多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶1基因分析及PCR检测方法

目的 扩增多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶亚基1(NADH dehydrogenase subunit1,ND1)基因全序列,测序并进行同源性比较.建立检测多房棘球蚴感染的PCR方法,应用于人和动物感染多房棘球蚴的快速检测和鉴定.方法 根据多房棘球绦虫线粒体DNA全序列,设计引物扩增ND1基因并进行测序,获得多房棘球蚴ND1基因全序列.对该序列与其它常见棘球绦虫的ND1基因序列进行同源性分析.结果 多房棘球蚴线粒体ND1基因序列与国外报告的多房棘球绦虫的同源性达到98.8％,与细粒棘球绦虫的同源性为86.2％,与少节棘球绦虫的同源性为84.6％,与伏氏棘球绦虫的同源性为87.0％.结论 多房棘球蚴线粒体ND1基因与其他棘球绦虫相应基因存在显著差异.PCR方法可以用于多房棘球蚴感染的快速检测和鉴定.     

青海省称多县藏狐和犬棘球绦虫感染分离株的虫种鉴定北大核心CSCD

目的对青海省玉树州称多县藏狐和犬体内的棘球绦虫(Echinococcus)进行虫种鉴定。方法搜集称多县意外死亡的藏狐(Vulpes ferrilata)6只、驱虫犬5只和未驱虫无主犬1只,剖检小肠,肉眼观察小肠内棘球绦虫感染情况,沉淀法搜集棘球绦虫成虫,虫体经硼砂洋红染色后于镜下观察,初步鉴定虫种后,计算感染度。选取8条多房棘球绦虫和2条石渠棘球绦虫,提取基因组DNA,PCR扩增线粒体DNA(mt-DNA)的细胞色素氧化酶第1亚基(COⅠ)基因,测序并进行序列分析。结果镜下观察,共发现2种棘球绦虫,分别为多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫。6只藏狐中,2只感染多房棘球绦虫,感染度分别为1 640条和839条,1只感染石渠棘球绦虫,感染度为833条。6只藏区犬中,2只感染多房棘球绦虫,感染度分别为10 195条和78条。PCR结果显示,8条多房棘球绦虫和2条石渠棘球绦虫的扩增产物约为450 bp。8条多房棘球绦虫的COⅠ基因序列一致,与四川省藏狐体内发现的多房棘球绦虫COⅠ基因(登录号为AB461417)序列一致性为100%。2条石渠棘球绦虫的COⅠ基因(登录号为JQ317998)序列一致,与四川省石渠县高原鼠兔(Ochotona curzoniae)体内发现的石渠棘球绦虫幼虫COⅠ基因(登录号为AB159136)序列一致性为99.2%。结论青海省玉树州称多县藏狐和犬有多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫感染。     

犬体内细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的混合感染

目的 证实家犬体内是否存在细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫混合感染。方法 从新疆和静县巴音布鲁克草原现场收购的30条牧羊犬,经麻醉后处死解剖,在1只雌性牧羊犬小肠内发现棘球绦虫成虫1万条以上,经显微镜观察,疑为细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫混合感染。用Eg1f/r和EM-15/17EM引物分别对两种棘球绦虫的线粒体DNA特异目的片段进行序列分析鉴定。结果 形态学观察:细粒棘球绦虫孕节长大,生殖孔偏后,位于节片一侧中部。子宫有不规则的分支和侧突(侧囊),内含虫卵200~800个。多房棘球绦虫较短小,4~5体节。孕节中子宫呈简单的囊状,无侧囊。生殖孔开口于侧缘的前半部。线粒体12S RNA序列鉴定,扩增样本DNA经同源序列比较发现,与细粒棘球绦虫G1型具有相同的序列;扩增样本与多房棘球绦虫具有相同的序列。分别确定为细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫两种虫种。结论 首次证实家犬体内存在细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的混合感染。     

青海省多房棘球绦虫分子种系发生研究

目的　对青海省多房棘球绦虫分离株Cox1、Nad1基因进行扩增和测序,并构建系统进化树及分子钟,为推测其进化关系及起源提供参考依据。方法　收集2017年青海省人民医院收治的22份肝多房棘球蚴病患者术后标本,对多房棘球蚴线粒体DNA Cox1、Nad1基因进行PCR扩增和测序,并与GenBank数据库中的棘球属绦虫Cox1基因和Nad1基因序列进行比对,观察种内变异情况并构建进化树和分子钟。结果　所有多房棘球绦虫标本与GenBank数据库中检索的多房棘球绦虫亚洲株Cox1、Nad1基因序列同源性均达99%以上,共获得6种不同基因型,其中有2个分离株在GenBank数据库中未找到同源性100%的基因序列。系统进化树显示,收集的多房棘球绦虫标本与多房棘球绦虫亚洲株聚类效果明显;分子钟推测青海地区多房棘球绦虫起源于9.4万年前。结论　本研究发现青海省多房棘球绦虫存在6种不同基因型,其中首次发现2种基因型。青海地区多房棘球绦虫优势株为亚洲株,起源时间约在9.4万年前。     

