超顺磁氧化铁和EGFP双标NGF基因修饰中脑神经干细胞的建立

目的:建立超顺磁氧化铁(SPIO)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双标神经生长因子(NGF)基因修饰中脑神经干细胞。方法:以质粒pcDNA3-hNGF、pEGFPN1共转染第三代大鼠胚胎中脑神经干细胞并用SPIO标记。荧光显微镜检测EGFP的表达;免疫细胞化学、Western Blot鉴定NGF的表达;普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记。结果:EGFP在基因转染12h后开始表达;免疫细胞化学、Western Blot表明细胞能正确表达NGF;普鲁士蓝染色显示细胞标记率达100%,透射电镜显示SPIO颗粒位于吞饮小泡和胞浆内。结论:建立了SPIO、EG-FP双标记NGF基因修饰中脑神经干细胞,为进一步开展细胞移植治疗帕金森病的研究奠定基础。     

绿色荧光蛋白、菲立磁体外双标记神经干细胞及其活性的研究

目的探索用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)重组逆转录病毒和菲立磁(超顺磁性氧化铁,,Superparamagnetic Iron Oxide,SPIO)体外双标记神经干细胞的可行性及其对细胞活力的影响。方法用病毒介导的GFP基因转导大鼠胚胎神经干细胞。用SPIO和Lipofectamine体外磁化标记经GFP标记的胚胎神经干细胞。用荧光显微镜观察双标记神经干细胞,并行普鲁士蓝染色,了解转染成功率。MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测标记神经干细胞的细胞增殖活力。结果双标记神经干细胞分化的细胞荧光显微镜下观察见发出绿色荧光,普鲁士蓝染色呈阳性。而未标记神经干细胞荧光显微镜下观察未见发出绿色荧光,普鲁士蓝染色呈阴性。MTT法检测发现GFP和SPIO双标记神经干细胞的增殖活力与未标记神经干细胞相比无改变。结论绿色荧光蛋白重组逆转录病毒和菲立磁可以有效地标记体外分离培养的大鼠胚胎神经干细胞。双标记神经干细胞的增殖、分化活力与未标记神经干细胞相比无改变。     

NT-3基因修饰施万细胞促进神经干细胞体外分化为神经元样细胞

目的：观测神经营养素-3（NT-3）基因修饰施万细胞(SCs)对神经干细胞体外分化为神经元样细胞的影响。方法：神经干细胞(NSCs)分别与NT-3基因修饰SCs（NT-3-SCs）、LacZ基因基因修饰SCs（LacZ-SCs）和SCs在体外共培养，7d后用免疫组化方法观测NSCs的分化并计算其中神经元样细胞的分化率。结果：NSCs在体外可分化为神经元样细胞（NF阳性）和神经胶质样细胞（GFAP阳性），与未基因修饰的SCs相比，NT-3-SCs能更有效地提高神经元样细胞的分化率，而LacZ-SCs与SCs没有明显区别。结论：NT-3-SCs能促进NSCs向神经元样细胞分化。     

稳定表达GFP的胚胎干细胞株的建立及其生物学特性研究

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的胚胎干细胞株,为探索胚胎干细胞及其衍生细胞移植后在体内的分化、迁移及整合提供细胞模型。方法构建含Neo抗性基因质粒pCX-EGFP-Neor并用脂质体转染胚胎干细胞系ES-D3,G418筛选得到稳定表达的细胞株。细胞计数检测其倍增时间、流式细胞仪分析细胞周期,酶组织化学检测碱性磷酸酶(AKP)的表达,免疫组化检测阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)并观察其体外分化能力。结果该细胞株可在体外形成拟胚体及各种形态的成熟细胞且均可发出绿色荧光。该细胞株的倍增时间约为12h,G0/G、G2/M、S期分别为22.16±2.03%、18.46±1.54%、59.38±5.76%。倍增时间和细胞周期与未转染GFP的ES-D3相比没有显著性差异(P>0.05)。碱性磷酸酶(AKP)和SSEA-1呈强阳性表达。结论我们成功地建立了稳定表达GFP的胚胎干细胞株,且其生物学特性未受到GFP的影响。     

