耐酸耐高温α-淀粉酶及其菌种选育研究进展

耐酸耐高温α-淀粉酶能在高温与低p H下水解淀粉,是重要的新型工业酶制剂。概述了耐酸耐高温α-淀粉酶的热稳定性、p H稳定性及金属离子对其的影响,阐述了产酶菌种的主要来源现状,并重点对耐酸耐高温α-淀粉酶诱变育种的复合诱变、基因工程定点突变等菌种选育和古菌的相关研究进行了综述。     

酸土脂环酸芽孢杆菌Fe-SOD基因克隆及生物信息学分析

酸土脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的独特生理特性,从该属细菌中分离到的多种酶类都具有耐酸热稳定性,是筛选耐酸耐热酶的重要菌种资源。超氧化物歧化酶(SOD)由于具有重要的生理功能而广泛用于食品、药品及化妆品等行业。为了深入探讨酸土脂环酸芽孢杆菌SOD的分子生物学特性,本研究利用同源克隆、交错式热不对称PCR技术和生物信息学方法进行Fe-SOD基因克隆、测序及序列分析。结果表明,Fe-SOD基因(GenBank序列号:JN614998)ORF全长为606bp,编码202个氨基酸,其推测氨基酸序列与来源于酸热脂环酸芽孢杆菌DSM446的Fe-SOD(ACV58017.1)序列相似性最高,为78%。整个蛋白序列含有Fe/MnSODs家族的5个模体,SOD活性中心含有金属离子结合配基His27、His82、Asp164和His168,具有Fe/MnSODs家族典型的蛋白结构特征。酸土脂环酸芽孢杆菌Fe-SOD基因的克隆和生物信息学分析为进一步构建原核表达载体、获得生产耐酸热Fe-SOD的基因工程菌株奠定基础。     

耐高温α-淀粉酶特性的研究

耐高温α-淀粉酶是在高温下具有最适反应温度的α-淀粉酶。本文对地衣芽孢杆菌所产耐高温α-淀粉酶的最适反应温度、热稳定性、最通反应 pH 以及 pH 稳定性等进行了系统的研究,为该酶的广泛应用提供了理论基础。     

以淀粉为碳源的赖氨酸产生菌的选育

本文以嗜热芽孢杆菌和北京棒杆菌为出发株,经原生质体融合操作获得融合棒,该融合株具有在淀粉培养基上产生赖氨酸和α-淀粉酶的能力,赖氨酸产率为2.5g/L左右,α-淀粉酶活力为10000～20000u/ml     

极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

为探索极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WB600）中的高效分泌表达条件,对来源于枯草芽孢杆菌的9?种Sec分泌途径信号肽进行筛选,结果显示信号肽YfkN的引导分泌效率最高。在此基础上,为进一步优化PFA的分泌表达,对信号肽YfkN的Ile3和Gln4进行饱和突变,并比较不同突变体的引导分泌效率。结果表明突变体I3G/Q4R的引导分泌效率最高,重组枯草芽孢杆菌的胞外α-淀粉酶活力高达715?U/mL。重组α-淀粉酶PFA的最适反应pH值为5.0,最适反应温度为100?℃,于100?℃的半衰期长达13?h,并且不依赖于Ca2＋。结果表明,采用信号肽I3G/Q4R,极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达,这有利于其在淀粉液化工艺中的应用。     

α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

α-淀粉酶基因经改造后,克隆到穿梭质粒pBE2中。在α-淀粉酶基因的上游连接枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR),构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,转化蛋白酶三缺陷枯草芽孢杆菌菌株DB403。含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外,表明sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR)能很好的将枯草芽孢杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性及生物学活性。     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。     

嗜热脂肪土芽孢杆菌GL-1 Hsp33基因的克隆及结构分析

以嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）GL-1为研究对象,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得该菌株的热休克蛋白33（Hsp 33）基因,通过ExPASy、SOPMA、Pymol等在线软件对其进行生物信息学分析。同时,考察热胁迫处理对嗜热脂肪土芽孢杆菌GL-1生长的影响,并利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）研究菌株在热胁迫中Hsp33基因的表达情况。结果表明,通过PCR扩增得到碱基长度为876 bp的Hsp33基因,该基因与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1vzy的Hsp33基因序列相似性达到99%,其表达的蛋白质结构与Bacillus subtilis 1vzy的Hsp33蛋白具有相似的核心结构域,二者除C-末端稍有不同外,具有相同的β-折叠和α-螺旋,无卷曲螺旋。热胁迫对嗜热脂肪土芽孢杆菌GL-1生长具有影响,当菌株受到热胁迫时,Hsp33基因表达量增加,说明在受到热胁迫时,Hsp33蛋白作出了应激反应。     

一株热反硝化地芽孢杆菌Y62产耐高温α-淀粉酶的异源表达

为获得耐高温α-淀粉酶的菌株,该研究从常年覆盖热油的土壤中分离筛选产耐高温淀粉酶的细菌,通过形态学、生理生化分析和16S r RNA鉴定菌株种属,对筛选出的菌株进行中试工程化发酵产酶,下游酶分离中利用简便的硫酸铵沉淀法分离粗酶,并且对分离纯化的耐高温淀粉酶提取物进行热稳定评价。克隆菌株耐高温淀粉酶的基因序列并用于构建表达载体,在大肠杆菌BL21中成功进行异源表达,并对所产淀粉酶进行生物信息学分析。结果表明：通过筛选获得一株产淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)Y62,中试放大后在48 h取得112.7 U/mL酶活,其粗酶回收率可达90.2%。该淀粉酶具有良好的耐高温特性,在100℃下仍能保持37.8%的活性。异源表达产物以包涵体的形式存在,改变诱导条件后溶出可溶性蛋白,纯化产物经过质谱鉴定后确定该淀粉酶为α-淀粉酶。生物信息学分析及预测表明该耐高温淀粉酶编码511个氨基酸,分子量为59.86 kDa,含2个跨膜区域、3个催化位点和2个Ca²⁺结合位点,与已报道的α-淀粉酶GTA相似。     