青海省多房棘球绦虫分子种系发生研究

目的　对青海省多房棘球绦虫分离株Cox1、Nad1基因进行扩增和测序，并构建系统进化树及分子钟，为推测其进化关系及起源提供参考依据。方法　收集2017年青海省人民医院收治的22份肝多房棘球蚴病患者术后标本，对多房棘球蚴线粒体DNA Cox1、Nad1基因进行PCR扩增和测序，并与GenBank数据库中的棘球属绦虫Cox1基因和Nad1基因序列进行比对，观察种内变异情况并构建进化树和分子钟。结果　所有多房棘球绦虫标本与GenBank数据库中检索的多房棘球绦虫亚洲株Cox1、Nad1基因序列同源性均达99%以上，共获得6种不同基因型，其中有2个分离株在GenBank数据库中未找到同源性100%的基因序列。系统进化树显示，收集的多房棘球绦虫标本与多房棘球绦虫亚洲株聚类效果明显；分子钟推测青海地区多房棘球绦虫起源于9.4万年前。结论　本研究发现青海省多房棘球绦虫存在6种不同基因型，其中首次发现2种基因型。青海地区多房棘球绦虫优势株为亚洲株，起源时间约在9.4万年前。     

中国西北部地区多房棘球绦虫cox1基因多态性研究

目的分析四川省西部多房棘球绦虫遗传多态性,对我国西北部地区多房棘球绦虫不同地理亚群的亲缘关系和基因多样性进行探索。方法采用线粒体cox1基因完整序列对四川省西部藏区64份来源于不同生物宿主的多房棘球绦虫样本进行遗传多态性分析,同时收集GenBank数据库中来源于中国不同地区的多房棘球绦虫的cox1基因序列,比对分析不同地理来源分离株的遗传多态性特征。结果 (1)64份样本共检出5个单倍型,均属于多房棘球绦虫亚洲亚群。单倍型多样性与低核苷酸多样性分别为0.179±0.064和0.00013±0.00005。(2)搜索GenBank数据库,结合本研究中序列信息,共获得181条来源于四川、青海、新疆和内蒙古的多房棘球绦虫cox1基因序列,获得45个单倍型。单倍型网络图呈现星状排列,中央单倍型为四川、青海和新疆三地共有,其余单倍型为各地独有。构建的ML系统发育树分支与单倍型地理分布相对应,形成较为明显的地理结构。结论四川省西部地区多房棘球绦虫遗传多样性较低,寄生于不同宿主的多房棘球绦虫间无明显遗传差异。我国不同地区多房棘球绦虫遗传变异特征的分析确证需要进一步的数据支撑。     

鼠伤寒沙门氏菌疫苗株产生的重组多房棘球绦虫抗原诱导小鼠和犬的体液和细胞免疫应答

作者用DNA重组技术将多房棘球绦虫特异性抗原的基因片段转入减毒活鼠伤寒沙门氏菌疫苗LT2MIC株中复制表达,以研制能诱发中间宿主和终宿主保护性免疫应答的多价疫苗。将携带多房棘球绦虫基因片段(产生种特异性抗原Ⅱ/3—10)的重组pVM II/3-10质粒,转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗LT2MIC株虫,作为重组疫苗;将不含插入基因的pUR278质粒转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗LT2MIC     

多房棘球绦虫:泡球蚴在不同株小鼠体内发育的差别

泡状棘球蚴(泡球蚴)病是由多房棘球绦虫的幼虫所引起的一种致命性动物源性疾病,常误诊为肝癌。为了建立实验室动物模型,曾研究过多种啮齿类动物。已根据感染率、虫负荷和免疫应答评估了宿主易感性,但对虫体发育的质的差异少有研究。本文作者比较了多房棘球绦虫在9株近交系小鼠体内发育的情况,并且选用H-2同基因异系小     

