噬菌体展示载体的构建

目的 构建适宜噬菌体展示的载体系统。方法 利用pCOMB3的LacZ强启动子，Pelb引导序列，包膜蛋白Ⅲ基因，用NHeI-XbaI双酶切，切除一个克隆位点；同时设计一对引物，用PET-28（a)^ 作模板扩增550bp片段，插入XhoI-SpeI位点之间，扩增质粒后用限制性内切酶，PCR，DNA测序等方法作鉴定。结果 切除了272bpNHeI-XbaI片段。插入片段后酶切鉴定显示：XhoI,SpeI单酶切，XbaI,NheI无酶切；所构质粒用XhoI SpeI双酶切及PCR扩增均可见550bp片段；测序结果正确。结论 成功构建了一种高拷贝，稳定，多用途，易于操作的噬菌体展示载体。     

苦瓜MAP30基因的克隆与载体构建

目的对苦瓜中MAP30基因进行克隆,并采用基因工程手段构建植物表达载体。方法从苦瓜中提取基因组DNA,根据Genbank中已公开发表的MAP30序列,设计1ST-S、1ST-A、2nd-A 3个引物,并添加了SEKDEL序列、Kozak序列和组氨酸标签,采用PCR技术,从苦瓜的基因组DNA中扩增出一分子量在800~1 000 bp之间的片段,回收克隆测序。结果克隆获得片段与已公开发表的MAP30序列同源性达100%,对PCR检测阳性的质粒进行测序分析,目的基因已成功连接到pBI121载体上,构建成植物表达载体。结论成功构建MAP30基因植物表达载体,为将MAP30基因转入番茄、烟叶中,进一步大量获得MAP30奠定基础。     

真核表达载体pcDNA6/myc-hisB-GFP的构建

目的 构建带绿色荧光蛋白(GFP)的pcDNA6/myc-hisB的真核表达载体. 方法 采用亚克隆的技术扩增得到GFP的开放阅读框序列,Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ双酶切后插入pcDNA6/myc-hisB,重组体经质粒PCR和酶切鉴定,并转染HEK 293T细胞后观察绿色荧光的表达,同时经Western blot检测GFP和标签蛋白myc的表达. 结果 PCR扩增得到特异的GFP开放阅读框序列,质粒PCR和酶切鉴定显示pcDNA6/myc-hisB-GFP构建成功,细胞转染结果 表明重组体可以表达GFP和myc蛋白.结论 获得带有绿色荧光蛋白的pcDNA6/myc-hisB-GFP的真核表达载体,为此载体的应用拓展了更大的空间.     

含有CD基因的腺病毒载体的构建

目的 :构建携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体。方法 :先将真核表达载体质粒 pCI中的转录框架构建入腺病毒载体中 ,后再将CD和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点内。结果 :经过酶切鉴定成功地构建了分别携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体 ,对肿瘤的前药转换基因治疗有重要意义。     

rsistin基因的克隆及载体的构建

目的:克隆小鼠resistin基因及其连载体的构建,为进一步研究resistin的功能打下基础。方法:根据报道的小鼠resistin基因的全长mRNA序列为目的基因,即提取小鼠脂肪组织中的RNA,以RNA为模板,在逆转录酶的作用下,逆转录(RT)合成resistinDNA,再在TaqDNA聚合酶的作用下聚合酶链反应(PCR)扩增resistin cDNA,将扩增PCR产物(resistin cDNA)经纯化后与A-T连接于pGEM-T载体,重组质粒转化JM109感受态菌,蓝白斑筛选阳性菌落,摇菌、提取质粒。结果:提取的总RNA纯度A260/280为1.9,电泳条带28s∶18s比例约为2∶1,RT-PCR与欲扩增的目的片段的理论长度363bp相符,重组质粒插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。结论:成功克隆了小鼠resistin cDNA基因,为构建resistin基因打下基础。     

适用于shRNA表达研究的克隆载体构建

目的:建立一种适用于shRNA表达研究的克隆载体。方法:通过PCR扩增一段含有自杀基因ccdB和卡那霉素抗性基因的DNA序列,将其双酶切后克隆至shRNA表达载体pSilencer3.1-H1neo中,得到重组体pSilencer3.1-ccdB。运用此重组体构建荧光素酶的shRNA表达载体并设立对照进行非重组背景的结果比较。结果:成功建立了pSilencer3.1-ccdB克隆载体。应用此载体构建荧光素酶的shRNA的表达载体,结果显示完全消除了非重组背景。结论:建立了适用于shRNA表达研究的克隆载体,为进一步研究siRNA的基因功能奠定了基础。     

