人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa Fab抗体的研制及其对血小板聚集功能的影响

目的：构建人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa（GPIIb／IIIa）Fab噬菌体抗体库,筛选抗GPIIb／IIIa特异性的噬菌体抗体,并对其功能进行研究。方法：取血小板膜糖蛋白抗体（抗GPIIb／IIIa）阳性的特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者脾细胞,采用噬菌体抗体库技术构建人源性抗GPIIb／IIIa Fab噬菌体抗体库,以表达GPIIb／IIIa的CHO123细胞筛选抗体库,并以ELISA法检测噬菌体抗体;用Western blot对抗体进行鉴定,并测定其与血小板抗原的结合;观察筛选到Fab抗体对血小板聚集的影响。结果：筛选出2株能够与血小板膜GPIIb／IIIa特异性结合的Fab抗体,其序列与人免疫球蛋白轻、重链可变区序列具有高度同源性,表达纯化的Fab抗体能抑制血小板聚集。结论：成功地从人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa Fab抗体库筛选出特异性识别GPIIb／IIIa,具有抑制血小板聚集作用的人源性抗体。     

噬菌体抗体库中筛选血小板膜糖蛋白Ⅱ b/Ⅲa特异的人源性Fab抗体

本研究利用特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)患者产生抗血小板自身抗体的特点,从ITP患者脾脏细胞中提取RNA,扩增抗体轻链和重链Fd基因,插入噬粒载体pComb3H,构建人源性抗GP Ⅱ b/ⅢaFab噬菌体抗体库.以表达GP Ⅱ b/Ⅲa的CHO123细胞筛选抗体库,制备人源性GPⅡb/Ⅲa Fab噬菌体抗体.     

人源性抗血小板膜糖蛋白IIb/IIIa Fab噬菌体抗体库的构建

目的:构建人源性Fab噬菌体抗体库,为进一步从抗体库中筛选人源性抗GPIIb/IIIaFab抗体奠定基础。方法:利用RT-PCR和噬菌体表面展示技术,直接从血小板膜糖蛋白抗体(抗-GPIIb/IIIa)阳性的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者脾细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA,扩增抗体轻链和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次将PCR产物插入噬粒载体pComb3H相应位点,电转化大肠杆菌XL1-blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建成人源性Fab噬菌体抗体库。结果:成功地构建库容量达6.2×106的抗血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIaFab噬菌体抗体库。结论:构建了人源性Fab抗体库,并达到建库标准,可进一步从中筛选人源性Fab抗体。     

抗血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab抗体的原核表达及其生物活性

目的：研制抗血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa Fab抗体。方法：通过问接免疫荧光试验和血小板聚集抑制试验，选取鼠源抗血小板糖蛋白Ⅱb／Ⅲa单克隆抗体(mAb P140)。从分泌该mAb的杂交瘤细胞株(P140)中，克隆到抗体轻链基因和重链Fd段基因，构建原核表达重组质粒p3MH／P140x-Fd，并在XLI-Blu菌株中进行表达。采用钴亲和层析法对P140 Fab抗体进行纯化，用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法，对P140 Fab抗体进行检测，并通过血小板聚集抑制试验，观察P140 Fab抗体的抗栓活性。结果：SDS-PAGE和Western blot表明，纯化的P140Fab抗体的相对分子质量(Mr)约为47000。ELISA的结果显示，P140 Fab抗体可与人血小板特异性结合。在体外ADP诱导的血小板聚集试验中，P140 Fab抗体对血小板聚集的抑制作用成剂量依赖性，IC50的平均值为16．85mg/L。结论：成功地研制出具有抗栓活性的抗血小板膜糖蛋白Ⅱb／Ⅲa的Fab抗体。     

中华眼镜蛇毒F组分抗血小板聚集的作用机制

目的 探讨中华眼镜蛇毒F组分抑制血小板聚集的作用机制.方法 用比浊法测定中华眼镜蛇毒F组分对二磷酸腺苷、花生四烯酸和血小板活化因子诱导血小板聚集作用的影响,流式细胞术观察中华眼镜蛇毒F组分对荧光标记的单克隆抗体CD41(FITC-CD41)和CD61(FITC-CD61)与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)结合的影响.结果 中华眼镜蛇毒F组分明显抑制二磷酸腺苷、花生四烯酸和血小板活化因子诱导的血小板聚集,其作用呈现一定程度的剂量依赖关系.中华眼镜蛇毒F组分可以明显降低单克隆抗体CD41(抗GPⅡb)与血小板的结合率,而对单克隆抗体CD61(抗GPⅢa)与血小板的结合率没有影响.结论 中华眼镜蛇毒F组分可以抑制多种激动剂诱导的血小板聚集,其机制和中华眼镜蛇毒F组分与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物的结合有关.     

