增殖均旺盛。结论: 高浓度胎牛血清培养会导致心肌成纤维细胞分化,5%胎牛血清培养心肌成纤维细胞较10%和20%胎牛血清培养分化程度少,增殖能力较1%胎牛血清好,选用5%胎牛血清培养心肌成纤维细胞较好。