抗冻蛋白基因表达载体的构建和表达

目的 构建可用于大肠杆菌表达系统的含抗冻蛋白基因AFP的表达载体。方法 采用定向克隆方法将抗冻蛋白基因AFP全长插入表达载体pIN-Ⅲ－OmpA3,切除内含子,酶切鉴定重组质粒,IPTG诱导表达,热滞活性法测定AFP蛋白活性。结果 经酶切鉴定抗冻蛋白基因AFP插入表达载体pIN-Ⅲ－OmpA3中,切除内含子后,得到表达产物抗冻蛋白。结论 抗冻蛋白基因AFP的表达载构建成功,为将来工厂化生产抗冻蛋白奠定基础。     

RNAi-DNA表达载体的构建与应用

目的构建siRNA的DNA表达载体,为研究RNAi在哺乳动物内抑制靶基因表达奠定基础.方法合成含靶向EGFP基因的siRNA转录模板的发夹结构,将载体质粒pTZU6 1用Sal I Xba I进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,转染到肝癌SMMC-7721细胞中进行表达,检测转染前后EGFP表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用HindⅢ、EcoRI酶切鉴定及测序鉴定证明EGFP-siRNA转录模板完整、正确的插入到pTZU6 1质粒中,并在mRNA和蛋白水平抑制了肝癌SMMC-7721细胞中的EGFP表达.结论成功构建了siRNA的DNA表达载体,并初步应用于靶基因的抑制.     

Galectin-9基因不同亚型表达载体的构建

目的 构建galectin-9基因不同亚型的真核表达载体.方法 应用RT-PCR方法从人正常大肠上皮组织中扩增出galectin-9三种剪接体的全长片段,分别将片段连接到质粒载体pIRES2-EGFP上,经测序证实插入片段正确后,载体转染结肠癌LoVo细胞,再应用RT-PCR和Western blot方法证实转染效果.结果 测序结果证实载体上插入的galectin-9三种剪接体碱基序列正确,同时载体成功转染LoVo细胞,并成功表达三种剪接体蛋白.结论 成功构建了galectin-9基因不同亚型的真核表达载体,为研究galectin-9的多种功能创造了条件.     

GST-G3BP Domain 1～5原核表达质粒的构建及其表达

目的:构建GST-G3BP Domain1～5的融合表达质粒,并在大肠杆菌中稳定表达。方法:PCR扩增G3BP Domain1～5片段,利用限制性内切酶EcoRI和NotI将其连接至载体pGEX-4T-1,将连接产物转化大肠杆菌,挑取单菌落,提取质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序。将转化正确的大肠杆菌过夜培养,IPTG诱导融合蛋白表达,immobilized Glutathione beads钓取目的蛋白。结果:G3BP Domain1～5片段均成功连接至载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21中可得到稳定表达的融合蛋白。结论:GST-G3BP Domain1～5的融合表达质粒构建成功。     

pEGFP-VEGF重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的:构建一种含人血管内皮细胞生长因子121(VEGF121)的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在成骨细胞中的表达.方法:从人胎脑文库中,以PCR方法扩增出人VEGF121基因,构建入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,脂质体法转染成骨细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;免疫细胞化学及ELISA检测VEGF蛋白的表达.结果:PCR扩增出人VEGF121基因;构建入pEGFP-C1,体外成功转染入成骨细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,免疫细胞化学及ELISA检测到VEGF蛋白的表达.结论:重组质粒pEGFP-VEGF体外转染入成骨细胞后,目的基因能够在细胞有效表达,检测方法简便可靠,为利用转染该种目的基因的成骨细胞进行下一步实验提供了理论支持.     

miR375表达质粒构建及表达研究

目的 寻找一种高效、简便的构建表达miRNA质粒的方法.方法 该研究用PCR 方法直接从小鼠gDNA扩增了包含miRNA375(miR375)前体序列在内的一个126 bp片段以构建质粒pAAv-miR375.该研究用pAAV-miR375转染Hela细胞48 h后,用定量RT-PCR方法和Northern bloc检测Heh细胞中miR375的表达.结果 转染了pAAV-miR375的Hela细胞中有miR375的表达,而在转染了空质粒pAAV-MCS和未转染的Hela细胞中没有检测到miR375的表达.结论 该研究所构建的pAAV-miR375质粒能够表达miR-NA375.作者介绍的这一种构建表达miRNA质粒的方法比以往的方法更快速、高效、简便和保证序列的正确性.     