ITP血小板特异性自身抗体（GPⅡb/Ⅲa和GPIbα）与糖皮质激素和静脉丙种球蛋白临床疗效的关系

目的检测特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者体内的抗血小板膜糖蛋白（GPⅡb/Ⅲa和GPIbα）特异性自身抗体,并探讨特异性自身抗体与糖皮质激素和静脉丙种球蛋白（静丙）治疗的临床疗效是否存在针对性,以便得到更经济和个体化的治疗方案,为ITP提出新的分型依据。方法应用改良的单克隆抗体特异性俘获血小板抗原（MAIPA）法检测抗GPⅡb/ⅡIa,GPIbα特异性自身抗体。结果双抗体阳性组与单一抗GPIbα抗体阳性组总疗效比较,差异无显著性（χ^2=0.995,P〉0.05）双抗体阳性组与单一抗GPⅡb/ⅡIa抗体阳性组总疗效比较,差异有显著性（χ^2=17.439,P〈0.01）,后者优于前者;单一抗GPⅡb/ⅡIa抗体阳性组,双抗体阳性组,双抗体阴性组,糖皮质激素治疗与糖皮质激素联合静丙治疗比较,差异无显著性（P〉0.05）。结论血小板特异性自身抗体种类（GPⅡb/Ⅲa和GPIbα）及种类数目与ITP的临床疗效（糖皮质激素、静丙）有一定关系,对临床治疗方案的选择有一定意义。以抗血小板膜糖蛋白（GPⅡb/Ⅲa和GPIbα）特异性自身抗体为ITP进行新的分型依据尚不足,需扩大样本量进一步研究。     

血小板无力症的流式细胞术分析方法

板膜糖蛋白(glycoprotein, GP)Ⅱb/Ⅲa属整合素家族, 是纤维蛋白原受体, 介导血小板的聚集.GPⅡb/Ⅲa复合物质的数量不够和质量缺陷都可导致血小板聚集功能障碍, 并导致产生患血小板无力症(Glanzmann′s thrombasthenia, GT)[1].检测血小板膜上GPⅡb/Ⅲa复合物的缺陷, 可从分子水平诊断GT.本文介绍一种用荧光单抗标记血小板, 通过流式细胞术分析诊断GT的方法.     

血小板相关抗体与原发性血小板减少性紫癜关系的研究进展

原发性血小板减少性紫癜 (idiopathicthrombocy topenicpurpura ,ITP)是一种自身免疫性血小板减少症 ,血小板减少的机制是由于自身免疫功能异常导致血液中产生血小板相关抗体 ,使循环中血小板破坏增加。ITP是由血小板自身抗体所引起的综合征 ,为临床常见的出血性疾病 ,其主要病理是血小板抗体的产生并吸附于血小板表面后加速血小板从循环中的清除 ,这些抗体作用的血小板膜靶抗原可多种多样 ,其中血小板膜上糖蛋白 (glycoprotein ,GP)Ⅱb/Ⅲa是一重要靶抗原 ,少数针对GPⅠb/ⅠX复合物。由于抗体直接作用于GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX等 ,使…     

抗血小板糖蛋白IIb/IIIa Fab抗体的原核表达及其生物活性

目的 :研制抗血小板膜糖蛋白IIb/IIIaFab抗体。方法 :通过间接免疫荧光试验和血小板聚集抑制试验 ,选取鼠源抗血小板糖蛋白IIb/IIIa单克隆抗体 (mAbP14 0 )。从分泌该mAb的杂交瘤细胞株 (P14 0 )中 ,克隆到抗体轻链基因和重链Fd段基因 ,构建原核表达重组质粒p3MH/P14 0к Fd ,并在XLI Blu菌株中进行表达。采用钴亲和层析法对P14 0Fab抗体进行纯化 ,用SDS PAGE、ELISA和Westernblot等方法 ,对P14 0Fab抗体进行检测 ,并通过血小板聚集抑制试验 ,观察P14 0Fab抗体的抗栓活性。结果 :SDS PAGE和Westernblot表明 ,纯化的P14 0Fab抗体的相对分子质量 (Mr)约为 4 70 0 0。ELISA的结果显示 ,P14 0Fab抗体可与人血小板特异性结合。在体外ADP诱导的血小板聚集试验中 ,P14 0Fab抗体对血小板聚集的抑制作用成剂量依赖性 ,IC50 的平均值为 16 .85mg/L。结论 :成功地研制出具有抗栓活性的抗血小板膜糖蛋白IIb/IIIa的Fab抗体     

