DNA总体低甲基化、错配修复基因启动子甲基化异常与神经管畸形的相关性

目的研究神经管畸形（NTDs）胚胎脑组织和皮肤组织DNA总体甲基化以及错配修复基因启动子区甲基化水平。方法在山西省吕梁地区以医院为基础进行病例-对照研究。从县级医院及妇幼保健院收集经B超诊断为NTDs的胎儿标本,同时收集非病理性引产、无畸形和发育迟缓的胎儿作为正常对照组。运用甲基化定量试剂盒测定脑组织和皮肤组织的DNA总体甲基化水平,甲基化特异性多连接依赖性探针扩增试剂盒检测7个错配修复基因（MLH1,MSH2,MSH6,MSH3,MLH3,PMS2和MGMT）启动子区甲基化水平。结果共有65例NTDs胚胎,48例对照胚胎进入研究。①NTDs组的脑组织DNA总体甲基化水平显著低于对照组（5.3%vs6.5%,P〈0.001）,DNA总体低甲基化显著增加了NTDs发生风险（OR=4.98,95%CI：1.42-17.53）。皮肤组织DNA总体甲基化水平在两组间差异无统计学意义（13.3%vs13.1%,P〉0.05）;②NTDs和对照组的MSH6启动子（MSH6-301：2.5%vs3.7%,P〈0.05）和PMS2启动子（PMS2-328：5.7%vs6.7%;PMS2-142：2.0%vs2.7%,P〈0.05）的甲基化水平存在显著差异。结论 DNA总体低甲基化、错配修复基因启动子区的异常甲基化修饰与NTDs发生有关。     

肺结核中DNA低甲基化趋势与TETs及TDG的相关性研究

目的明确肺结核病人DNA低甲基化状态与TETs、TDG之间的相关性。方法在前期研究结果的基础上,收集健康对照和活动性肺结核病人治疗前全血RNA,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,对参与DNA甲基化下调的DNA去甲基化酶,即十-十一染色体异位酶基因(TETs,包括TET1、TET2、TET3)及胸腺嘧啶糖基酶(TDG)进行定量检测。利用H37Rv裂解抗原以及5-氮杂胞嘧啶核苷(5azac)刺激物刺激人肺癌细胞系A549和人支气管上皮细胞Beas-2B两种细胞系,并收集刺激后不同时间点细胞DNA、RNA。利用甲基化敏感性限制性分析(MSRA)对所收集DNA样本进行分析;进一步利用Real-time PCR(RT-PCR)方法对细胞RNA样本进行检测。结果在肺结核病人组中,DNA去甲基化酶表达均显著升高(P0.05)。H37Rv抗原、5azac导致DNA甲基化水平降低,且刺激时间越长甲基化降低越明显。且在刺激第4天A549细胞中H37Rv刺激组DNA去甲基化酶TET2、TET3上调,而在Beas-2B中为H37Rv刺激组DNA去甲基化酶TDG上调,与临床检测结果相符。结论在活动性肺结核病人中及体外细胞刺激实验H37Rv抗原刺激组中,DNA甲基化呈现低甲基化趋势;DNA去甲基化酶可能是参与其DNA低甲基化趋势的主要的酶。     

人软骨性肿瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白的表达

一、材料与方法采用中山医科大学病理学教研室、中山医科大学附属肿瘤医院病理科和广州市第一人民医院病理科存档石蜡标本软骨瘤１８例、骨软骨瘤２０例、软骨肉瘤２７例。新鲜冷冻骨软骨瘤１例和软骨肉瘤４例。另取正常软骨６例作对照。切片厚５μｍ,ＬＳＡＢ法标记,Ｄ...     