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫的核酸检测方法,并进行检测效果评价。方法以多房棘球绦虫线粒体基因序列(GenBank登录号:AB018440)作为靶序列,根据RAA反应原理设计并合成引物,利用该引物进行RAA扩增。以聚合酶链反应(PCR)作为平行对照,应用RAA方法扩增不同稀释浓度的多房棘球绦虫基因组DNA及梯度稀释的含不同拷贝数目的基因片段的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测的敏感性。应用此方法检测细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价其特异性。在对建立的方法进行条件优化后,检测9份感染多房棘球蚴的动物组织样本、3份模拟现场多房棘球蚴感染阳性犬粪样本以及2份现场阳性犬粪样本,以验证所建立的RAA方法的可靠性和实用性。结果所建立的RAA法可在40 min内特异性扩增多房棘球绦虫目的基因片段。以多房棘球绦虫基因组DNA为模板,RAA法最低检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10^4个。以细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板,应用所建立的RAA法扩增结果均为阴性。应用本研究建立的RAA法检测感染多房棘球蚴的动物组织样本以及模拟和现场阳性犬粪便样本结果均为阳性,且与PCR法检测结果一致。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA检测方法,其在多房棘球绦虫虫种鉴定以及棘球蚴病基因诊断方面展现出较好应用前景。     

两种致病人体棘球绦虫动物宿主感染及影响因素研究进展

棘球蚴病是由棘球绦虫幼虫感染所致的一种危害严重的人兽共患寄生虫病。棘球绦虫生活史可涉及多种动物宿主,如有蹄类动物、啮齿类动物等中间宿主和食肉类动物终末宿主。自然界动物宿主间细粒棘球绦虫及多房棘球绦虫生活史循环与人体棘球蚴病传播密切相关。本文综述了近年来国内外有关细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫主要动物宿主分布及感染的影响因素研究进展,旨在为开展棘球蚴病精准防治提供参考。     

Short report: Identification of Echinococcus species from a yak in the Qinghai-Tibet plateau region of China

The species identification of an echinococcal lesion in the liver of a yak in the Qinghai-Tibet plateau region of China, where both Echinococcus granulosus and E. multilocularis are present, was difficult to determine because of the atypical appearance of the lesion. Polymerase chain reaction-based mitochondrial genotyping allowed us to discriminate the Echinococcus species. Nucleotide sequences of the cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1) and cytochrome b (cytb) genes amplified from the echinococcal lesion demonstrated that the yak was infected with the E. granulosus G1 genotype (sheep strain).     

5对引物检测犬棘球蚴病感染方法评价

目的评估5对引物检测犬棘球蚴病感染的PCR方法并建立可将多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫羊株(G1型)和骆驼株(G6型)区分的方法。方法选用引物BG1/3、Bretange:1/2、Eglf/lr、EM-H15/H17和Cabrera:1/2,扩增稀释的细粒棘球绦虫虫卵DNA,进行敏感度测定。对水泡带绦虫、多头绦虫、羊绦虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫G1型和G6型进行PCR扩增,测定引物的特异度。结果5对引物在体外均能检测出1个虫卵的稀释度。Cabrera:1/2引物能在6种寄生虫样本中扩增出相同片段大小的条带;Bretange:1/2引物可以扩增出多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫G1型和G6型;BG1/3引物可以在多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫G1型中扩增出1条带,在细粒棘球绦虫G6型中扩增出2条带;Eglf/lr可以在细粒棘球绦虫G1型和G6型中扩增出相同片段大小的条带;EM-H15/H17可以在多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫G6型中扩增出相同的条带。结论5对引物中BG1/3具有较强的特异性,其余4对引物特异性不强;利用BG1/3和Eglf/lr、EM-H15/H17组合可以方便区分细粒棘球绦虫G1型、G6型和多房棘球绦虫。     

巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用

目的 探索巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用价值.方法 将水泡带绦虫、犬弓首蛔虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫羊株和骆驼株等样本的DNA用巢式PCR扩增.结果 巢式PCR可以扩增出多房棘球绦虫和水泡带绦虫,而对细粒棘球绦虫羊株和骆驼株及其他寄生虫均不能扩增出.结论 在鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫方面,巢式PCR有一定的诊断意义,但不能用于鉴别细粒棘球绦虫基因亚型.     

新疆北部多房棘球绦虫动物宿主研究初报

本文报告在新疆北部泡型包虫病流行地区的农村牧区以及山地和草原地带进行多房棘球绦虫终宿主和中间宿主调查的结果。采用槟榔碱导泻法检查 30 5只家 (牧 )犬 ,在 5 2只犬中检出棘球绦虫成虫 ,感染率为 17%。对所获 13974条虫体进行鉴定的结果 ,皆为细粒棘球绦虫。表明在新疆北部泡型包虫病流行地区 ,家犬不是多房棘球绦虫的终宿主。检查啮齿目动物 31种 5 16 3只 ,食虫目动物 4种 2 6 1只和兔形目动物 2种 196只。在西部天山地区捕获的伊犁田鼠和塔尔巴哈台山地区捕获的水鼠平中发现多房棘球蚴感染 ,表明这两种鼠类是当地多房棘球绦虫的中间宿主。属于国内新记录。     

Molecular confirmation of human alveolar echinococcosis in Poland

Infections of humans with Echinococcus multilocularis, the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), a zoonosis, have been described with increasing frequency in Poland since 1994. In the attempt to verify these reports, we analyzed specimens obtained from a representative group of Polish patients. Liver lesions in patients with AE that was diagnosed on the basis of results of histological and serological tests contained E. multilocularis DNA, as shown by the presence of specific microsatellite sequences and mitochondrial 12S rDNA. The same tests clearly distinguished between AE and cystic echinococcosis, which is caused by Echinococcus granulosus. These data are unequivocal proof that human infections with E. multilocularis occur in Poland.     