慢性ITP患者血小板膜表面GPⅣ、GPⅤ特异性自身抗体的测定

目的：检测慢性ITP患者血小板膜表面GPⅣ、GPⅤ特异性自身抗体。方法：应用改良直接MAIPA(单克隆抗体俘获血小板抗原技术)检测血小板膜糖蛋白(GPⅣ、GPⅤ)特异性自身抗体。结果：慢性ITP患者血小板洗脱液中GPⅣ特异性和GPⅤ特异性自身抗体的阳性率分别为6．3％和4．8％。结论：血小板膜GPⅣ、GPⅤ分子是慢性ITP自身抗体的靶抗原，但多与GPⅡb／Ⅲa或GPⅠb自身抗原共存。     

肿瘤细胞诱导血小板聚集的机理

Lewis肺癌细胞(3LL),黑色素瘤细胞(B16a)与绒毛膜上皮癌细胞(NHCh-4)能引起人血小板的聚集反应,但聚集的强度与波型不同。胶质母细胞瘤细胞,(NHC-3)与直肠癌细胞(NHC-6)不引起血小板的聚集反应。抗血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa的单克隆抗体SZ-21抑制3LL引起的血小板聚集,抗GPIb的单克隆抗体AN51能部分抑制NHCh-4诱导的聚集。NHCh-4能刺激血小板生成TXP_2。3LL与B16a对血小板TXB_2生成的影响很小。结果表明,不同的肿瘤细胞引起血小板聚集的能力和机理各不相同,血小板在不同肿瘤转移中所起的作用也不一样。     

用单克隆抗体对ITP自身抗血小板抗体及其相关抗原的初步研究

本文应用三种抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体,按ELISA 间接法、ELISA双抗体夹心法、ELISA竞争法,对ITP患者自身抗血小板抗体及其相关抗原进行了初步研究。实验结果表明,抗血小板抗体的相关抗原呈多态性,包括:GPⅠb、GPⅡb及/或 GPⅢa,以 GPⅡb及/或 GPⅢa占多数,还可能包括血小板膜蛋白以外的其它抗原成分。这提示,ITP可能是一组复杂的、不均一的自身免疫性疾病。     

血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲ a基因突变与脑血栓的关系

血小板糖蛋白（GP）是一种存在于血小板质膜表面的糖蛋白,在血小板活化和血栓形成过程中起关键作用。血小板膜上存在多种糖蛋白,其中GPⅡh／Ⅲa属于整合素家族黏附受体,是血小板膜含量最多的糖蛋白。GPⅡb／Ⅲa是纤维蛋白原的受体,参与血小板的聚集。GPⅡh／Ⅲa受体的基因突变影响血小板表面受体表达的数量与质量,从而影响血小板聚集。因此,GPⅡh／Ⅲa基因的突变与脑血栓疾病的发生、发展密切相关。研究其基因突变及其与脑血栓的关系将为脑血栓的早期诊断和防治提供分子遗传学基础。     

血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合体分子生物学研究进展

GPⅡb/Ⅲa作为血小板膜上粘合蛋白(Integrin),主要参与血小板的聚集作用。随着分子生物学的进展和相关实验技术的应用,逐渐的对 GPⅡb/Ⅲa的分子结构和基因结构有了进一步的了解,对GPⅡb/Ⅲa的结构与功能的关系也有了更为深入的认识。本文就血小板膜GPⅡb/Ⅲa的分子结构、基因结构特征和基因突变对血小板聚集功能的影响进行综述。     

慢性ITP病人抗血小板糖蛋白Ⅱ_b/Ⅲ_a复合物自身抗体

慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)是由抗血小板膜的自身抗体而引起,这些抗体的抗原特异性尚不清楚。最近Van Leeuwen等报道:ITP病人的血清抗体或血小板上的抗体能与正常血小板结合,但不能与Glanymann血小板减少症病人的血小板结合。后者血小板上缺少糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,因此推测某些ITP病人抗血小板的自身抗体可能是针对糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物的。但Kunicki等发现ITB病人抗血小板抗体对正常和Glanzmann病人血小板都     