NT-3基因修饰施万细胞促进移植的神经干细胞在损伤脊髓内分化为神经元样细胞

目的探讨神经营养素-3（NT-3）基因修饰施万细胞（SCs）对植入全横断性脊髓损伤处的神经干细胞（NSCs）分化为神经元样细胞的影响。方法将NSCs单独移植或与NT-3基因修饰SCs、LacZ基因修饰SCs和SCs联合移植到全横断性脊髓损伤处,67d后用免疫组织化学方法观测NSCs的分化,并计算其中神经元样细胞的分化率。结果NSCs在损伤脊髓内可分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与未基因修饰的SCs的作用相比,NT-3基因修饰的SCs能更有效地提高NSCs向神经元样细胞的分化率,而LacZ基因修饰的SCs与未修饰SCs没有明显区别。结论NT-3基因修饰SCs能促进NSCs在损伤脊髓内向神经元样细胞分化。     

NT-3基因修饰施万细胞与神经干细胞联合移植治疗全横断脊髓损伤的实验研究

为探索一种治疗急性脊髓损伤的新策略 ,本实验先用核荧光标记培养的神经干细胞 (NSCs) ;再用含神经营养素 3基因的腺病毒 (AdvNT 3)感染培养的施万细胞 (SCs) ,简称NT 3 SCs。然后建立大鼠全横断脊髓损伤模型 ,向损伤处分别移植NSCs、SCs +NSCs和NT 3 SCs +NSCs。所有动物存活 6 0d后 ,进行爬网格测验和BBB评分。接着在脊髓横断处远端组织内注射荧光金 (FG) ,动物再存活 7d。在处死动物前检测皮质运动诱发电位 (CMEP)和皮质体感诱发电位 (CSEP)。最后灌注固定动物 ,取材和切片并行形态学观察。结果显示 :1 NSCs能在损伤…     

NT-3基因修饰及维甲酸预诱导的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处分化为神经元样细胞的研究

目的 探讨移植在脊髓损伤处的神经营养素-3(NT-3)基因修饰及维甲酸(RA)预诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的潜能.方法 将MSCs、RA诱导的MSCs、LacZ基因修饰的MSCs、NT-3基因修饰的MSCs和NT-3基因修饰及RA预诱导的MSCs分别立即移植到脊髓全横断处(T10脊髓),术后67d取材和冷冻切片,用免疫荧光组织化学染色方法检测MSCs的分化潜能,计算各细胞移植组脊髓损伤处的MSCs分化为神经元样细胞的百分率.结果 移植的MSCs在受损伤的脊髓内可分化为神经干细胞(nestin阳性)、神经胶质样细胞(GFAP阳性)和神经元样细胞(NF和MAP2阳性),有些还可以向含有某种神经递质和有形成突触潜能的神经元样细胞分化(ChAT、5-HT和PSD95阳性).联合应用NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在受损伤的脊髓内更有效地提高MSCs向神经元样细胞分化的百分率.结论 NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在脊髓损伤处更好地分化为神经元样细胞.     

重组质粒pEGFP-Brn-4的构建及其在神经干细胞中的表达

目的构建神经发育转录因子Brn-4基因真核表达重组质粒,研究Brn-4在神经干细胞(NSC)中的表达情况。方法从新生鼠脑组织提取总RNA,利用RT-PCR的方法获得编码鼠Brn-4的基因片段,应用基因重组技术,将鼠Brn-4基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2中,应用脂质体转染NSC,荧光显微镜观察该Brn-4基因在NSC中的表达。结果限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子,Brn-4基因在NSC中获得表达。结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4通过鉴定,结构正确;Brn-4基因可在NSC中表达,可作为后续研究老年性痴呆动物模型转基因实验的基因来源。     