Dual infection of animal hosts with different Echinococcus species in the eastern Qinghai-Tibet plateau region of China

The eastern Qinghai-Tibet plateau of China is a highly endemic region of echinococcosis where Echinococcus granulosus sensu stricto (sheep strain), Echinococcus multilocularis, and Echinococcus shiquicus are distributed sympatrically. We developed a polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method for the identification of the three species in this region. The PCR-RFLP showed the dual infection of animals with different Echinococcus spp. The first case was a domestic dog concurrently infected with adults of E. granulosus and E. multilocularis. The second case was a plateau pika (Ochotona curzoniae) harboring metacestodes of E. multilocularis and E. shiquicus in the liver. The high susceptibility of some mammalian hosts to the parasites and the high prevalence of the three co-endemic species probably increase the chance of mixed infections in the eastern Tibetan plateau.     

新疆新源县和四川石渠县啮齿动物及家畜棘球绦虫线粒体cox1基因遗传多态性分析

目的了解新疆新源县和四川石渠县棘球绦虫线粒体细胞色素。氧化酶亚基1 (cox1)基因的遗传多态性,探讨棘球绦虫在我国的传播动力和传播方向。方法 2014-2018年,在新疆新源县、四川石渠县捕捉啮齿类动物并采集其肝组织样品,收集家畜病变脏器。提取肝组织和病变脏器组织的DNA,PCR扩增棘球绦虫cox1基因片段,经分子克隆、测序后,在NCBI数据库中比对以确定所感染的虫种。使用Clustal X2和MEGA 7剪辑序列,使用DnaSP v5和Arlequin 3.5计算核苷酸多态性和中性检验,分析新源县和石渠县棘球绦虫的遗传多样性。以石渠棘球绦虫为外群,用MrBayes 3.2.4建立基于cox1基因的贝叶斯系统进化树,总结分析虫种的基因型。采用Network 5.0绘制棘球绦虫cox1基因的单倍型网络图,分析单倍型结构。结果在新疆新源县捕获普通田鼠122只,收集绵羊病变脏器5个;在四川石渠县捕获青海田鼠144只、经营田鼠44只和高原鼠兔135只,收集牦牛病变脏器6个。其中从5只绵羊、4头牦牛的病变脏器样品DNA扩增获得细粒棘球绦虫cox1基因片段40条(新源县26条,石渠县14条),从8只普通田鼠、14只青海田鼠、5只经营田鼠和2只高原鼠兔获得多房棘球绦虫线粒体cox1基因59条(新源县20条,石渠县39条),扩增产物长度均为875 bp。细粒棘球绦虫在两地的遗传分化程度(Fst=0.088 63)高于多房棘球绦虫(Fst=0.000 88),新源县细粒棘球绦虫遗传多样性(0.002 58±0.000 46)低于石渠县(0.005 88±0.000 58),而其多房棘球绦虫遗传多样性(0.002 28±0.000 46)高于石渠县(0.001 37±0.000 30)。贝叶斯系统进化树显示,两地的细粒棘球绦虫基因型为G1型,多房棘球绦虫为亚洲型。序列比对发现25个细粒棘球绦虫cox1基因单倍型(新源县15个,石渠县9个,共同单倍型1个)和29个多房棘球绦虫cox1基因单倍型(新源县13个,石渠县15个,共同单倍型1个),两种棘球绦虫的单倍型网络图均为环绕主单倍型(共同单倍型)的辐射状结构,新源县的细粒棘球绦虫序列中有9条为主单倍型(34.6%,9/26),而石渠县仅有1条(1/14),显示出新源县在细粒棘球绦虫单倍型结构中的核心位置;石渠县的多房棘球绦虫基因序列中有23条为主单倍型(58.9%,23/39),而新源县为7条(35.0%,7/20),表明石渠县在多房棘球绦虫的单倍型结构中更具有主导地位。结论新源县和石渠县的棘球绦虫线粒体cox1基因型一致,但遗传多态性存在一定差异,同等空间跨度上细粒棘球绦虫的遗传分化程度要高于多房棘球绦虫,这些差异为探讨棘球绦虫传播方向和动力提供了重要参考依据。