胸外科课间PBL教学实践中的“问题”构建

PBL教学已经成为培养医学生自主学习和解决问题的重要教学方式,其基本要素是场景真实性和问题的构建。胸外科临床见习是临床实践教学的重要组成部分。授课教师总结、分析胸外科课问PBL教学的实践经验,对PBL中“问题”构建的重要性有新的认识和体会,并结合文献复习,针对性进行了一些改进和探索,取得了良好的效果。     

加强医院文化建设的思考

医院文化已经成为医院生存和发展的重要战略资源和宝贵的物质及精神财富,有利于塑造良好的医院形象、增强职工凝聚力、增强医院市场竞争力、提高职工的整体素质及调节功能,但总体上仍存在一些不可忽视的问题,医院文化建设流于形式及表面。应通过提高医院管理水平、完善医院制度;以人为本进行管理（尊重人格、养成良好的自律意识和行为习惯、构筑双赢平台）;创造人性化服务（塑造环境文化、树立“以患者为中心”的服务理念;建立完整的医疗服务体系）;建立知识型医院;规范服务行为,促进医院文化建设。     

质粒重组体构建中连接,转化时间的探讨

探讨质粒重组体构建中，重组体连接反应的时间对转化与基因克隆结果的影响。方法，Ｃ ＥＢＶＢＨＲ１基因与ＰＢＶ２２１载体的妆为研究对象，对连反应在３ｈ、６ｈ、１２、２４ｈ４个时段连接液的转化效果进行研究。     

大鼠Pik3cb短发卡状RNA对平滑肌细胞增殖的影响

目的:构建大鼠Pik3cb短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,为利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术从转录后水平抑制血管移植术后移植静脉再狭窄的研究做准备。方法:经预实验设计并合成6条shRNA寡核苷酸片段,酶切鉴定和测序正确后挑选2条质粒转染入大鼠胸主动脉平滑肌细胞内,48、72h用荧光显微镜观察转染效率,Western blot检测Phospho-Akt(Ser473)蛋白的表达,流式细胞仪分别在24、48、72、96h检测细胞凋亡数目。结果:构建的两条大鼠Pik3cbshRNA经限制性内切酶酶切和DNA测序正确后分别命名为pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2,转染平滑肌细胞48h和72h转染率分别为15.7%和10.1%;Westernblot结果显示转染组Phospho-Akt(Ser473)蛋白表达明显下降;流式结果表明pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2组凋亡细胞数目明显增加,与对照组相比有统计学意义(P<0.05),各时间点错配质粒组与正常对照组相比差异无统计学意义。结论:成功构建了2条大鼠Pik3cbshRNA真核表达载体,有效促进凋亡,抑制平滑肌细胞增殖,为靶向Pik3cb的RNAi防治血管再狭窄奠定了基础。     

不同转染条件影响质粒转染效率的探讨

目的通过插入不同片段质粒、不同剂量的转染,研究GFP基因转染效率的变化。方法构建插入不同片段的载体,以不同条件转染HeLa细胞,以Northern blot分别检测转染入细胞中各个质粒的表达水平。结果 2.0×105/mL细胞浓度的转染效率高于1.0×105/mL细胞浓度;固定转染质粒和脂质体的比值,转染效率随转染复合物量的上升而增加;固定脂质体的量,C1-ORF2、C1-ORF2as和C1-280-1×14as随转染剂量的增加,转染效率先升高再下降或表现持平。结论转染质粒的种类、剂量及转染细胞浓度影响转染质粒报告基因表达。     

高等职业教育医学基础精品课程建设中的问题与思考

医学基础课程具有概念多、医学术语多、内容多、知识更新快、难度大等特点.高等职业教育医学基础精品课程建设中存在着医学生在校学习时间短、课时大量削减、理论与实践教学过程难以体现高等职业教育的特点等问题；其主要表现为教学内容选择难,“教、学、做”一体化难,基于工作过程的教学设计、项目及工作任务驱动难,工学交替难,特色与创新难等难点.因此,医学基础精品课程建设不应当硬套评审标准,而需要更加注重如何更好地在为专业课程服务方面创出特色.     

医学影像学重点学科建设与继续医学教育

目的:探讨继续医学教育在医学影像学重点学科建设中的重要性。方法:树立终身教育的理念,通过在职人员的自主学习和学历教育、参加各层次教学活动、专业项目培训、校内外及国内外学术交流、研讨会和发表高质量学术论文等继续医学教育方式,以提高本专业人员的业务水平。结果:医学继续教育促进了师资队伍建设和高素质创新人才的培养,同时也促进了学科建设和专业建设。结论:实现学科建设、科学研究和人才培养三者的有机结合与循环互动,才能推动医学重点学科的可持续发展。