TRKC基因体外转染大鼠神经干细胞的方法

目的探讨体外转染TRKC基因的神经干细胞的制备方法。方法利用自行合成的引物进行PCR反应,定向克隆构建TRKC-cDNA质粒并进行DNA测序分析,将pEGFP-C1质粒和TRKC-cDNA质粒进行酶切、重组,构建出pEGFP-C1-TRKC质粒。用脂质体将重组质粒转染到体外培养的大鼠神经干细胞中。用W estern b lot、免疫荧光和MTT法观察转染基因的表达和转基因后神经干细胞的增殖活性。结果成功构建了TRKC-cDNA质粒,DNA测序证明所获得的目的基因与公布序列的一致性为99%,所获得的重组子符合研究要求。pEGFP-C1-TRKC质粒转染到神经干细胞后,宿主细胞能高效、稳定地表达目的基因产物GFP和TRKC。在NT-3作用下转TRKC基因神经干细胞的增殖活性有明显增强。结论以质粒为载体、脂质体为介导可成功地把TRKC基因转染到神经干细胞内,转染基因表达好且具有功能。     

超顺磁性氧化铁标记人Flk-1+CD31-CD34-间充质干细胞对细胞增殖及向神经细胞分化的影响

目的 探讨磁共振增强剂超顺磁性氧化铁(SHO)标记人Flk-1 CD31-CD34-间充质干细胞(hMSCs)对细胞增殖及向神经细胞分化的影响.方法 实验组hMSCs与含SPIO 50 mg/L及多聚赖氨酸(PLL)1.5 mg/L的培养基孵育过夜(12～18 h).通过生长曲线测定、台盼蓝染色及流式细胞仪检测评价SPIO对hMSCs增殖能力、细胞活性及细胞表面标志物的影响.经神经诱导后,通过免疫荧光法测定神经细胞特异性标志物的表达.结果 连续测定7 d细胞活性,活细胞率均超过90%,对照组及实验组生长曲线符合对数生长模式.两组细胞均表达CD44、CD105及Flk-1,而CD31、CD34为阴性.神经诱导后,神经特异性标志物的荧光A值在两组间无统计学差异.结论 SPIO作为磁共振活体示踪剂是安全、有效的.     

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIO）标记青山羊骨髓间充质干细胞的方法,并确定标记颗粒在细胞内的具体位置,评价标记效果。方法抽取骨髓离心,分离间充质干细胞制成单细胞悬液传代培养及扩增,用SPIO标记第三代骨髓间充质干细胞,显微镜下观察发现细胞内胞吞入大量SPIO颗粒后消化培养细胞,离心成团,于2.5%戊二醛固定,透射电镜常规制样,镜下观察并采集图像。结果电镜下骨髓间充质干细胞的超微结构保存良好,胞质内出现大量电子密度高的SPIO颗粒,呈小团状或点状分布,主要位于溶酶体内及滑面内质网、线粒体及胞浆中的膜性结构上,细胞膜表面和核膜上也可见少量的散在颗粒。结论透射电镜下显示用SPIO标记骨髓间充质干细胞阳性率高,超微结构保存良好,准确定位了SPIO在胞内的位置,此法可为干细胞移植的示踪提供依据。     