人源性Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1-AR抗体克隆的筛选

目的构建人源性Fab段噬菌体抗体库并筛选抗人β1-AR抗体克隆.方法通过RT-PCR从抗人β1-AR抗体阳性的扩张性心肌病(DCM)患者的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并利用噬菌体表面显示技术,以人β1肾上腺素受体细胞外第二环26肽(β1-ARECⅡ)为抗原肽,对此抗体库进行淘筛富集.结果成功地构建了库容量为1.4×106的人源性Fab段噬菌体抗体库,从此抗体库中筛选到了特异性抗人β1-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆.结论利用噬菌体抗体库技术可以获得表达抗人β1-AR抗体的重组克隆.     

血小板无力症与GPⅡb-Ⅲa分子缺陷

血小板膜糖蛋白GPⅡb-Ⅲa复合物是在血小板粘附聚集过程中起重要作用的粘附分子受体,能结合纤维蛋白原、VWF等多种粘附蛋白.GPⅡb-Ⅲa质或量的缺陷导致血小板无力症,根据GPⅡb-Ⅲa缺陷程度分为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型,临床表现为出血时间延长,聚集反应明显减弱.GPⅡb-Ⅲa的研究已进入分子水平,对其发病机制也有较深的了解.     

复发性流产患者HLA及血小板特异性糖蛋白抗体GPⅡb/Ⅲa表达的初步研究

目的:探讨原因不明复发性流产(RSA)患者HLA抗体和血小板特异性糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)抗体的表达情况。方法:对299名复发性流产的患者血浆中HLA抗体和GPⅡb/Ⅲa抗体进行检测,血小板抗体检测试剂盒(固相凝集法)筛查IgG抗体,Antigen Tray-LATM板检测HLA抗体,GTI公司PAK-PLUS检测试剂盒检测血小板特异性抗体,利用流式细胞仪技术进行GPⅡb/Ⅲa抗体的确证。结果:检测的299例RSA患者中,IgG抗体阳性26例,阳性率8.69%。26例IgG抗体阳性患者中,25例HLA抗体呈阳性。HLA-Ⅰ类抗体阳性占5.02%,HLA-Ⅱ类抗体阳性占1.33%,HLA-Ⅰ+Ⅱ类抗体阳性占2.01%;在26例RSA患者中,GPⅡb/Ⅲa抗体阳性4例(占15.38%),其中GPⅡb/Ⅲa阳性和HLA抗体均阳性3例(占11.54%),GPⅡb/Ⅲa抗体单独阳性1例(占3.85%)。结论:初步探讨了RSA患者HLA抗体和GPⅡb/Ⅲa抗体的分布情况,本研究为复发性流产患者血小板抗体的检测提供了初步的实验基础。     

胰淀素Fab抗体的筛选及初步鉴定

目的:从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选胰淀素(amylin又称为胰岛淀粉样多肽)Fab抗体,测定其特异性及抗原结合活性.方法:以胰淀素为抗原,对抗体库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选;将从人源噬菌体抗体库中筛选出的阳性克隆,提取其质粒、切除gⅢ、自身环化并转入大肠杆菌中,以IPTG诱导表达可溶性抗体,最后用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定抗原结合活性和特异性.结果:成功筛选并表达了抗胰淀素的可溶性Fab抗体,经SDS-PAGE蛋白电泳,在相对分子质量约为47 kD处可见一蛋白条带.ELISA和Western blot证实了该Fab片段与胰淀素抗原的结合活性和特异性.结论:利用噬菌体抗体库技术获得了人源性的特异抗胰淀素Fab抗体,为临床进行下一步研究奠定了基础.     

假性血小板减少症分析前的质量控制

假性血小板减少症（pseudothrombocytopenia,PTCP）是由于在EDTA（枸橼酸盐、肝素等）作为抗凝剂的前提下出现的免疫介导的血液中冷抗血小板自身抗体,使血小板互相聚集现象,这种EDTA依赖的冷抗血小板自身抗体直接作用于血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa上,同时,这种与血小板结合的自身抗体Fc端可与单核细胞或淋巴细胞膜上Fc受体结合,