人肝细胞癌金属蛋白酶组织抑制因子-3的表达及与其基因启动子甲基化的关系

目的 探讨肝细胞癌的发生和门脉浸润机制。方法 20例肝细胞癌患者,每例在手术后分别取原发瘤、门脉瘤栓及远离肝癌之肝组织。用Western印迹法检测金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)的蛋白表达,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TIMP-3 mRNA的表达,用甲基化特异性PCR检测TIMP-3基因启动子的甲基化。结果 远离肝癌之肝组织中均可见TIMP-3蛋白和mRNA的表达,原发瘤和门脉瘤栓组织TIMP-3蛋白和mRNA表达明显降低,其中分别有5例和6例完全丢失。远离肝癌之肝组织均未发现TIMP-3启动子甲基化。原发瘤中有7例、门脉瘤栓组织中有9例出现甲基化。所有有甲基化的肝癌组织,包括原发瘤和门脉瘤栓,有13例TIMP-3 mRNA和蛋白表达完全丢失,6例表达降低。TIMP-3启动子甲基化和肝细胞癌组织学分级无关(P>0.05)。结论 肝细胞癌的发生和门脉浸润与TIMP-3基因和蛋白缺失或降低相关、而TIMP-3启动子甲基化是其基因和蛋白缺失或降低的原因。     

乙肝病毒X蛋白对人肝细胞内β-catenin定位及转录活性的影响

目的 研究HBx对Wnt/Wingless信号传导通路中主要信号分子 -catenin的影响,探讨HBV相关性HCC的发生机制。方法 Ad-HBx转染人肝细胞系L02细胞,免疫细胞化学和Luciferase检测细胞中?-catenin细胞定位及活性变化。结果 免疫细胞化学：转染重组HBx腺病毒前L02细胞中β-catenin仅在细胞质有少量表达,转染后胞质表达明显增强,并出现胞核的大量积聚;Luciferase检测：实验组TOP荧光素酶活性与对照组及空白组相比明显增强,为阴性对照的11倍（P<0.05）,Ad- HBx感染后24和36h 的TOP荧光素酶活性无显著差异。结论 Ad-HBx重组腺病毒在体外能有效转染人肝细胞系L02细胞,受感染细胞能有效表达HBx蛋白,HBx影响了人肝细胞系L02细胞中β-catenin的细胞定位及转录活性。     

SV40增强子修饰提高人端粒酶逆转录酶启动子的转录活性

人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子能启动治疗基因的表达,用于治疗端粒酶阳性肿瘤。已有研究运用hTERT启动子携带肿瘤治疗基因进行肿瘤靶向性的基因治疗。天然hTERT启动子的活性表达相对较弱,我们通过构建hTERT—SV40这一嵌合启动子系统来增强hTERT启动子的靶向转录活性,以期为建立活性更高的肿瘤特异性启动子系统奠定基础。     

重组人aFGF的克隆、表达及活性测定

目的：为了研究酸性成纤维细胞生长因子（aFGF)的临床应用价值,将其开发为多肽类药物。方法：以RT－PCR从人肺成纤维细胞钓取人aFGF全编码区cDNA,使用Pichia分泌型酵母表达系统表达重组人aFGF,重组蛋白经肝素亲和层析纯化后,以NIH3T3成纤维细胞增殖实验、鸡胚尿囊膜法血管生成实验及小鼠创伤愈合实验检测活性。结果：重组人aFGF蛋白在酵母系统中得到较高量表达（12mg/L,并能够促进NIH3T3增殖、促进血管增生、促进伤口愈合,而且这种活性能被受体（FG－FR）的细胞外段拮抗。结论：重组人aFGF在酵母系统中实现高效表达,并具有很好的生物学活性。     

肝癌细胞中HLA Ⅰ类重链基因表达与启动子区域甲基化的相关性

目的： 研究肝癌细胞株中DNA甲基化与HLA Ⅰ类分子异常表达的相关性.方法： 应用MSP技术对相关细胞系的HLA I类分子重链A、B、C位点启动子区域CpG岛的甲基化状态进行分析, Real-time PCR检测HLA Ⅰ类分子重链mRNA水平的表达情况, Western blot检测RNA干扰后HLA Ⅰ类分子重链表达情况.结果： 在8株肝癌细胞系中HLA I类分子重链A、C位点启动子区域CpG岛存在甲基化; 将启动子区域的DNA甲基化与相关基因表达数据相比较显示二者没有关联性; 在RNA干扰DNA甲基化转移酶3a或3b的肝癌细胞系SMMC7721中, 比较基因干扰前后HLA Ⅰ类分子重链蛋白表达无显著变化.结论： 在研究的肝癌细胞系中DNA甲基化没有参与调控肝癌中HLA Ⅰ类分子的异常表达.     