SPIO标记脂肪干细胞移植退变椎间盘内的MRI活体示踪

背景：国内外动物实验多是荧光标记骨髓间充质干细胞的移植,以SPIO标记脂肪干细胞移植后活体示踪对退变椎间盘修复作用的研究较少。 目的：活体监测SPIO标记的脂肪干细胞在退变椎间盘内的存活、迁移和转归,以及脂肪干细胞对退变椎间盘的修复及延缓退变作用。 方法：新西兰大白兔20只,兔椎间盘被分为4组,即正常对照组(L1/2),脂肪干细胞组(L2/3),PBS组(L3/4),SPIO-脂肪干细胞组(L4/5)。透视引导下用18G穿刺制作退变模型后2周行SPIO标记的脂肪干细胞移植。 结果与结论：SPIO-脂肪干细胞移植后即刻T2WI/FFE序列上可见椎间盘内明显低信号,8周后仍可检测到低信号。脂肪干细胞移植组与同时间点PBS组比较,椎间盘退变程度轻。提示SPIO-脂肪干细胞移植至椎间盘后,可通过MRI进行监测;脂肪干细胞椎间盘内移植有助于修复退变椎间盘和延缓椎间盘退变。     

SPIO标记猪脂肪干细胞的生物学特性与多向分化潜能及体外3.0T MR成像

背景：不同种类细胞的最佳化标记方案需要大量实验证明,而每种细胞对应标记策略的安全性检测至关重要。 目的：应用超顺磁性氧化铁联合多聚左旋赖氨酸标记猪脂肪干细胞,探讨磁标记对细胞生物学特性和多向分化潜能的影响以及标记细胞体外3.0T MR成像特性。 方法：五指山小型猪皮下脂肪分离培养脂肪干细胞;超顺磁性氧化铁-多聚左旋赖氨酸复合物标记液标记脂肪干细胞;应用3.0T MR对不同浓度标记细胞进行T1WI、T2WI及T2*WI序列体外成像。 结果与结论：普鲁士蓝染色显示标记细胞胞质内含有多少不等的蓝染铁颗粒,细胞标记率近100%;标记细胞向心肌、骨、脂肪方向诱导分化成功;不同浓度标记细胞MR扫描显示,随细胞浓度升高,3种序列信号变化率均增加;相同浓度细胞T2*WI信号变化率最大,T1WI最小,同一浓度3种MR序列间信号变化率差异均有显著性意义(P < 0.01);3.0T MR成像能检测到至少1×10⁶ L^-1标记细胞。结果显示应用超顺磁性氧化铁联合多聚左旋赖氨酸标记方案可有效标记脂肪干细胞,不影响细胞活力、增殖及多向分化能力;T2*WI序列检测标记细胞最敏感。     

超微超顺磁性纳米氧化铁标记犬口腔黏膜上皮细胞与磁共振成像实验

BACKGROUND: Epithelial cells are commonly used as the seed cell in tissue engineering; however, there is still a lack of an effective in vivo noninvasive trace technology. OBJECTIVE: To investigate the feasibility of labeling canine oral epithelial cells with ultrasmall superparamagnetie iron oxide (USPIO) and magnetic resonance imaging (MRI) in vitro.  METHODS: Oral epithelial cells from beagles were primary cultured, and then labeled by 0.75 mg/L poly-L-lysine combined with USPIO (0, 5, 10, 25, 50 and 100 mg/L), respectively. To determine the optimal dosage, the intracellular iron expression was identified by Prussian blue staining, and the cell viability in different groups was detected by cell counting kit-8. Finally, 2×105 labeled cells were suspended with 1 mL PBS buffer, and were screened using 3.0 T MR on T2*WI sequences in vitro.  RESULTS AND CONCLUSION: USPIO prepared with 0.75 mg/L poly-L-lysine could successfully label dog oral epithelial cells. Prussian blue staining showed intracellular blue spots, and the intracellular blue spots became more with the concentration increasing and saturated at the concentration of 25 mg/L. Cell counting kit-8 indicated that the cell viability did not change when the concentration < 25 mg/L. Among the T2*WI sequences, the MRI signal intensity decreased with the concentration increasing. In conclusion, canine oral epithelial cells can be effectively labeled with USPIO making no impact on cell viability when the concentration < 25 mg/L, and MRI can be used to track these labeled cells in vitro．     

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticle prelabelling of human neural precursor cells