肉制品主要组分对嗜热脂肪芽孢杆菌耐热性影响研究进展

嗜热脂肪芽孢杆菌是一种兼性厌氧菌,其芽孢是耐热性最强的芽孢之一,通常作为验证湿热灭菌程序的生物指示剂,同时也是造成肉制品腐败变质的主要微生物之一。本文主要从嗜热脂肪芽孢杆菌的特性、肉制品主要组分对嗜热脂肪芽孢杆菌耐热性的影响和几种“冷杀菌”方式与热杀菌的比较来介绍国内外近年来关于嗜热脂肪芽孢杆菌耐热性的研究进展。通过对这些研究成果的梳理,希望获得保障食品安全基础上的,具有风味保持、营养价值保存优点的货架期延长技术,为食品加工过程节能降耗提供新的思路。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku,同核酸序列测定所推导的值相符。     

温度和pH值对耐高温α-淀粉酶活力的影响

本文系统的研究了温度、pH值和底物浓度对地衣芽孢杆菌HM-3产生的耐高温α-淀粉酶酶活力的影响。研究结果表明：地衣芽孢杆菌HM-3N耐高温α-淀粉酶的最适酶促反应温度为：75％-85℃之间，最适作用的pH值为：6．1-7．0之间，该酶用于玉米淀粉的液化其最适底物浓度是20％～25％。     

凝结芽孢杆菌益生机制及应用研究进展

益生菌凝结芽孢杆菌是近年来国内外学者的研究热点,不仅具有益生菌的调节肠道内菌群平衡、促进营养物质代谢和利用、提高免疫力等保健特性,更重要的是具有耐高温、耐酸和耐胆盐等高抗逆性特点。凝结芽孢杆菌作为新型微生态制剂,在畜牧业、水产养殖业、医药、保健和食品行业已广泛应用。主要对凝结芽孢杆菌概况、生物学特性、益生作用机理、安全性、微生态制剂及临床应用等方面研究进展进行概述。     

应用全自动核糖体RNA基因指纹技术快速鉴定细菌菌种

应用RiboPrinter全自动核糖体RNA基因指纹技术对4株未知菌种进行快速鉴定,并与生理生化试验结合16SrDNA序列测定方法相比较.结果表明,两种方法均成功地完成了4株未知菌种的鉴定,其结果分别为大肠杆菌、嗜热链球菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌.相比之下,生理生化试验结合16S rDNA序列测定的方法经济实用,而RiboPrinter系统更为简便、快速,在8h内快速地完成了4株未知菌种的鉴定,并且为菌株的基因分型以及溯源分析奠定了基础.     

细菌α-淀粉酶发酵技术研究(Ⅱ)——淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶的发酵条件的研究

将在日本收集的α-淀粉酶有关菌种,作了菌种酶活性的比较,发现淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens KA 63培养在10%可溶性淀粉,2%蛋白胨,1%牛肉膏,0.5%酵母粉,0.5%NaCl,0.5%K_2HPO_4中可获较高的α-淀粉酶酶活,2升发酵罐培养28-30小时,α-淀粉酶酶活可达400单位/亳升,该菌种具有一定的生产价值,将为我国增添一个液化型α-淀粉酶的新品种。     

四特酒大曲中枯草芽孢杆菌的益生特性研究

在四特酒大曲中分离纯化出4株细菌,经鉴定为枯草芽孢杆菌。通过采用体外模拟动物胃肠道环境的方法,对该4株枯草芽孢杆菌的益生特性(对酸、胆盐的耐受性及抑菌效果和产酶特性)进行研究。结果表明,其中有2株枯草芽孢杆菌具有较强的耐酸和耐胆盐能力,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用,分解淀粉酶和蛋白酶的能力也较高。因此,可判断这两株枯草芽孢杆菌具有较好的益生特性。     

溶氧等参数对耐高温α-淀粉酶发酵的影响

利用耐高温α－淀粉酶的生产菌种－地衣芽孢杆菌IIY－1菌株，对其发酵过程中的各种参数的变化规律与控制方式进行了研究。实验结果表明，采用连续式的pH值的控制方式有利于提高耐高温α－淀粉酶的发酵水平，最后的发酵液的酶活力明显地高于脉动式的pH值控制方式。菌体在产酶阶段对发酵液的溶氧水平要求不高，但是溶氧浓度（DO值）不应低于10％。     

α-淀粉酶的基因改造与菌种选育研究进展

α-淀粉酶是重要的工业用酶制剂之一,能在高温、低pH范围内稳定发挥作用的α-淀粉酶则具有更加广阔的应用前景。本文主要从基因改造与菌种选育两方面阐述了高温α-淀粉酶、酸性α-淀粉酶以及高温酸性α-淀粉酶的研究与开发进展。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

从食品中分离嗜热脂肪芽孢杆菌性状初步研究

从不同食品分离到10株嗜热脂肪芽孢杆菌。观察了它们的形态学、生理生化性状,进行了菌种鉴定;观察研究了此菌使低酸性罐藏食品变质的特点,以及变质过程和菌体自灭现象与温度的关系。指出了分离到的嗜热脂肪芽孢杆菌与国外报导同种菌的嗜热性的差异。