放疗性舌炎与其病损组织血管内皮细胞损伤的相关性研究

目的观察放射性舌炎病损局部病损组织血管内皮细胞损伤的动态变化,分析其与放射性舌炎病损程度的相关性。方法建立放射性舌炎sD大鼠动物模型;观察其放射性口腔黏膜炎指数（oral mucositis index,OMI）;应用免疫组织化学方法（CD34）鉴定放射性舌炎病损局部病损组织血管内皮细胞;TUNEL检测RTG大鼠舌体病损组织内血管内皮细胞凋亡;统计学分析血管内皮细胞凋亡百分数与RTG口腔黏膜炎指数（OMI）间的时相变化关系。结果放射照射后3d可观察到明显的血管内皮细胞损伤和细胞凋亡,放射照射后的血管管腔变得明显不规则,管腔中可见有血栓形成,管腔内膜凹凸不平,血管扩张,管径变大,血管内皮细胞与基底膜分离脱落到管内,并可看到部分血管狭窄严重、闭塞。血管内皮细胞TUNEL检测到血管内皮细胞凋亡,5d组凋亡内皮细胞百分数（％）为（78．3±0．31）,8d组为（89．3±0．83）,14d组为（83．5±0．41）,21d组为（69．3±0．57）,28d组为（47．3±0．59）。5d、8d、14d、21d、28d时RTG口腔黏膜炎指数（OMI）与大鼠舌组织血管内皮细胞凋亡百分比的相关系数R=0．67（P=0．034）。结论RTG病损组织内血管内皮细胞损伤与RTG的病情相关,提示血管内皮细胞损伤可能在RTG病理过程中起作用并有潜在应用价值。     

SOD2启动子的克隆及转录活性的检测

目的： 克隆小鼠锰超氧化物歧化酶基因(MnSOD, SOD2) 5非编码区启动子序列，通过报告基因技术检测在静息或脂多糖（LPS）、亚砷酸钠(NaAsO2)等刺激下该段启动子的转录活性。方法: 提取小鼠肝组织基因组DNA，PCR扩增小鼠SOD2启动子序列(-1 554～+48)；采用基因重组技术构建由SOD2启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体，将该载体瞬时转染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，荧光显微镜下观察静息或NaAsO2、LPS、佛波酯(PMA)刺激下红色荧光蛋白表达。结果: 正确扩增出小鼠SOD2启动子(-1 554～+48)片段；成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体，证实该质粒转染MEF细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光，经NaAsO2、LPS、PMA刺激后，红色荧光强度和亮度明显增加。结论: 小鼠SOD2启动子(-1 554～+48)在静息状态下即具有转录活性，炎性、氧化应激刺激后SOD2表达增强；该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建，为研究SOD2的基因表达调控机制提供了重要基础和工具。     

人内皮抑素基因改造、表达、纯化及活性检测

目的克隆诱变的人内皮抑素(human endostatin,hES)氨基端基因,并检测其活性。方法双酶切已诱变的人内皮抑素基因,电泳回收氨基端片段,与质粒pTYB-2重组,转化E．coli BL-21(DE3)。通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,MTT实验,HE染色及流式细胞术检测重组小分子人内皮抑素对新生血管生成、细胞增殖和细胞凋亡的影响。结果基因重组小分子内皮抑素对鸡胚尿囊膜新生血管生成具有明显的抑制作用;对脐静脉内皮细胞和肝癌细胞增殖的抑制存在量效关系;作用24h后,观察到细胞凋亡现象;与对照组相比,细胞凋亡数增加。结论成功构建了人内皮抑素氨基端基因工程菌,得到了具有生物活性的氨基端小分子内皮抑素,为便利临床应用奠定了基础。     