Stem cells prelabelled with iron oxide nanoparticles can be visualised using magnetic resonance imaging (MRI). This technique allows for noninvasive long-term monitoring of migration, integration and stem cell fate following transplantation into living animals. In order to determine biocompatibility, the present study investigated the biological impact of introducing ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles (USPIOs) into primary human fetal neural precursor cells (hNPCs) in vitro. USPIOs with a mean diameter of 10–15 nm maghemite iron oxide core were sterically stabilised by 95% methoxy-poly(ethylene glycol) (MPEG) and either 5% cationic (NH₂) end-functionalised, or 5% Rhodamine B end-functionalised, polyacrylamide. The stabilising polymer diblocks were synthesised by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerisation. Upon loading, cellular viability, total iron capacity, differentiation, average distance of migration and changes in intracellular calcium ion concentration were measured to determine optimal loading conditions. Taken together we demonstrate that prelabelling of hNPCs with USPIOs has no significant detrimental effect on cell biology and that USPIOs, when utilised at an optimised dosage, are an effective means of noninvasively tracking prelabelled hNPCs.     

MRI活体示踪超顺磁性氧化铁标记兔骨髓间充质干细胞的自体皮下移植

背景：高磁场MRI已被成功应用于示踪移植超顺磁性氧化铁标记骨髓基质干细胞的研究,但目前还有应用低磁场MRI示踪移植干细胞的报道。 目的：探讨用0.2 T MRI活体示踪自体皮下移植磁化标记骨髓基质干细胞的分布和迁移的可行性。 方法：从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,采用超顺磁性氧化铁和BrdU双重标记后,与壳聚糖复合植入兔自体大腿皮下。自体皮下移植未标记骨髓基质干细胞和皮下单纯注射超顺磁性氧化铁为对照。 结果与结论：超顺磁性氧化铁标记骨髓基质干细胞经普鲁士蓝染色和电镜检查证实细胞胞浆含致密铁颗粒。超顺磁性氧化铁标记后自体皮下移植的兔骨髓基质干细胞在GRET2*WI序列成像时产生特征性的低信号改变至少维持8周,且信号逐渐从移植部位进入组织深处。但普鲁士蓝染色和BrdU免疫组化显示大部分的移植细胞仍停留在原移植部位。提示体外超顺磁性氧化铁能有效地标记骨髓基质干细胞,利用0.2 T MRI活体示踪自体皮下移植的超顺磁性氧化铁标记兔骨髓基质干细胞分布和迁移是可行的。     

超顺磁氧化铁标记对大鼠脂肪干细胞向肝样细胞诱导分化的影响

目的 研究超顺磁氧化铁(SPIO)标记对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)向肝样细胞诱导分化的影响.方法 0.25％Ⅱ型胶原酶消化SD大鼠脂肪组织,获取原代ADSCs.采用多聚赖氨酸(PLL)介导SPIO(25 μg/ml)标记ADSCs,以肝细胞生长因子(HGF)作为主要诱导因子,分成标记-诱导组、未标记-诱导组、标记-未诱导组及未标记-未诱导组,后2组分别作为对照.光学显微镜检测标记细胞内的铁摄取.台盼兰染色评价ADSCs的细胞活力.SPIO标记-诱导组和未标记-诱导组细胞均向肝样细胞诱导分化.分别在诱导前、诱导后7、14、21d糖原染色分析肝样细胞内糖原储存;免疫细胞化学染色和RT-PCR分析肝样细胞内白蛋白(ALB)的表达.结果 ADSCs胞浆内铁标记率为100％.SPIO标记组与未标记组的细胞活力差异无统计学意义(P＞0.05).标记诱导组与未标记诱导组在诱导后14d细胞胞浆糖原染色均为阳性;诱导21d后,2组细胞胞浆内染色阳性的细胞增多.14、21 d ALB mRNA和蛋白表达水平逐渐增强.结论 SPIO标记对大鼠ADSCs的生长及其向肝样细胞诱导分化无明显影响.