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

纤维连结蛋白启动子的克隆及转录活性的研究

目的：克隆纤维连结蛋白（FN） 启动子和检测其转录活性，并初步研究增加SV40增强子对其转录活性的影响。方法:从正常人gDNA中克隆FN启动子，驱动氯霉素乙酰转移酶报告基因表达，构建成有SV40增强子和无SV40增强子两个重组体报告载体。利用脂质体介导的转染技术导入HT1080细胞，检测各重组体的瞬时表达，确定克隆FN启动子转录活性和SV40增强子对其转录活性的影响。 结果:克隆的FN启动子在HT1080细胞中活性比SV40启动子稍强，在加入SV40增强子时活性提高了约6倍。 结论:成功的克隆FN启动子，在HT1080细胞中有活性，通过增加SV40增强子能大大提高其活性，为运用FN启动子和特异性靶细胞治疗各种遗传性疾病提供了一定基础。     

普伐他汀对人Ⅰ型胶原α 1(Ⅰ)链启动子活性调控的研究

目的研究普伐他汀人Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)链启动子活性的调控,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ型胶原合成的影响.方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代、传代培养.构建含人α 1(Ⅰ)前胶原基因5'侧翼序列-2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体phCOL2.5,用FuGENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞,CAT-ELISA测定普伐他汀对重组体的作用.结果设对照组的CAT值为1,普伐他汀组的CAT值为0.62±0.04,普伐他汀能明显抑制Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)启动子的活性.结论普伐他汀可以在转录水平上调节人α1(Ⅰ)前胶原基因表达.     

普伐他汀对人Ⅰ期胶原α1（Ⅰ）链启动子活性调控的研究

目的：研究普伐他汀对人Ⅰ期胶原α1（Ⅰ）链启动子活性的调控,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ期胶原合成的影响。方法：大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代,传代培养,构建含人α1（Ⅰ）前原基因5'侧翼序列－2．5kb与报告基因氯霉素乙酰基转酶（CAT）的重组体phCOL2.5,用FuENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞,CAT－ELISA测定普伐他汀能明显抑制Ⅰ型胶原α1（Ⅰ）启动子和活性。结论：普伐他汀可以在转不水平上调节α1（Ⅰ）前胶原基因表达。     

人血管抑制因子的原核表达、纯化及活性研究

目的：利用大肠杆菌表达系统表达人血管抑制因子，并利用镍金属螯合层析法进行纯化，探讨其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法：采用RT-PCR技术从人肝脏组织中获取人血管抑制因子的cDNA，将其克隆至原核表达载体pQE30中进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析，并利用镍金属螯合层析法进行纯化。^3H-TdR法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果：利用pQE30表达载体表达的含6个组氨酸尾的vasostafin蛋白，在SDS-PAGE上表现出一条约2lkD的阳性条带，经镍金属螯合层析纯化后的蛋白经肽指纹图谱分析鉴定为目的蛋白，在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖。结论：人血管抑制因子可在大肠杆菌中以包涵体形式高水平表达，并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性．     

敲低线粒体转录因子A(TFAM)抑制人宫颈癌细胞及骨肉瘤细胞自噬及增殖、侵袭和迁移

目的 研究线粒体转录因子A(TFAM)对宫颈癌HeLa细胞及骨肉瘤U2OS细胞的线粒体功能、自噬、增殖、侵袭、迁移的影响。方法 HeLa、 U2OS细胞转染TFAM小干扰片段(si-TFAM)下调TFAM表达,Mito-Tracker Red CMXRos染色结合激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位(MMP)、 MitoSOX^TM Red标记法检测线粒体活性氧(mtROS)水平、实时定量PCR检测线粒体DNA(mtDNA)的表达,免疫荧光细胞化学染色检测自噬体数量的变化。Western blot法检测TFAM、微管相关蛋白1轻链3A/B(LC3A/B)、自噬相关基因2A(ATG2A)、 ATG2B、 ATG9A、锌指转录因子Snail、基质金属蛋白酶2(MMP2)和MMP9的表达。CCK-8法、平板集落形成实验检测细胞增殖,Transwell^TM实验、划痕愈合实验检测细胞侵袭、迁移的变化。结果 下调TFAM表达导致HeLa及U2OS细胞MMP减少,mtDNA拷贝数减少,mtROS产生量增加。LC3A/B蛋白含量较对照组明显下降,胞质内自噬体数量明...